Protocol
Bruken av rotter for forskning var i samsvar med retningslinjer fastsatt av Animal Welfare Committee of The University of Tokyo.
1.Preparation av plasmid-DNA
- Generer DNA-plasmider for in vivo elektroporering ved subkloning av cDNA eller shRNA-sekvensen inn i et plasmid for ekspresjon i pattedyrceller 12. Bruk en cytomegalovirus øyeblikkelig tidlig enhancer og kylling β-aktin promoter fusjon (CAG) promoter-drevet plasmid 13 fordi det gir sterk og stabil uttrykk. For uttrykk for shRNAs under kontroll av en CAG promoter, bruk en mir30 basert shRNA kassett system for subkloning av shRNA 14.
- Rense plasmid-DNA med et maksi-prep kit ifølge produsentens instruksjoner, og resuspender DNA med HEPES-bufret saltløsning (140 mM NaCl, 0,75 mM Na HPO 2 til 4, 25 mM HEPES; pH 7,40). Juster konsentrasjonen av DNA til ≥4 ug / ul.
2. Sterilisering av kirurgiske instrumenter og Saline
- Autoklav for kirurgiske instrumenter og 0,9% NaCl-oppløsning.
3. Utarbeidelse av Glass Mikropipette
- Trekk glass pipetter ved hjelp av en pipette avtrekker. Kutte spissen av pipetten til en diameter på 30-50 um. Bruk følgende parametre: Varme, 600; Velocity, 50; Time, 75.
4. Animal Surgery, Injection DNA og Electroporation
Merk: En overUt fra dette trinnet er beskrevet i figur 1. Selv om fremgangsmåten for rotteunger er beskrevet her, idet fremgangsmåten er også anvendelig til mer modne dyr ved hjelp av den samme prosedyre.
- Bedøve rotte med isofluran i induksjonsfeltet helt til dyret blir immobile ved å justere oksygenstrømmen til 0,4 l / min, og isofluran konsentrasjonen til 4% (vol / vol). Utfør tå knipe for å bekrefte riktig anesthetization.
- Sett rotte på forvarmet varmere under en kikkert mikroskop, og opprettholde anestesi ved kontinuerlig administrasjon isofluran gjennom ansiktsmaske. Juster oksygenstrømmen til 0,2 l / min, og isofluran konsentrasjon til 2% (vol / vol). Bruk øyedråper for å hindre tørrhet i øyne dersom øynene på dyret er åpne.
- Fest bena med kirurgisk tape.
- Rengjør huden på baksiden av låret med povidon-jod, og gjør et snitt med en skalpell.
Merk: Shave kirurgiske områder hvis de kirurgiske områder er dekket med hluft. - Expose isjiasnerven ved å lage en åpning mellom quadriceps femoris muskler og biceps femoris muskler med synåler.
- Fukt nerve med 0,9% NaCl-oppløsning. Absorbere overflødig vann med lofri papir.
- Sett bunnen av en glass mikropipette på det fleksible røret, og fylle det tilstrekkelig mengde av DNA-oppløsningen (i det minste én mikroliter) til mikropipette ved forsiktig å aspirere.
- Løft eksponert nerve ved å forsiktig dra den distale siden av nerve ved hjelp av en nål.
Merk: Ikke bruk spenning til nerve å minimere mekanisk stress. - Sett glasset mikropipette inn i det distale området på nerve, og injisere DNA-oppløsningen ved å påføre trykk (dvs. ved å blåse inn i den åpne ende av det fleksible rør). Injiser DNA-oppløsning inntil nerve vises grønn (1 ul maksimum). Fordi hyppig innsetting av mikropipette kan skade nerve, må du ikke sette mikropipette mer enn to ganger.
- Plasser en TWEezer-type platina elektrode ca 1-2 mm fra nerven. Fylle gapet mellom elektroden og det nerve med 0,9% NaCl-oppløsning.
Merk: Ikke hold nerve med elektroden for å unngå mekanisk stress på nerve. - Påfør elektriske pulser til injeksjonsstedet ved hjelp av en electroporator med elektroden. Etter den første pulsen sett, snu elektroden og bruke en annen puls sett. Bruk følgende parametere: spenning, 50 V; puls varighet, 5 ms; puls intervall, 100 ms; puls nummer, 4 ganger.
- Rengjør electroporation stedet med 0,9% NaCl-løsning.
- Gjenta trinn 04.04 til 04.11 på den kontralaterale hoftenervene.
5. Post-electroporation
- Lukk snittene med cyanoakrylatlim.
- Etter tørking av lim, rense såret med povidon-jod.
- Slipp valpen fra ansiktsmaske. Varm valpen på en varmere i hvert fall for en time for å tillate det å fullt igjen fra anestesi. Do ikke la valpen uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet.
- Etter utvinning fra anestesi, tilbake valpen til moren rotte. Ikke gå tilbake valpen til den er helt restituert.
6. Post-kirurgi
- Hus på rotteunger i buret inntil gjennomføre forsøkene 11 (se eksempler i figur 3). Administrere karprofen (5 mg / kg, ip), et ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel, eller buprenorfin (0,1 mg / kg, sc), et opioid smertestillende middel, om nødvendig.
Merk: Hvis rotta valpen ikke vokser godt eller betennelse er observert rundt operasjonen området, utelukker dyret fra forsøkene.
Representative Results
Et eksempel på en hoftenervene transfektert med rødt fluorescerende protein (RFP) -expressing plasmid er vist i figur 2A. Celler som viser bipolar morfologi, karakteristisk for SC'er ble tynt transfektert med RFP. Ingen RFP fluorescens ble påvist i aksoner. Vi finner vanligvis ~ 100 transfekterte SC'er i hver nerve. Dette transfeksjonseffektivitet synes lik den in vivo SC infeksjon effektivitet ved hjelp av lentivirale vektorer 4.
Immunfarging forsøk viste at de fleste (~ 96%) RFP-positive celler ved P7 ko-merket for S100, en SC markør (figur 2B), og 91% av RFP-positive celler ved P14 co-merket for MBP, et myelinerende SC markør (figur 2C), hvilket antyder at genoverføring ved elektroporering er sterkt selektiv for myelinerende SC'er.
Innføring av flere gener i SC'er
I gnagere, myelination starter rundt fødselen, dramatisk øke i løpet av de to første ukene etter fødselen, og deretter gradvis avtar. Således, ved genetisk manipulering SC'er løpet av disse utviklingstidsvinduene, mekanismene bak disse forskjellige stadier av myelination kan avklares. Lentiviral vektorer er et godt verktøy for ennalyzing myelination, særlig når de har minimal giftighet, men lentiviruses bare infisere neonatal sciatic nervene 5,6. Til sammenligning virker elektroporasjon-mediert genoverføring godt når transfeksjon utføres på P3 (figur 2E, øverst) eller P14 (figur 2E, nederst).
Programmene i romanen in vivo elektroporeringsmetoden er beskrevet her. Figur 3A viser lette mikroskopiske bilder av GFP-uttrykke myelinerende SC'er på ulike utviklingsstadier (P7, P14, P21 og P31). Ved lys mikroskopisk analyse, endringer i morfologiske parametere, slik som lengde og diameter, kan vurderes. Merk at disse parameterne har samme verdier sammenlignet med inntakt rotte perifere nerver 15,16, noe som tyder på at de elektroporerte nervene utvikle seg uten signifikante skadelige effekter. Figur 3B viser et elektronmikroskopbilde av LacZ-EXPREssing myelinerende SC'er. I dette tilfelle ble LacZ benyttet som et uttrykk markør. β-galaktosidase-farging ved hjelp av Bluo-gal, en etanol-uoppløselig substrat, muliggjør analyse av myelin struktur av transfekterte SC'er ved elektronmikroskopi 11,17. I disse eksperimentene kan rollen som signalmolekyler undersøkes ved stanse eller forsterke deres ekspresjon, for derved å tillate analyse av tap-av-funksjon eller få-av-funksjon effekter. I tillegg til analyse av faste vev, kan in vivo elektroporering-mediert genoverføring kan også anvendes til å leve bildebehandling eksperimenter. For eksempel viser figur 3C en myelinerende SC ko-uttrykker G-GECO1.1 18, en grønn fluorescerende cytosoliske Ca 2+ indikator, og R-GECO1mt 19, et rødt fluorescerende mitokondrielle Ca 2+ indikator. Ved å uttrykke disse indikatorene, identifiserte vi en signalveien som styrer cytosoliske og mitokondrielle Ca 2+ konsentrasjoner i myelinerende SC'er . Således kan foreliggende fremgangsmåte brukes til å undersøke en rekke signaleringsmekanismer, særlig ved genetisk kodede fluorescerende prober er tilgjengelige for å detektere signalene av interesse.
Fig. 1: Skjematisk av i n vivo elektroporeringsmetoden Først isjiasnerven hos en bedøvet rotte utsettes for. For det andre, blir plasmid-DNA injiseres i isjiasnerven. Tredje, elektriske pulser leveres til injeksjonsstedet gjennom tang-formet elektroden. Til slutt blir såret lukkes med lim. Denne prosedyren kan gjentas på motsatt nerve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative Resultater på Transfekterte sciatic nervene (A) En representant bilde av en transfektert isjiasnerven.. Den nerve ble transfektert med RFP-uttrykke plasmid på P3, og fast på P7. (B) Et representativt bilde av en RFP-transfekterte celle ved P7 viser colocalization med S100, en SC markør. (C) Et representativt bilde av en RFP-transfekterte isjiasnerven ved P14 viser colocalization med MBP, et myelinerende SC markør. (D) En representant bilde av en hoftenervene transfektert med GFP og RFP-uttrykke plasmider. Transfekterte SC'er samtidig uttrykt GFP og RFP. (E) Et bilde av myelinerende SC'er på P31 transfekterte på P3, når myelination begynner (øverst), og et bilde av myelinerende SC'er på P31 transfektert ved P14, når de fleste store axoner bli myelinated (nederst), noe som tyder på at transfection av myelinerende SC'er kan oppnås ikke bare i neonatal nerver, men også i mer modne nerver. Skala barer = 200 um (A); 50 mikrometer (BE). Dette tallet ble endret fra forrige publisering 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Anvendelse av in vivo Elektroporering (A) En lys mikroskopisk analyse av utviklingen av myelinerende SC'er.. Sciatic nervene ble electroporated med GFP-uttrykke plasmid på P3, og ble løst på ulike utviklingsstadier (P7, P14, P21 og P31). Representative bilder av GFP-positive SC'er vises til venstre. Den gjennomsnittlige lengde og diameter er oppsummert som gjennomsnitt ± SEM (n = 30-47 fra 3 nerver) til høyre. Lengden og diameteren myelinerende SpA øker som utvikling fortsetter. (B) En elektronmikroskopbilde av en hoftenervene transfektert med et plasmid som koder for LacZ. En transfektert SC (hvit stjerne, venstre) ble fint merket med utfellinger av β-galaktosidase reaksjonsprodukt. (C) Et bilde av en SC kotransfektert med G-GECO1.1, en grønn fluorescerende cytosoliske Ca 2+ indikator, og R-GECO1mt, et rødt fluorescerende mitokondriell Ca 2+ indikator. Regionene innenfor de hvite stiplede rektangler vises forstørret i panelene på høyre side. Skala barer = 50 um (A og C); 1 pm (b). Dette tallet ble endret fra forrige publisering 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
- Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
- Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
- Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
- Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
- Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
- Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
- Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
- Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
- Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
- Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
- Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
- Tanaka, Y., Hirokawa, N.
