Protocol
O uso de ratos para a investigação estava em conformidade com as orientações estabelecidas pelo Comitê da Universidade de Tóquio Animal Welfare.
1.Preparation de DNA de plasmídeo
- Gerar os plasmídeos de ADN para electroporação in vivo por subclonagem do ADNc ou sequência de shRNA em um plasmídeo de expressão para células de mamífero 12. Usar um citomegalovírus precoce imediato intensificadoras e de frango β-actina promotor de fusão (CAG) plasmídeo conduzido pelo promotor 13 porque permite a expressão forte e estável. Para a expressão de shRNAs sob o controlo de um promotor CAG, usar um sistema de cassete shRNA baseada mir30 para subclonagem a 14 shRNA.
- Purifica-se DNA de plasmídeo com um kit Maxi-prep de acordo com as instruções do fabricante, e ressuspender o ADN com solução salina tamponada com HEPES (NaCl 140 mM, 0,75 mM de Na 2 HPO 4, 25 mM de HEPES, pH 7,40). Ajustar a concentração de ADN para ≥4 ug / uL.
2. A esterilização de instrumentos cirúrgicos e Saline
- instrumentos cirúrgicos autoclave e a solução de NaCl a 0,9%.
3. Preparação da micropipeta de vidro
- Puxe pipetas de vidro usando um extrator pipeta. Cortar a ponta da pipeta para um diâmetro de 30-50 ^ m. Utilize os seguintes parâmetros: calor, 600; Velocidade, 50; Tempo, 75.
4. Cirurgia animal, Injecção de ADN e electroporação
Nota: Um excessoFace a esta etapa é descrita na Figura 1. Embora o procedimento de crias de ratos são descritos aqui, o método também é aplicável a animais mais maduros, utilizando o mesmo procedimento.
- Anestesiar ratos com isoflurano na caixa de indução até que o animal torna-se imóvel, ajustando o fluxo de oxigénio para 0,4 L / min e a concentração de isoflurano a 4% (vol / vol). Execute toe beliscar para confirmar anesthetization adequada.
- Colocar o rato sobre o aquecedor pré-aquecido sob um microscópio binocular e manter a anestesia por administração de isoflurano continuamente através da máscara facial. Ajustar o fluxo de oxigénio para 0,2 L / min e a concentração de isoflurano a 2% (vol / vol). Use colírios para evitar a secura dos olhos, se os olhos do animal estão abertas.
- Fixar as pernas com fita cirúrgica.
- Limpar a pele na parte posterior da coxa com povidona-iodo, e fazer uma incisão com um bisturi.
Nota: Raspar áreas cirúrgicas se as áreas cirúrgicas são cobertas com har. - Expor o nervo ciático, criando uma abertura entre os músculo quadríceps femoral e músculo bíceps femoral com agulhas de costura.
- Molhar o nervo com uma solução de NaCl a 0,9%. Absorver o excesso de água com papel sem fiapos.
- Inserir a base de uma micropipeta de vidro na tubagem flexível, e preencher a quantidade adequada de solução de ADN (pelo menos um microlitro) na micropipeta, aspirando suavemente.
- Levantar o nervo exposto puxando suavemente o lado distal do nervo usando uma agulha.
Nota: Não aplicar tensão no nervo para minimizar o stress mecânico. - Inserir a micropipeta de vidro no local distai do nervo, e injectar a solução de DNA através da aplicação de pressão (isto é, por sopro para dentro da extremidade aberta do tubo flexível). Injectar a solução de DNA até o nervo aparece verde (máximo de 1 ml). Porque inserção frequente da micropipeta pode danificar o nervo, não insira o micropipeta mais de duas vezes.
- Coloque uma TWEezer tipo eletrodo de platina cerca de 1-2 mm do nervo. Preencher a lacuna entre o eletrodo e o nervo com uma solução de NaCl a 0,9%.
Nota: Não segure o nervo com o eletrodo para evitar estresse mecânico sobre o nervo. - Aplicar impulsos eléctricos para o local da injecção usando um electroporador com o eléctrodo. Após o primeiro conjunto de pulso, inverter o eletrodo e aplicar outro conjunto de pulso. Utilize os seguintes parâmetros: tensão, 50 V; duração do pulso, 5 ms; intervalo de pulso, a 100 ms; número de pulsos, 4 vezes.
- Limpar o local de electroporação com uma solução de NaCl a 0,9%.
- Repita os passos 4,4-4,11 sobre o nervo ciático contralateral.
5. Pós-eletroporação
- Fechar as incisões com cola de cianoacrilato.
- Após a secagem da cola, limpar a ferida com povidona-iodo.
- Solte o filhote de cachorro da máscara facial. Aqueça o filhote em um mais quente, pelo menos durante uma hora, a fim de permitir que ele se recuperar totalmente da anestesia. Do não deixar o cachorro sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente.
- Após a recuperação da anestesia, devolver o cachorro para o rato mãe. Não devolva o filhote até que esteja totalmente recuperado.
6. Pós-cirurgia
- Casa os filhotes de ratos na gaiola até a realização dos experimentos 11 (ver exemplos na Figura 3). Administrar carprofeno (5 mg / kg; ip), uma droga não-esteróide anti-inflamatório, ou buprenorfina (0,1 mg / kg, sc), um analgésico opióide, se necessário.
Nota: Se o filhote de rato não cresce bem ou inflamação é observado ao redor do local da cirurgia, excluir o animal a partir dos experimentos.
Representative Results
Um exemplo de um nervo ciático transfectada com proteína fluorescente vermelha (RFP) -expressing plasmídeo é mostrada na Figura 2A. As células que mostram morfologia bipolar, uma característica de SCs, foram escassamente transfectadas com RFP. Nenhuma fluorescência RFP foi detectado em axónios. Normalmente encontramos ~ 100 SCs transfectadas em cada nervo. Esta eficiência de transfecção parece semelhante à in vivo SC eficiência de infecção utilizando vectores lentivirais 4.
Experimentos imunocoloração mostrou que a maioria (~ 96%) as células RFP-positivo em P7 co-marcadas durante S100, um marcador SC (Figura 2B), e 91% de células RFP-positivo em P14 co-marcadas durante MBP, um marcador mielinizantes SC (Figura 2C), o que sugere que a transferência genética através de electroporação é altamente selectivo para myelinating SCs.
A introdução de genes em múltiplas SCs
Em roedores, a mielinização inicia em torno do nascimento, aumentando dramaticamente durante as primeiras duas semanas após o parto, e depois diminui gradualmente. Assim, manipulando geneticamente SCs durante essas janelas de tempo de desenvolvimento, os mecanismos subjacentes a estas diferentes fases de mielinização pode ser esclarecida. lentivirais são uma boa ferramenta para umnalyzing mielinização, especialmente como eles têm uma toxicidade mínima, mas lentivírus única infectar neonatal nervo ciático 5,6. Em comparação, a transferência de genes mediada por electroporação funciona bem quando a transfecção é realizada na P3 (Figura 2E, topo) ou em P14 (Figura 2E, parte inferior).
As aplicações do novo método em electroporação in vivo são descritos aqui. A Figura 3A mostra que as imagens ao microscópio óptico de GFP-expressando myelinating SCs em várias fases do desenvolvimento (P7, P14, P21 e P31). Por análise microscópica de luz, alterações nos parâmetros morfológicos, tais como comprimento e diâmetro, pode ser avaliado. Note-se que estes parâmetros têm valores semelhantes em comparação com ratos intactos 15,16 nervos periféricos, o que sugere que os nervos electroporadas desenvolver, sem efeitos prejudiciais significativos. A Figura 3B mostra uma imagem microscópica de electrões de LacZ-expressing myelinating SCs. Neste caso, LacZ foi utilizada como um marcador de expressão. β-galactosidase coloração utilizando Bluo-gal, um substrato insolúvel em etanol, possibilita a análise da estrutura de mielina de SCs transfectadas por microscopia eletrônica 11,17. Nestas experiências, o papel de moléculas de sinalização pode ser examinado por silenciamento ou aumentando a sua expressão, permitindo assim a análise da perda de função ou efeitos de ganho de função. Para além da análise de tecido fixo, in vivo, transferência de genes mediada por electroporação pode ser também aplicado a viver experiências de imagiologia. Por exemplo, a Figura 3C mostra uma mielinizantes SC co-expressando G-GECO1.1 18, um indicador verde fluorescente citosólica de Ca2 +, e R-GECO1mt 19, um indicador vermelho fluorescente Ca2 + mitocondrial. Ao expressar estes indicadores, identificamos uma via de sinalização que controla citosólica e mitocondrial de Ca2 + concentrações em myelinating SCs . Assim, o presente método pode ser usado para estudar uma variedade de mecanismos de sinalização, especialmente quando as sondas fluorescentes geneticamente codificados estão disponíveis para detectar os sinais de interesse.
Figura 1:. Esquemática do i n vivo A electroporação Método Em primeiro lugar, o nervo ciático do rato anestesiado é exposta. Em segundo lugar, o ADN de plasmídeo é injectado no nervo ciático. Terceiro, os impulsos eléctricos são entregues no local da injecção, através do eléctrodo de uma pinça em forma de. Finalmente, a ferida é fechada com cola. Este procedimento pode ser repetido sobre o nervo contralateral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos sobre nervos ciáticos transfectadas (A) uma imagem representativa de um nervo ciático transfectadas.. O nervo foi transfectada com o plasmídeo que expressa RFP no P3, e fixado em P7. (B) uma imagem representativa de uma célula transfectada-RFP em P7 mostrando uma co-localização com S100, um marcador SC. (C) uma imagem representativa de um nervo ciático transfectada-RFP no P14 mostrando uma co-localização com MBP, um marcador mielinizantes SC. (D) A imagem representativa de um nervo ciático cotransfectadas com GFP e plasmídeos que expressam RFP. SCs transfectadas expressaram simultaneamente GFP e RFP. (E) Uma imagem de myelinating SCs no P31 transfectadas em P3, quando mielinização começa (em cima), e uma imagem de SCs myelinating no P31 transfectadas a P14, quando a maioria das grandes axônios se tornar mielinizado (parte inferior), sugerindo que a transfec ç ã o das SC myelinating pode ser conseguida não só em nervos neonatal, mas também em nervos mais maduros. Barras de escala = 200 uM (A); 50 mm (BE). Este valor foi modificado a partir de nossa publicação anterior 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aplicação de electroporação in vivo (a) uma análise microscópica de luz do desenvolvimento de myelinating SCs.. Os nervos ciáticos foram electroporadas com o plasmídeo que expressa GFP em P3, e foram fixados em vários estágios de desenvolvimento (P7, P14, P21 e P31). Imagens representativas de CT-GFP positivo estão apresentados à esquerda. A duração média e o diâmetro estão resumidos como média ± EPM (n = 30-47 de 3 nervos) no lado direito. O comprimento e diâmetro do myelinating SCs aumenta à medida que prossegue o desenvolvimento. (B) uma imagem de microscopia electrónica de um nervo ciático transfectadas com um plasmídeo que codifica para LacZ. Um transf SC (asterisco branco, à esquerda) foi finamente marcado com precipitados do produto da reacção de β-galactosidase. (C) Uma imagem de um SC cotransfectadas com G-GECO1.1, um indicador verde fluorescente citosólica de Ca2 +, e R-GECO1mt, um indicador vermelho fluorescente mitocondrial de Ca2 +. As regiões dentro dos retângulos pontilhadas brancas são mostrados ampliada nos painéis à direita. Barras de escala = 50 uM (A e C); 1 | iM (B). Este valor foi modificado a partir de nossa publicação anterior 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
- Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
- Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
- Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
- Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
- Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
- Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
- Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
- Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
- Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
- Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
- Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
- Tanaka, Y., Hirokawa, N. Mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease. Trends Genet. 18, S39-S44 (2002).
