Protocol
研究利用老鼠是按照由东京大学的动物福利委员会制定的准则。
质粒DNA的1.Preparation
- 由亚克隆的cDNA或shRNA序列插入用于哺乳动物细胞12的表达质粒产生用于体内电穿孔的DNA质粒。使用巨细胞病毒立即早期增强和鸡β肌动蛋白启动子融合（CAG）启动子驱动的质粒13，因为它允许强大和稳定的表现。要CAG启动子的控制下的shRNA的表达，使用基于mir30-shRNA的盒系统，用于亚克隆shRNA的14。
- 纯化的质粒DNA使用根据制造商的说明加厚-prep试剂盒，和重悬带的HEPES缓冲盐水（140mM的氯化钠，0.75毫的 Na 2 HPO 4，25mM的HEPES; pH值7.40）的DNA。调节DNA的浓度为≥4微克/微升。
2，手术器械和盐水消毒
- 高压釜的手术器械和0.9％NaCl溶液。
3.玻璃微的制备
- 拉用吸管牵拉玻璃吸管。切移液器的尖端的直径为30-50微米。使用以下参数：热火，600;速度，50;时间，75。
4.动物外科手术，DNA注射和电
注：以上鉴于这一步骤的图1中描述。虽然幼鼠的程序在这里描述的，该方法也适用于用同样的步骤比较成熟的动物。
- 麻醉用异氟烷大鼠中诱导框直到动物变成通过调节氧气流至0.4升/分和异氟醚浓度为4％（体积/体积）不动。执行脚趾捏，确认正确的麻醉。
- 把大鼠上的预热加热器双目显微镜下，并通过经由面罩连续施用异氟烷维持麻醉。调节氧气流至0.2升/分和异氟醚浓度为2％（体积/体积）。使用眼药水防止眼睛干涩，如果动物的眼睛是睁开的。
- 修复手术胶带腿。
- 清洁与碘伏后大腿的皮肤，使用手术刀切开。
注意：如果手术区域覆盖用H刮手术领域空气。 - 通过创建股四头肌之间的开口了大腿肌肉和股二头肌与缝纫针暴露坐骨神经。
- 湿用0.9％的NaCl溶液中的神经。吸收多余的水用不起毛的纸。
- 插入玻璃微量的基部到柔性管，并且通过轻轻吸填充的DNA溶液（至少一个微升）到微量的足够量。
- 通过轻轻拉动使用针神经的前端侧抬起的露出神经。
注意：不要施加张力的神经，以尽量减少机械应力。 - 将玻璃微插入神经 的末端位置，并注入通过施加压力将DNA溶液（由吹入软管的开口端即 ）。直到神经显示为绿色（1微升最大）注射DNA溶液。因为微量的频繁插入可能损伤神经，不要插入微量的两倍以上。
- 放置TWE察型铂电极约1-2毫米除了神经。填充电极和用0.9％NaCl溶液的神经之间的差距。
注意：不要用电极保持神经，以避免对神经的机械应力。 - 应用电脉冲来使用与所述电极的电穿孔注射部位。第一个脉冲集后，反转电极和应用其他脉冲集。使用下面的参数：电压，50伏;脉冲持续时间，5毫秒;脉冲间隔100毫秒;脉冲数的4倍。
- 清理电穿孔部位用0.9％NaCl溶液。
- 重复步骤4.4-4.11对侧坐骨神经。
5.后电
- 关闭与氰基丙烯酸酯胶的切口。
- 干燥涂胶后，请用碘伏伤口。
- 松开从面罩的小狗。暖小狗上至少一个小时一个温暖的，以便允许它完全从麻醉中恢复。 ðO不可离开小狗无人看管，直到它已经恢复了足够的意识。
- 从麻醉中苏醒后，返回小狗母亲老鼠。不要返回小狗，直到完全康复。
6.后手术
- 众议院幼鼠在笼子里，直到进行实验11（ 见图3的例子）。辖卡布洛芬（5mg / kg的; IP），非甾体抗炎药，或叔丁啡（0.1毫克/千克，SC），阿片类镇痛剂，如果需要的话。
注意：如果大鼠小狗不生长良好或炎症围绕手术部位观察到的，排除在实验动物。
Representative Results
用红色荧光蛋白（RFP）转染的坐骨神经-expressing质粒的一个例子示于图2A。细胞呈现两极形态，旺的特征，分别用稀少转RFP。在轴突中没有检测到RFP的荧光。我们通常会发现〜每一根神经100转旺。这种转染效率似乎类似于使用慢病毒载体4 的体内的SC感染效率。
免疫染色实验表明，大多数（〜96％）RFP阳性细胞在P7共标记为S100中，一个SC标记（ 图2B），和标记的共同为MBP在P14 RFP阳性细胞91％，一髓鞘形成SC标记（ 图2C），这表明通过电穿孔该基因转移为脱髓鞘旺高度选择性。
多个基因的导入旺
在啮齿类动物中，髓鞘开始围绕生育，出生后的头两个星期期间急剧增加，然后逐渐减少。因此，通过在这些发育时间窗遗传操纵旺，髓鞘的这些不同阶段所依据的机制可以澄清。慢病毒载体是一个好工具nalyzing髓鞘化，尤其是因为他们有毒性最小，但慢病毒只感染新生儿坐骨神经5,6。相比之下，当转染在P3（ 图2E，顶部）或P14（ 图2E，底部）进行电穿孔介导的基因转移效果很好。
体内电穿孔法新颖的应用说明如下。 图3A显示绿色荧光蛋白表达在不同发育阶段（P7，P14，P21和P31）髓鞘的SC光显微图像。通过光学显微镜分析，形态参数，如长度和直径的变化，可以进行评估。注意，相比于完整的大鼠末梢神经15,16，这些参数具有相似的值，这表明电神经发展而不显著破坏作用。 图3B示出的LacZ-expre的电子显微镜图像ssing脱髓鞘旺。在这种情况下，LacZ基因被用作表达标记。 β半乳糖苷酶使用bluo加仑，不溶性乙醇基板，染色使得能够通过电子显微镜11,17的转染的SC的髓鞘结构的分析。在这些实验中，信号分子的作用，可通过沉默或增加它们的表达，由此允许失功能或获得性功能的影响的分析进行检测。除了 固定的组织的分析， 在体内电介导的基因转移也可以应用于实时成像实验。例如， 图3C示出了髓鞘形成的SC共表达的G-GECO1.1 18，绿色荧光细胞内的Ca 2+指示剂，和R-GECO1mt 19，红色荧光线粒体的 Ca 2+指示剂。通过表达这些指标，我们确定，其控制在髓鞘形成雪旺细胞溶质和线粒体的 Ca 2+浓度信号通路 。因此，本方法可用于研究各种信令机制，特别是当遗传编码荧光探针可用于检测感兴趣的信号。
图 1： 在 I N体内 电穿孔法首先，将麻醉大鼠的坐骨神经示意图露出。第二，质粒DNA注射到坐骨神经。第三，电脉冲通过镊子状电极递送到注射部位。最后，将伤口闭合用胶水。这个程序可以在对侧的神经被重复。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 转染坐骨神经代表性的成果 （A）转染坐骨神经的形象代表。神经在P3与RFP表达质粒转染，并固定在P7。 （B）在P7显示与S100，一个SC标志共存一个RFP转染的细胞的形象代表。 （C）的一名代表在P14一个RFP转坐骨神经显示与MBP，髓鞘形成一个标记SC的共存形象。 （D）与GFP和RFP表达质粒转染坐骨神经的形象代表。转旺同时表达GFP和RFP。 （E）的脱髓鞘在P31在P3中，髓鞘形成开始时（顶）转染的SC的图像，并在P31在P14中，当最大量的轴突成为髓鞘（底部）转染的髓鞘的SC的图像，这表明TRANSF髓鞘形成雪旺挠度不仅可以在新生儿神经，而且在更成熟的神经来实现。比例尺= 200微米（A）;为50μm（BE）。这个数字是从我们以前的出版物11修改。 请点击此处查看本图的放大版本。
图 3： 在体内 电 （A）髓鞘种姓发展的光学显微分析中的应用 。坐骨神经与P3表达GFP的质粒电穿孔，和分别固定在各个发育阶段（P7，P14，P21和P31）。 GFP阳性的SC的代表图像显示在左侧。平均长度和直径总结为平均±SEM（n = 3的0 - 47从右侧3神经）。髓鞘旺随着开发收益的长度和直径。 （B）用质粒编码的LacZ转染的坐骨神经的电子显微镜图像。转染的SC（白星号，左）微细地与β半乳糖苷酶的反应产物的沉淀物进行标记。 （C）和G-GECO1.1，绿色荧光细胞内的Ca 2+指示剂，和R-GECO1mt，红色荧光线粒体的 Ca 2+指示剂共转染的一个SC的图像。白色虚线矩形内的区域放大显示在右边的面板。比例尺= 50微米（A和C）;为1μm（B）。这个数字是从我们以前的出版物11修改。 请点击此处查看本图的放大版本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
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