Protocol
Het gebruik van ratten voor onderzoek in overeenstemming was met de door de Animal Welfare Committee van de Universiteit van Tokyo richtlijnen.
1.Voorbereiding van plasmide DNA
- Genereren DNA plasmiden in vivo elektroporatie door subkloneren van het cDNA of shRNA sequentie in een expressieplasmide voor zoogdiercellen 12. Gebruik een cytomegalovirus directe vroege enhancer en kip β-actine promoter-fusie (CAG)-promoter gedreven plasmide 13 omdat hierdoor sterke en stabiele expressie. Voor expressie van shRNAs onder de controle van een promotor CAG, gebruik een mir30 gebaseerde shRNA cassettesysteem voor het subkloneren shRNA 14.
- Zuiver plasmide DNA met een maxi-prep kit volgens instructies van de fabrikant en resuspendeer de DNA met HEPES-gebufferde zoutoplossing (140 mM NaCl, 0,75 mM Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7,40). Dient de concentratie van DNA ug / ul ≥ 4.
2. Sterilisatie van chirurgische instrumenten en Saline
- Autoclaaf chirurgische instrumenten en het 0,9% NaCl-oplossing.
3. Voorbereiding van de Glass Micropipet
- Trek glazen pipetten met een pipet trekker. Snijd de punt van de pipet tot een diameter van 30-50 urn. Gebruik de volgende parameters: Warmte, 600; Velocity, 50; Tijd, 75.
4. Animal Chirurgie, DNA-injectie en elektroporatie
Opmerking: Een overGezien deze stap is beschreven in figuur 1. Hoewel de wijze van rat pups hier beschreven methode ook voor meer volwassen dieren volgens dezelfde procedure.
- Verdoven de rat met isofluraan in de inductie vak totdat het dier onbeweeglijk door aanpassing van de zuurstoftoevoer naar 0,4 l / min en de isofluraan concentratie 4% (vol / vol) is. Voer teen knijpen om de juiste verdoving te bevestigen.
- Plaats de rat op de voorverwarmde warmer onder een binoculair microscoop, en onderhouden van anesthesie door het continu toedienen van isofluraan door middel van het gezichtsmasker. Stel de zuurstoftoevoer naar 0,2 l / min en de isofluraan concentratie tot 2% (vol / vol). Gebruik oogdruppels om droogheid van de ogen te voorkomen als de ogen van het dier zijn open.
- Bevestig de poten met chirurgische tape.
- Reinig de huid op de dij met povidon-jodium en een insnijding met een scalpel.
Opmerking: Scheer chirurgische gebieden als de chirurgische gebieden zijn bedekt met hlucht. - Expose de heupzenuw door het creëren van een opening tussen de quadriceps femoris en biceps femoris met naalden.
- Bevochtig de zenuw met 0,9% NaCl-oplossing. Absorberen overtollig water met een niet-pluizende papier.
- Stop de van een glazen micropipet op flexibele buis en de juiste hoeveelheid DNA-oplossing (tenminste één microliter) in de micropipet vullen door voorzichtig opzuigen.
- Til de blootgestelde zenuw door zachtjes trekken aan de distale zijde van de zenuw met behulp van een naald.
Opmerking: de spanning niet van toepassing op het lef om mechanische belasting te minimaliseren. - Plaats de glazen micropipet in de distale plaats op de zenuwen en injecteer de DNA-oplossing door druk (door blazen in het open einde van de flexibele buis). Injecteren DNA-oplossing totdat de zenuw verschijnt groene (maximaal 1 pl). Omdat frequente inbrengen van de micropipet de zenuwen kunnen beschadigen, niet plaats de micropipet meer dan twee keer.
- Plaats een TWEezer-type platina-elektrode ongeveer 1-2 mm, afgezien van de zenuw. Vult de spleet tussen de elektrode en de zenuw met 0,9% NaCl-oplossing.
Opmerking: de zenuw niet vast te houden met de elektrode aan mechanische stress op de zenuwen te voorkomen. - Toepassing van elektrische pulsen op de injectieplaats met een electroporator met de elektrode. Na de eerste puls set, keren de elektrode en toe te passen een andere puls set. Gebruik de volgende parameters: spanning, 50 V; pulsduur, 5 msec; puls interval 100 msec; pulsnummer, 4 keer.
- Reinig de elektroporatie plaats met 0,9% NaCl-oplossing.
- Herhaal stap 4,4-4,11 aan de contralaterale heupzenuw.
5. Post-elektroporatie
- Sluit de insnijdingen met cyanoacrylaatlijm.
- Na het drogen van de lijm, het reinigen van de wond met povidonjood.
- Laat de pup uit het gezichtsmasker. Verwarm de pup op een warmere ten minste voor een uur, zodat hij om volledig te herstellen van anesthesie. Do niet de pup onbeheerd achter, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen.
- Na het herstel van de anesthesie, de terugkeer van de pup aan de moeder rat. Laat de pup niet terugkeren tot volledig hersteld.
6. Post-operatie
- Huis rat pups in de kooi tot het uitvoeren van de experimenten 11 (zie voorbeelden in figuur 3). Dien carprofen (5 mg / kg, ip), een niet-steroïdaal anti-inflammatoir geneesmiddel of buprenorfine (0,1 mg / kg, sc), een opioïde analgeticum, indien nodig.
Opmerking: Als de rat pup niet goed groeien of ontsteking wordt waargenomen rond de operatie site, uit te sluiten van het dier uit de experimenten.
Representative Results
Een voorbeeld van een heupzenuw getransfecteerd met rood fluorescent eiwit (RFP) -expressie plasmide wordt getoond in Figuur 2A. Cellen waaruit bipolaire morfologie, een kenmerk van SC's werden getransfecteerd met dun RFP. Nr RFP fluorescentie werd gedetecteerd in axonen. We vinden meestal ~ 100 getransfecteerd SC's in elke zenuw. Deze transfectie-efficiëntie blijkt vergelijkbaar met SC in vivo infectie-efficiëntie via lentivirale vectoren 4.
Immunokleuring experimenten bleek dat de meeste (~ 96%) RFP-positieve cellen bij P7 co-gelabeld voor S100, een SC marker (figuur 2B), en 91% van RFP-positieve cellen bij P14 co-gelabeld voor MBP, een myeliniserende SC marker (Figuur 2C), hetgeen suggereert dat genoverdracht door elektroporatie is zeer selectief voor myeliniserende SC.
Introductie van meerdere genen in SCS
Bij knaagdieren, myelinisering initieert rond de geboorte, een dramatische toename tijdens de eerste twee weken na de geboorte, en vervolgens geleidelijk afneemt. Dus, door het genetisch manipuleren van SC's tijdens deze ontwikkelingsstoornissen tijdvensters, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verschillende stadia van de myelinisatie kan worden verduidelijkt. Lentivirale vectoren zijn een goed hulpmiddel voor eennalyzing myelinisering, met name omdat ze minimale toxiciteit, maar lentivirussen infecteren alleen neonatale heupzenuwen 5,6. In vergelijking, elektroporatie-gemedieerde genoverdracht werkt goed wanneer transfectie wordt uitgevoerd op P3 (figuur 2E, boven) of P14 (figuur 2E, onder).
De toepassingen van de nieuwe werkwijze in vivo elektroporatie zijn beschreven. Figuur 3A toont lichtmicroscopische beelden van GFP-expressie myelinating SC in verschillende ontwikkelingsstadia (P7, P14, P21 en P31). Door lichtmicroscopische analyse veranderingen in morfologische parameters, zoals de lengte en diameter, kunnen worden beoordeeld. Merk op dat deze parameters vergelijkbare waarden vergeleken met intacte rat perifere zenuwen 15,16, wat suggereert dat de geëlektroporeerde zenuwen ontwikkelen zonder significante nadelige effecten. Figuur 3B toont een elektronenmicroscopische afbeelding van LacZ-Expressing myelinating SC. In dit geval werd LacZ als een expressie merker. β-galactosidase kleuring behulp Bluo-gal, ethanol onoplosbare substraat, zodat de analyse van myeline structuur van getransfecteerde SC door elektronenmicroscopie 11,17. In deze experimenten, kan de rol van signaalmoleculen onderzocht door silencing of verhogen van hun expressie, waardoor de analyse van het verlies-van-functie of gain-of-function effecten mogelijk. In aanvulling op de analyse van vaste weefsels, kan in vivo elektroporatie bemiddelde genoverdracht worden toegepast imaging experimenten te leven. Bijvoorbeeld, figuur 3C toont een myeliniserende SC co-expressie G-GECO1.1 18, een groen fluorescerend cytosolische Ca2 + indicator en R-GECO1mt 19, een fluorescerende mitochondriale Ca2 + indicator. Door deze indicatoren uitdrukken, identificeerden we een signaleringsroute die cytosolische en mitochondriale Ca 2+ concentraties regelt in myelinating SCS . Aldus kan de onderhavige werkwijze worden gebruikt om een verscheidenheid van signalerende mechanismen te bestuderen, vooral wanneer genetisch gecodeerde fluorescerende probes zijn beschikbaar om de signalen van belang te detecteren.
Figuur 1:. Schema van de i n vivo elektroporatie methode eerst de heupzenuw van de verdoofde rat wordt blootgesteld. Ten tweede plasmide DNA geïnjecteerd in de heupzenuw. Ten derde, elektrische pulsen worden geleverd aan de injectie via de forceps-vormige elektrode. Tenslotte wordt de wond gesloten met lijm. Deze procedure kan worden herhaald op het contralaterale zenuw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: representatieve resultaten op Getransfecteerde heupzenuwen (A) een representatief beeld van een getransfecteerde heupzenuw.. De zenuw werd getransfecteerd met RFP uitdrukken plasmide P3, en op P7 vast. (B) een representatief beeld van een RFP getransfecteerde cel bij P7 tonen colocalization met S100, een teller SC. (C) een representatief beeld van een RFP getransfecteerd heupzenuw op P14 tonen colocalization met MBP, een myeliniserende SC marker. (D) een representatief beeld van een heupzenuw gecotransfecteerd met GFP en RFP uitdrukken plasmiden. Getransfecteerde SC gelijktijdig uitgedrukt GFP en RFP. (E) Een beeld van myelinating SC op P31 getransfecteerd op P3, als myelinisatie begint (boven), en een beeld van myelinating SC op P31 getransfecteerd op P14, toen de meeste grote axonen worden gemyeliniseerde (onder), wat suggereert dat transfectie van myeliniserende SC's kan worden bereikt niet alleen in neonatale zenuwen, maar ook in meer volwassen zenuwen. Schaalbalken = 200 urn (A); 50 urn (BE). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige publicatie 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Toepassing van in vivo Elektroporatie (A) een lichtmicroscopische analyse van de ontwikkeling van myeliniserende SC.. Sciatic zenuwen werden geëlektroporeerd met GFP tot expressie plasmide P3, en werden vastgesteld in verschillende ontwikkelingsstadia (P7, P14, P21 en P31). Representatieve beelden van GFP-positieve SC worden getoond aan de linkerkant. De gemiddelde lengte en diameter samengevat als gemiddelde ± SEM (n = 30-47 van 3 zenuwen) aan de rechterkant. De lengte en diameter van myeliniserende SC neemt toe naarmate ontwikkeling verloopt. (B) een elektronenmicroscopische afbeelding van een heupzenuw getransfecteerd met een plasmide coderend voor LacZ. Een getransfecteerde SC (witte asterisk, links) werd gemerkt met fijne precipitaten van de β-galactosidase reactieproduct. (C) Een beeld van een SC gecotransfecteerd met G-GECO1.1, een groen fluorescerend cytosolische Ca2 + indicator en R-GECO1mt, een fluorescerende mitochondriale Ca2 + indicator. De regio's binnen de witte stippellijn rechthoeken worden vergroot getoond in de panelen aan de rechterkant. Schaalbalken = 50 urn (A en C); 1 pm (B). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige publicatie 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
- Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
- Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
- Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
- Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
- Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
- Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
- Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
- Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
- Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
- Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
- Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
- Tanaka, Y., Hirokawa, N. Mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease. Trends Genet. 18, S39-S44 (2002).
