Protocol
Användningen av råttor för forskning var i enlighet med de riktlinjer som fastställts av djurskyddskommittén The University of Tokyo.
1.Preparation av plasmid-DNA
- Generera DNA-plasmider för in vivo-elektroporering genom subkloning av cDNA eller shRNA sekvensen i en expressionsplasmid för däggdjursceller 12. Använd en cytomegalovirus omedelbar tidig förstärkare och kyckling β-aktin promotor fusion (CAG) promotor-driven plasmid 13 eftersom det ger en stark och stabil expression. För expression av shRNAs under kontroll av en CAG promotor, använd en mir30 baserat shRNA kassettsystem för subkloning av shRNA 14.
- Rena plasmid-DNA med en maxi-prep kit enligt tillverkarens instruktioner, och resuspendera DNA med HEPES-buffrad saltlösning (140 mM NaCl, 0,75 mM Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7,40). Justera koncentrationen av DNA till ≥4 mikrogram / l.
2. Sterilisering av kirurgiska instrument och saltlösning
- Autoklav kirurgiska instrument och 0,9% NaCl-lösning.
3. Beredning av glasmikropipett
- Dra glaspipetter med hjälp av en pipett avdragare. Skär spetsen på pipetten till en diameter av 30-50 pm. Använd följande parametrar: Värme, 600; Hastighet, 50; Tid, 75.
4. Djur Kirurgi, DNA-injektion och elektroporation
Obs: En överbakgrund av detta steg beskrivs i figur 1. Även om förfarandet för råttungar beskrivs här, varvid förfarandet är också tillämpbar på mer mogna djur med användning av samma förfarande.
- Söva råttan med isofluran i induktionsrutan till dess att djuret blir orörliga genom justering av flödet av syre till 0,4 L / min och isofluran koncentrationen till 4% (vol / vol). Utför tå nypa för att bekräfta korrekt anesthetization.
- Sätt råttan på den förvärmda varmare under ett binokulärt mikroskop och underhålla anestesi genom att kontinuerligt administrera isofluran genom ansiktsmasken. Justera flödet av syre till 0,2 L / min och isofluran koncentrationen till 2% (vol / vol). Använd ögondroppar för att förhindra torrhet i ögonen om ögonen på djuret är öppna.
- Fäst benen med kirurgtejp.
- Rengör huden på bakre låret med povidon-jod, och göra ett snitt med en skalpell.
Obs: Raka kirurgiska områden om de kirurgiska områden täcks med hluft. - Exponera ischiasnerven genom att skapa en öppning mellan lårmuskeln och biceps femoris med synålar.
- Blöt nerv med 0,9% NaCl-lösning. Absorbera överflödigt vatten med luddfritt papper.
- Sätt foten av ett glas mikropipett på flexibel slang, och fyll tillräcklig mängd av DNA-lösning (åtminstone en mikroliter) i mikropipett genom att försiktigt aspirera.
- Lyft den exponerade nerven genom att försiktigt dra den bortre sidan av nerven med hjälp av en nål.
Obs: Använd inte spänning till nerven för att minimera mekanisk påfrestning. - För in glasmikropipett in i den distalt ställe på nerven, och injicera DNA-lösningen genom att anbringa tryck (dvs genom att blåsa in i den öppna änden av det flexibla röret). Injicera DNA-lösning tills nerven visas grönt (1 pl maximum). Eftersom ofta införandet av mikropipett kan skada nerven, inte sätta mikropipett mer än två gånger.
- Placera en TWEEzer-typ platinaelektrod ca 1-2 mm från nerven. Fylla gapet mellan elektroden och nerven med 0,9% NaCl-lösning.
Obs: Håll inte nerven med elektroden för att undvika mekanisk påfrestning på nerven. - Applicera elektriska pulser till injektionsstället med hjälp av en elektroporator med elektroden. Efter den första pulsen set, invertera elektroden och tillämpa en annan puls set. Använd följande parametrar: spänning, 50 V; pulslängd, 5 ms; pulsintervall, 100 ms; pulstalet, 4 gånger.
- Rengör elektroporation stället med 0,9% NaCl-lösning.
- Upprepa steg från 4,4 till 4,11 på den kontraischiasnerven.
5. Post-elektroporering
- Stäng snitt med cyanoakrylatlim.
- Efter torkning av limmet, rengöra såret med povidon-jod.
- Släpp valp från ansiktsmasken. Värm valpen på en varmare åtminstone en timme för att göra det möjligt att återhämta sig helt från anestesi. Do inte lämna valpen utan uppsikt tills den har återfått tillräckligt medvetandet.
- Efter återhämtning från anestesi tillbaka valpen till moder råtta. Inte tillbaka valpen tills återhämtat sig helt.
6. Post-kirurgi
- Hus råttungar i buren tills genomför försöken 11 (se exempel i Figur 3). Administrera karprofen (5 mg / kg, ip), ett icke-steroidalt antiinflammatoriskt läkemedel, eller buprenorfin (0,1 mg / kg, se), ett opioidanalgetikum, om så erfordras.
Obs: Om råttunge inte växer bra eller inflammation observeras runt operationsstället, utesluter djur från experimenten.
Representative Results
Ett exempel på en ischiasnerven transfekterad med rött fluorescerande protein (RFP) -uttryckande plasmid visas i figur 2A. Celler som visar bipolär morfologi, ett kännetecken för SC, var glest transfekterades med RFP. Ingen RFP fluorescens detekterades i axoner. Vi finner oftast ~ 100 transfekterade kaster i varje nerv. Denna transfektion effektivitet verkar liknar in vivo SC infektionseffektivitet med hjälp av lentivirala vektorer 4.
Immunfärgning experiment visade att de flesta (~ 96%) RFP-positiva celler vid P7 co-märkt för S100, en SC-markör (figur 2B), och 91% av RFP-positiva celler vid P14 co-märkt MBP, ett myeliniserande SC markör (Figur 2C), vilket tyder på att genöverföring genom elektroporering är mycket selektiv för myeliniserande SC.
Införande av flera gener i SCS
Hos gnagare, myelination initierar kring födelse, ökar dramatiskt under de första två veckorna efter födelsen, och sedan gradvis minskar. Genom genetiskt manipulera SCS under dessa utvecklingstidsfönster, mekanismerna bakom dessa olika stadier av myeline kan klargöras. Lentivirusvektorer är ett bra verktyg för ennalyzing myelination, särskilt eftersom de har minimal toxicitet, men lentivirus endast infektera neonatal ischiasnerver 5,6. I jämförelse, fungerar elektroporering-medierad genöverföring väl när transfektion sker på P3 (Figur 2E, överst) eller på P14 (Figur 2E, nederst).
Tillämpningarna av romanen in vivo elektroporering metod beskrivs här. Figur 3A visar ljusmikroskopiska bilder av GFP-uttryck myeliniserande SC på olika utvecklingsstadier (P7, P14, P21 och P31). Genom ljus mikroskopisk analys, förändringar i morfologiska parametrar, såsom längd och diameter, kan bedömas. Observera att dessa parametrar har liknande värden jämfört med intakt råtta perifera nerver 15,16, vilket tyder på att de electroporated nerverna utvecklas utan betydande skadliga effekter. Figur 3B visar en elektronmikroskopbild av LacZ-expressing myeliniserande SC. I det här fallet var LacZ användes som ett uttryck markör. β-galaktosidas färgning med hjälp av Bluo-gal, en etanol-olösligt substrat, möjliggör analys av myelin struktur transfekterade kaster med elektronmikroskopi 11,17. I dessa experiment kan undersökas roll signalmolekyler genom att tysta eller utöka deras uttryck, varigenom analys av bortfall av funktion eller vinna-of-funktion effekter. Utöver analysen av fast vävnad, kan in vivo elektroporering genöverföring tillämpas också att leva avbildning experiment. Till exempel visar figur 3C en myeliniserande SC samuttrycker G-GECO1.1 18, ett grönt fluorescerande cytosoliskt 2+ indikator Ca, och R-GECO1mt 19, en röd fluorescerande mitokondriell 2+ indikator Ca. Genom att uttrycka dessa indikatorer, identifierade vi en signalväg som kontrollerar cytosoliska och mitokondriella Ca2 + koncentrationer i myeliniserande kaster . Sålunda kan föreliggande metod användas för att studera en mängd olika signaleringsmekanismer, i synnerhet när genetiskt kodade fluorescerande prober finns tillgängliga för att detektera signalerna av intresse.
Figur 1:. Skiss över v vivo elektroporering metod Först ischiasnerven hos sövd råtta utsatt. För det andra, är plasmid-DNA injiceras i ischiasnerven. Tredje, elektriska pulserna avges till injektionsstället genom den pincett formad elektrod. Slutligen är såret försluts med lim. Denna procedur kan upprepas på den kontralaterala nerven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat på Transfekterade ischiasnerver (A) En representant bild av en transfekterad ischiasnerven.. Nerven transfekterades med RFP-uttryckande plasmiden vid P3 och fixerad vid P7. (B) En representant bild av en RFP-transfekterad cell vid P7 visar samlokalisering med S100, en SC markör. (C) En representativ bild av en RFP-transfekterade ischiasnerven vid P14 visar samlokalisering med MBP, en myeliniserande SC markör. (D) En representativ bild av en ischiasnerven samtransfekteras med GFP och RFP-uttryckande plasmider. Transfekterade SC uttryckte samtidigt GFP och RFP. (E) En bild av myeliniserande SC på P31 transfekterade på P3, när myelination börjar (överst), och en bild av myeliniserande SC på P31 transfekterades vid P14, när de flesta stora axoner blir myeliniserade (botten), vilket tyder på att transfvsnitt av myeliniserande SC kan uppnås inte bara i neonatala nerver, men även i mer mogna nerver. Skalstrecken = 200 ^ m (A); 50 | j, m (BE). Denna siffra ändrades från våra tidigare publikation 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tillämpning av in vivo Elektroporation (A) En lätt mikroskopisk analys av utvecklingen av myeliniserande SC.. Ischias nerver elektro med GFP-uttryckande plasmiden vid P3 och fixerades vid olika utvecklingsstadier (P7, P14, P21 och P31). Representativa bilder av GFP-positiva SCS visas till vänster. Den genomsnittliga längden och diametern är sammanfattade som medel ± SEM (n = 30-47 från 3 nerver) till höger. Längden och diametern på myeliniserande SCS ökar när utvecklingen fortskrider. (B) En elektronmikroskopisk bild av en ischiasnerv transfekterad med en plasmid som kodar för LacZ. En transfekterad SC (vitt asterisk, vänster) var fint märkt med fällningar av β-galaktosidas reaktionsprodukten. (C) En bild av en SC samtransfekterades med G-GECO1.1, ett grönt fluorescerande cytosoliskt 2+ indikator Ca, och R-GECO1mt, en röd fluorescerande mitokondriell 2+ indikator Ca. Regionerna inom de vita streckade rektanglar visas förstorade i panelerna till höger. Skalstrecken = 50 | am (A och C); 1 | j, m (B). Denna siffra ändrades från våra tidigare publikation 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
- Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
- Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
- Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
- Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
- Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
- Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
- Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
- Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
- Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
- Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
- Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
- Tanaka, Y., Hirokawa, N. Mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease. Trends Genet. 18, S39-S44 (2002).
