Den Isolering, differentiering, og Kvantificering af humant antistof-secernerende B-celler fra Blood: ELISpot som Funktionel Udlæsning af humoral immunitet
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
Kendetegnet for humoral immunitet er at generere funktionelle ASC'er, der syntetiserer og secernerer Abs specifikke for et antigen (Ag), såsom en patogen, og som anvendes til værtsforsvar. Til kvantitativ bestemmelse af den funktionelle status af det humorale immunrespons af en individuel, både serum Ab'er og cirkulerende ASC'er almindeligvis måles som funktionelle udlæsninger. Hos mennesker, perifert blod er den mest bekvemme og let tilgængelig prøve, der kan anvendes til bestemmelse af den humorale immunrespons, som fremkaldes af vært B-celler. Distinct B-celle-delmængder, herunder ASC'er, kan isoleres direkte fra perifert blod via selektion med slægt-specifikke Ab-konjugerede mikroperler eller via cellesortering med flowcytometri. Desuden kan oprensede naive og memory-B-celler aktiveres og differentieret til ASC'er i kultur. De funktionelle aktiviteter af ASC at bidrage til Ab sekretion kan kvantificeres ved ELISpot, som er et forsøg, der konvergerer enzym-bundet immunoabsorbance assay (ELISA) og Western blotting teknologier til at muliggøre tælling af individuelle ASC'er på single-celle niveau. I praksis har ELISpot-assayet i stigende grad blevet anvendt til at evaluere vaccineeffektivitet på grund af den lette håndtering af et stort antal blodprøver. Fremgangsmåderne til isolering af humane B-celler fra perifert blod, vil differentieringen af B-celler i ASC'er in vitro, og anvendelse af ELISpot til kvantificering af totale IgM- og IgG-ASC'er blive beskrevet her.
Introduction
B-celler spiller en central rolle i udviklingen af humoral immunitet. De oprindeligt udvikle sig i knoglemarven og ind i blodet som naive B-celler, som kan migrere ind i lymfevæv, såsom milt, lymfeknuder og mandler, til videreudvikling. Upon Ag møde, nogle naive B-celler migrerer ind lymfoide follikler, hvor kimcenter B-celler kan differentiere til memory-B-celler og plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC'ere). Mens de fleste PBS / pc'er egress i blodstrømmen, et par vinder opholde sig i knoglemarven til at undergå terminal differentiering til langlivede pc'er 1. B-celler i omløb er heterogene, og ved steady state, PBS / pc'er er sjældne i perifert blod 2. Som følge af tilgængeligheden af slægt-specifikke overflademarkører, flowcytometri er blevet en populær metode til identificering og karakterisering af de B-celle-undergrupper i perifert blod. En udvidet anvendelse af flow cytometry er tilføjelsen af en cellesorteringsapparat funktion, der tillader separation og isolering af individuelle undergrupper af B-celler med høj renhed. Baseret på ekspressionen af specifikke overfladereceptorer på forskellige udviklingsstadier, humane cirkulerende B-celler er generelt inddeles i tre hovedkategorier subpopulationer: naive B-celler (CD19 + CD27 – CD38 -), memory-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -), og PBS / pc'er (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figur 1). Naive B-celler af natur har ikke stødt Ags. De kan imidlertid opdeles i IgM + CD27 + B-hukommelsesceller. Selv naive B-celler er homogene i at udtrykke B-celle antigen receptor (BCR) associeret molekyler (f.eks CD19, CD20 og CD22) de er heterogene i deres immunglobulin repertoire 5. Størstedelen af CD27 + B-hukommelsesceller kan differentieres til CD27+ / hi CD38 + PBS / pc'er 6. Desuden memory-B-celler og PBS / pc'er er polyklonale og udviser udviklingsmæssig og funktionel heterogenitet 4-7. PBS / pc'er i omløb normalt kortvarig og ikke udtrykker CD138, men dem, der foretages for at slå sig ned i knoglemarven vil terminalt differentiere og blive langlivede. Terminalt differentierede pc'er udtrykker CD138 og nedregulere CD27-molekyler på deres overflader 8. Da både PBS og pc'er er i stand til at udskille Abs, i mange lejligheder de er kollektivt betegnet som ASC-kontrakter. I modsætning hertil kan hverken naive B-celler eller memory B celler producerer betydelige mængder af Abs 9-10. Men når isoleret, både naive og memory-B-celler kan differentieres til ASC'er i 3 – 10 dage, når de anbringes i de rette dyrkningsbetingelser 6, 11-15. Faktisk ASC'er stammer fra in vitro-differentiering deler lignende overflade udtryk for CD27 og CD38 med de direkte isoleret frabout perifert blod 6. Derudover ASC'er differentierede in vitro udtrykker et lavt niveau af overfladen CD20, ligner den for cirkulerende PBS / pc'er 6. Selvom kultur-afledte ASC'er er alle kortvarig, kan de udskiller Abs, hvilket indikerer, at de er funktionelt kompetente og i stand til at bidrage til den humorale immunitet.
Både ELISA og ELISpot er langt de mest almindeligt anvendte metoder med at opnå funktionel information om det humorale immunrespons. ELISA er en 96-brønds plade-baseret assay, og det er ofte anvendt til at måle titre af serum Ag-Ab'er og andre analytter (f.eks cytokiner). Det er praktisk og skalerbar. ELISA kan bruge en fastfase-enzymanalyse at detektere tilstedeværelsen af Abs eller andre stoffer, såsom serum, i en væskeprøve 16. De udlæsninger fra serum ELISA'er er ofte blevet brugt til at repræsentere immunresponset af kroppen. Et værktøj nødvendigt for erhvervelse af readouts fra ELISA-assays Spektrofotometrisk mikropladelæser. Læseren kan bestemme den optiske densitet (OD) af slutprodukterne typisk dannes ved reaktionen af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret påvisning Abs og deres specifikke substrater 17. Med hensyn til at rapportere det humorale immunrespons, serum Ab-niveauer bestemt ved ELISA betegne den kollektive, men ikke individuelt, udførelse af ASC'er i kroppen. Desuden ELISA ikke tager hensyn til deltagelse memory-B-celler, som ikke udskiller Abs.
Ligesom ELISA, ELISpot er en meget anvendt metode til påvisning og overvågning af immunrespons i blodprøver perifere 17-18. ELISpot er en teknik relateret til en sandwich-ELISA. Heri anbringes celler i polyvinylidendifluorid (PVDF) membran-backed brønde af 96-brønds mikroplader for en kortsigtet kultur. ELISPOT-assayet er analog med udførelse western blotting på en mikroplade og developing pletter på PVDF-membran i hver brønd. Et automatiseret ELISpot reader system eller et stereomikroskop for manuel tælling er påkrævet. Den største fordel ved ELISpot i detektion af en immunreaktion er dens fremragende følsomhed i kvantificeringen af ASC'er og cytokin-secernerende celler. Det rapporterer deres funktionelle aktiviteter i humorale og cellulære immunitet, hhv. Ved målingen af humorale immunforsvar, er serum Ab-niveauer bestemt ved ELISA, og antallet af ASC'er opregner ELISpot ofte korreleret, men data udlæsninger fra disse to assays har nogle forskelle i funktionelle implikationer 19-20. Den største fordel ved ELISpot er dens følsomhed metode. Niveauet af serum Ab-titre som rapporteret af ELISA præsenteres semi-kvantitativt som OD udlæsninger, der angiver det relative Ab-niveau, eller mere kvantitativt, da koncentration aflæsning, når en kendt mængde af de rigtige isotyper af Abs er medtaget som reference. I modsætning hertil resultaterne af ELISpot er presented som den absolutte antal ASC'er i en celle pulje af interesse (f.eks ufraktionerede mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) og renset B-celler fra PBMC'er). ELISpot kan detektere en enkelt ASC, men ELISA kræver Ab mængder fra ASC'er at nå optimerede assay-afhængige koncentrationer før målingen. Derfor ELISpot er naturligvis bedre end ELISA i følsomhed kvantificering. Desuden ELISpot er også egnet til kvantificering af in vitro differentierede ASC'er fra aktiverede B-hukommelsesceller. B-hukommelsesceller udskiller ikke Abs men kan differentiere til ASC'er ved aktivering; de derfor ikke har bidraget til serum Abs detekteret ved ELISA. , ELISpot er således den foretrukne metode til måling af immunresponset af cirkulerende memory-B-celler efter aktivering i kultur. Det giver mulighed for overvågning af opretholdelsen af langsigtet humoral immunitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering og oprensning af humane perifere blod B-celler
Normalt kan RBC'er effektivt brydes og væk for lysepuffer (trin 1.2). Det er vigtigt ikke at inkubere PBMC'er med RBC lysepuffer længere end 5 min, som cellelevedygtighed kan være påvirket af ammoniumchlorid. Alternativt kan RBC'er og blodplader samtidigt fjernes ved den følgende protokol.
Bland frisk fuldblod med syre-citrat-dextrose (ACD) puffer (39 mM citronsyre, 75 mM natriumcitrat og 135 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
