We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.
Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.
Antistoffer, der kan folde og fungerer i det intracellulære miljø er lovende redskaber til både forskning og terapeutiske anvendelser. De har evnen til at modulere protein-aktivitet ved binding til et målprotein i celler for at forhindre protein-protein-interaktioner, forstyrre protein-nukleinsyre-interaktioner, eller forhindre substrat adgang til enzymer 1-5.
Selvom antistoffer har stort potentiale for intracellulære applikationer, ingeniør dem for korrekt foldning og opløselighed i det intracellulære miljø under opretholdelse af evnen til at binde til et målantigen er udfordrende. Den reducerende cytoplasmatiske miljø forhindrer dannelsen af disulfidbindinger normalt kræves til den stabile foldning af fuld-længde antistoffer og antistoffragmenter, herunder enkelt-kæde variable fragment (scFv) antistoffer 6,7. En række rettet evolution tilgange er blevet anvendt til at konstruere antistoffer med hIgH tilhørsforhold til target antigener 8-10. Disse tilgange almindeligt brug fagdisplay, gær overflade display, eller bakteriel overflade display at screene store biblioteker af antistoffer 11-13. Disse metoder er kraftfulde og effektive til identificering af antistoffer, der binder til mål, men de afhænger af sekretoriske sti for at transportere proteiner, der vises 14-16. Den sekretoriske pathway translokerer ufoldede proteiner fra den reducerende cytoplasma ind i det endoplasmatiske reticulum lumen i gær eller i periplasmaet i bakterier. Proteinerne så fold under oxiderende betingelser og vises på celleoverfladen eller pakket i fagpartikler til screening for bindingsaffinitet 17,18. Som følge heraf vil antistoffer isoleret ved hjælp af disse teknikker ikke nødvendigvis fold godt i cytoplasmaet, og intracellulær opløselighed skal ofte manipuleret særskilt, hvis antistofferne vil blive anvendt i intracellulære applikationer.
At forbedreeffektiviteten af tekniske antistoffer, der er godt foldet i cytoplasmaet, vi tidligere rapporteret succes MAD-TRAP (membran-forankret display til Tat-baseret genkendelse af associerende proteiner), en fremgangsmåde til screening af et scFv-antistof-bibliotek under anvendelse af Escherichia coli inder- membran display 19. Bakteriel indre membran display afhængig af twin-arginin translokation (Tat) pathway til transport viste antistoffer, i modsætning til andre almindeligt display, som bruger den sekretoriske pathway. Tat-banen indeholder en kvalitetskontrol mekanisme, der kun tillader opløselige, korrekt foldede proteiner, som skal transporteres fra E. coli cytoplasma, på tværs af indre membran, og i periplasmaet 20,21. Overudtrykt Tat substrater (dvs.., Proteiner målrettet mod Tat-banen med en N-terminal fusion til Tat signalpeptidet ssTorA), der er godt foldet i cytoplasmaet danne en lang levetid translokation mellemprodukt med N-terminalen in cytoplasmaet og C-terminalen i periplasmaet 19. Dette tillader visning af korrekt foldede Tat substrater, herunder antistoffragmenter, om det periplasmiske side af E. coli indre membran. Efter fjernelse af ydre membran ved enzymatisk spaltning til dannelse sfæroplaster er antistoffer udsat for det ekstracellulære rum (figur 1). Dette tillader Tat substrater vises på den indre membran, der skal screenes for binding til et bestemt mål. Vigtigt er det, at udnytte Tat-banen for celle-overflade display sikrer, at kun de antistoffer i biblioteket, som er godt foldet i cytoplasmaet, vil blive afhørt for binding, tillader samtidig manipulation af bindingsaffinitet og intracellulær foldning. I denne protokol, beskriver vi, hvordan at vise et scFv-bibliotek på E. coli indre membran, panorere biblioteket mod en mål-antigen, og udføre en sekundær skærm til at identificere de mest lovende bestanddele af biblioteket. Mens vi fokuserer protokollen om scFv'er, kunne metoden anvendes på engineering enhver protein, hvis applikation kræver binding og intracellulær foldning.
Figur 1. Tat indre membran display. I E. coli, scFv-antistoffer, der udtrykkes som en fusion til den ssTorA signalsekvensen og korrekt foldede i cytoplasmaet transporteres over den indre membran. En translokation mellemformer, hvor scFv'erne forankres i den indre membran med N-terminalen i cytoplasmaet og C-terminalen i periplasmaet. E. coli ydre membran fordøjes enzymatisk for at danne sfæroplaster og derved udsætte den forankrede antistoffer til det ekstracellulære rum og gøre dem tilgængelige for påvisning ved anvendelse af et antistof, som binder til C-terminalt smeltet epitopmærke på det viste antistof.belastning / 54.583 / 54583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Engineering antistoffer til cytoplasmatisk aktivitet er en vanskelig opgave på grund af den reducerende miljø i cytoplasmaet, hvilket vanskeliggør dannelsen af stabiliserende disulfidbindinger 6,7. Dette forårsager de fleste antistoffer, der skal cytoplasmatisk inaktive, medmindre de er konstrueret for stabilitet og opløselighed i cytoplasmaet, ud over at være udviklet til bindingsaffinitet. De eksisterende metoder til fagvisning, bakteriel overflade display, og gær overfladefremvisning metoder bruger alle den sekretoriske pathway 14-16 til udstilling af manipulerede antistoffer, men disse fremgangsmåder har ingen midler til at konstruere intracellulær foldning. Antistoffer manipuleret under anvendelse indre membran display har forbedret cytoplasmatisk stabilitet og opløselighed fordi foldningen kvalitetskontrol af Tat-banen forhindrer translokation af antistoffer, der er dårligt foldede og ustabile i cytoplasmaet. Denne metode forenkler den iterative proces i engineering intracellulære antistoffer til affinitet ennd opløselighed, da de to egenskaber er udviklet i et trin. Selv om denne fremgangsmåde er designet til ingeniørarbejde antistoffer med opløselighed i den reducerende intracellulære miljø, kan den også anvendes til engineering antistoffer til at fungere i ikke-reducerende betingelser, idet proteinerne manipuleret ved hjælp af denne metode opretholde deres foldning i oxiderende miljø af periplasma.
Selv om denne teknik simplificerer processen med engineering antistoffer med høj affinitet og høj cytoplasmatisk opløselighed, flere begrænsninger er vigtigt at overveje, når du bruger denne protokol. Ved analyse af de sekundære skærm ELISA-signaler til at identificere lovende scFv varianter, tærsklen for kræsne mellem potentielt interessante varianter og dem, der ikke udviser tilstrækkelig antigen-bindende sandsynligvis ikke vil være klart før efter flere kloner er blevet yderligere karakteriseret. Det er vigtigt at se efter forbedret binding løbet stamantistoffet; imidlertid,et unormalt højt signal kunne være tegn på aviditet 29 eller aggregation effekter 30, en udfordring, som ikke er unikt for den indre membran display screening tilgang. Et centralt begrænsning at huske, når du bruger denne protokol er den manglende evne til at inddrive sfæroplaster efter panorering, da de er ikke-levedygtige (upublicerede data). Dette nødvendiggør DNA forstærkning og transformation skridt til at inddrive de antistof-koder plasmider.
Flere kritiske trin i protokollen aktiverer samtidig engineering af foldning og binding af antistoffer. Til screening skal lykkes, må den scFv-bibliotek, der screenes udtrykkes som en fusion til ssTorA signalpeptid. Uden denne sekvens, vil antistoffer ikke rettet mod Tat-banen og vil således ikke translokeres til periplasmaet 19. Desuden er det bydende nødvendigt, at en C-terminal epitop-mærke fusioneres til antistofferne at muliggøre detektion af de viste antistoffer i skraldespandending assays. Det er klart, E. coli stamme anvendes til at udtrykke scFv'er skal også have den nødvendige Tat-banen maskiner, men dette er sandt for de almindeligt anvendte E. coli-stammer.
Ændringer til denne protokol er muligt at forbedre dets potentiale til at isolere antistoffer med de ønskede egenskaber. En subtraktiv panorering trin kan være afsluttet før panorering mod målantigenet at nedbryder scFv bibliotek af ikke-ønskede bestanddele. Biblioteket sfæroplaster kan inkuberes med magnetiske perler overtrukket med BCCP alene eller overtrukket med en ikke-ønsket protein, og sfæroplasterne som binder til disse perler kan kasseres, før screening af de resterende ubundne sfæroplaster for binding til det ønskede mål. Som nævnt i Repræsentative resultater, en fremgangsmåde forbedre affiniteten af et isoleret scFv skal omfatte et opløseligt konkurrent i panning reaktion at konkurrere med de scFv'er vises på sfæroplasterne. Fordi den opløselige competitor er et oprenset protein, intet DNA er amplificeret fra det, så kun sekvenser af scFv'er vises på sfæroplasterne vil blive inddrevet i PCR-reaktionen. Derudover kan denne fremgangsmåde udvides til manipulering andre typer antistoffer eller til ikke-antistof-bindende proteiner.
E. coli indre-membran display er en kraftfuld platform for engineering antistoffer med høj affinitet og høje niveauer af intracellulær opløselighed. Denne fremgangsmåde er særligt egnet til effektiv engineering af antistoffer bestemt til at fungere i det intracellulære miljø. Disse intracellulære antistoffer undersøges allerede som potentielle lægemidler på en række områder, herunder neurodegenerative sygdomme, kræft og virusinfektioner 31. Denne teknik vil gøre det muligt mere udbredt anvendelse af intracellulære antistoffer som redskaber til forskning og medicin på disse områder og alle andre områder, hvor studere en protein-target in situ ønskes.
The authors have nothing to disclose.
We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.
scFv library | Varies | N/A | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. |
MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
10X T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
5X Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
Agarose | Promega | V3121 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
Agar | BD | 214030 | |
96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |