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Biochemistry

एंटीबॉडी टुकड़े की एक लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के लिए बैक्टीरियल इनर-झिल्ली प्रदर्शन

Published: October 15, 2016 doi: 10.3791/54583
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1,2
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Introduction

तह और intracellular वातावरण में कार्य करने में सक्षम एंटीबॉडी दोनों अनुसंधान और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए होनहार उपकरण हैं। वे कोशिकाओं के अंदर एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत रोकने प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत बाधित, या एंजाइमों 1-5 सब्सट्रेट उपयोग को रोकने के द्वारा प्रोटीन गतिविधि मिलाना करने की क्षमता है।

हालांकि एंटीबॉडी intracellular अनुप्रयोगों के लिए ज्यादा क्षमता है, उन्हें उचित तह और intracellular वातावरण में घुलनशीलता के लिए इंजीनियरिंग, जबकि लक्ष्य प्रतिजन के लिए बाध्य करने की क्षमता को बनाए रखने के चुनौतीपूर्ण है। को कम करने cytoplasmic पर्यावरण डाइसल्फ़ाइड बांड सामान्य रूप से पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी और एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) 6.7 एंटीबॉडी सहित एंटीबॉडी टुकड़े, के स्थिर मोड़ने के लिए आवश्यक के गठन से बचाता है। निर्देशित विकास के दृष्टिकोण के एक नंबर ज के साथ एंटीबॉडी इंजीनियर करने के लिए नियोजित किया गया हैलक्ष्य के लिए igh समानताएं 8-10 प्रतिजनों। इन तरीकों सामान्यतः फेज प्रदर्शन, खमीर सतह प्रदर्शन, या बैक्टीरियल सतह प्रदर्शन का उपयोग एंटीबॉडी 11-13 के बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए। इन तरीकों से शक्तिशाली और एंटीबॉडी कि लक्ष्यों के लिए बाध्य की पहचान करने के लिए प्रभावी रहे हैं, फिर भी वे स्रावी मार्ग पर निर्भर प्रोटीन है कि 14-16 प्रदर्शित किया जाएगा परिवहन के लिए। स्रावी मार्ग खमीर में या बैक्टीरिया में periplasm में जालिका लुमेन में कम करने कोशिका द्रव्य से सामने आया प्रोटीन translocates। प्रोटीन तो ऑक्सीकरण की शर्तों के तहत गुना और कोशिका की सतह पर प्रदर्शित या समानता 17,18 बाइंडिंग के लिए स्क्रीन करने के लिए फेज कणों में पैक कर रहे हैं। नतीजतन, इन तकनीकों का उपयोग कर अलग एंटीबॉडी जरूरी कोशिका द्रव्य में अच्छी तरह से गुना नहीं होगा, और intracellular घुलनशीलता अक्सर अलग से इंजीनियर किया जाना चाहिए एंटीबॉडी intracellular अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा।

सुधार करने के लिएइंजीनियरिंग एंटीबॉडी कि अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में जोड़ रहे हैं की क्षमता, हम पहले से पागल जाल (जोड़ प्रोटीन का गूंथना आधारित मान्यता के लिए झिल्ली लंगर प्रदर्शन) की सफलता, एक scFv एंटीबॉडी कोलाई inner- का उपयोग कर पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए एक विधि सूचना दी झिल्ली प्रदर्शन 19। बैक्टीरियल भीतरी झिल्ली प्रदर्शन दिखाया गया एंटीबॉडी के परिवहन, अन्य आम प्रदर्शन के तरीकों कि स्रावी मार्ग का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत के लिए जुड़वां arginine translocation (बुनना) मार्ग पर निर्भर करता है। गूंथना मार्ग एक गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र है कि केवल अनुमति देता है घुलनशील, सही ढंग से मुड़ा प्रोटीन ई से ले जाया जा रहा होता है कोलाई कोशिका द्रव्य, भीतरी झिल्ली के पार, और periplasm 20,21 में। Overexpressed गूंथना substrates (अर्थात्।, प्रोटीन जैसे संकेत पेप्टाइड ssTorA के लिए एक एन टर्मिनल संलयन के साथ गूंथना मार्ग को निशाना बनाया) है कि अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में जोड़ रहे हैं एक लंबे समय रहते translocation एन टर्मिनस के साथ मध्यवर्ती फार्म मैंn कोशिका द्रव्य और periplasm 19 में सी टर्मिनस। इस एंटीबॉडी टुकड़े सहित सही ढंग से मुड़ा गूंथना substrates, के प्रदर्शन की अनुमति देता है, ई की periplasmic चेहरे पर कोलाई भीतर की झिल्ली। Enzymatic पाचन द्वारा बाहरी झिल्ली को हटाने स्फेरोप्लास्ट उत्पन्न करने के बाद, एंटीबॉडी बाह्य अंतरिक्ष (चित्रा 1) के संपर्क में हैं। यह अनुमति देता है जैसे substrates के भीतर की झिल्ली पर प्रदर्शित एक विशेष लक्ष्य के लिए बाध्य करने के लिए जांच की जानी है। महत्वपूर्ण बात है, सेल सतह प्रदर्शन के लिए गूंथना मार्ग का दोहन सुनिश्चित करता है कि केवल पुस्तकालय में एंटीबॉडी कि अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में जोड़ रहे हैं बाध्यकारी, आत्मीयता और intracellular तह बाइंडिंग का एक साथ इंजीनियरिंग की अनुमति के लिए पूछताछ की जाएगी। इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे ई पर एक scFv पुस्तकालय को प्रदर्शित करने का वर्णन कोलाई भीतर की झिल्ली, एक लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ पुस्तकालय पैन, और पुस्तकालय की सबसे होनहार घटक की पहचान करने के लिए एक उच्च माध्यमिक स्क्रीन प्रदर्शन करते हैं। हम ध्यान केंद्रित करते हैं scFvs पर प्रोटोकॉल, विधि किसी भी प्रोटीन जिनके आवेदन बाध्यकारी और intracellular तह आवश्यकता इंजीनियरिंग के लागू हो सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. गूंथना भीतरी झिल्ली प्रदर्शन ई। में कोलाई, scFv एंटीबॉडी कि ssTorA संकेत अनुक्रम को एक संलयन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं और सही ढंग से कोशिका द्रव्य में मुड़ा भीतरी झिल्ली भर में ले जाया जाता है। एक translocation मध्यवर्ती रूपों, जहां scFvs कोशिका द्रव्य में एन टर्मिनस और periplasm में सी टर्मिनस के साथ भीतरी झिल्ली में लंगर डाले हैं। ई कोलाई बाहरी झिल्ली enzymatically स्फेरोप्लास्ट के लिए फार्म पच जाता है, जिससे बाह्य अंतरिक्ष के लिए लंगर एंटीबॉडी को प्रकाश में लाने और एक एंटीबॉडी कि प्रदर्शित एंटीबॉडी पर सी-टर्मिनली इनकार मिलान टैग के लिए बांध का उपयोग करके उन्हें पता लगाने के लिए उपलब्ध कर रही है।लोड / 54583 / 54583fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

1. ssTorA संकेत अनुक्रम को एक संलयन के रूप scFv लाइब्रेरी तैयार

  1. एक scFv जीन के वेरिएंट युक्त एक deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) पुस्तकालय प्राप्त करते हैं।
    नोट: पुस्तकालय भी पूरे scFv जीन या लक्षित डोमेन पर विविधता उत्पन्न करने के लिए कोई भी उचित मोड का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता है 22 (जैसे, तीसरे पूरकता क्षेत्रों का निर्धारण करने, CDR3s।)।
  2. PIMD प्लाज्मिड (चित्रा 2) मानक आणविक क्लोनिंग तरीकों का उपयोग कर 23 में डीएनए पुस्तकालय डालें।
    नोट: यह प्लाज्मिड ssTorA संकेत अनुक्रम (scFv के लिए एन टर्मिनल) के लिए एक आनुवंशिक फ्यूजन और झंडा मिलान टैग (scFv करने के सी टर्मिनल) के रूप में scFvs व्यक्त करता है। भीतरी झिल्ली प्रदर्शन के लिए प्लाज्मिड की डिजाइन पहले 19 में वर्णित किया गया है। pIMD प्लाज्मिड लेखकों से उपलब्ध है।

चित्र 2
चित्रा 2. इनर-झिल्ली प्रदर्शन प्लाज्मिड (pIMD) मानचित्र (कदम 1.2 1.3 के माध्यम से)। यह प्लाज्मिड एक लाख प्रमोटर, प्रतिकृति के ColE1 मूल, और एक chloramphenicol प्रतिरोध जीन होता है। डाला scFv जीन गूंथना मार्ग के लिए और एक झंडा मिलान टैग के लिए scFv लक्षित करने ssTorA संकेत अनुक्रम से जुड़े हुए है, एक ही पढ़ने फ्रेम में इन तीनों के साथ। प्रतिबंध एंजाइम साइटों संकेत कर रहे हैं। एक पुस्तकालय XbaI और चना प्रतिबंध एंजाइम साइटों के बीच डाला के लिए, प्लाज्मिड का आकार 2219 बीपी प्लस scFv के आकार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. प्लाज्मिड MC4100 ई में पुस्तकालय युक्त डीएनए रूपांतरण कोलाई कोशिकाओं 23। स्वस्थ और पुस्तकालय के इस जीवाणु रूप से बढ़ता है। पर आरटी पर 15 मिनट के लिए 4,000 × छ अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला निकालें, और एकत्र कोशिकाओं resuspendLuria-Bertani (पौंड) मीडिया में 25% ग्लिसरॉल में। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots तक की जरूरत है, या चरण 2 पर आगे बढ़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल हालांकि अन्य ई, MC4100 कोशिकाओं के साथ सत्यापित किया गया है कोलाई उपभेदों भी प्रोटोकॉल के साथ संगत होने की उम्मीद कर रहे हैं। Electroporation परिवर्तन के लिए पसंदीदा तरीका, इसकी उच्च परिवर्तन दक्षता के कारण है। पुस्तकालय आम तौर पर कम से कम 10 9 scFv इस स्तर पर वेरिएंट की मिलकर करना चाहिए, और प्रत्येक विभाज्य पर्याप्त कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए कि इस तरह के पुस्तकालय 100 गुना कवर किया जाता है।

2. पुस्तकालय एक्सप्रेस और स्फेरोप्लास्ट तैयार

  1. बैक्टीरियल पुस्तकालय आरटी पर (1.3 चरण से) के एक विभाज्य गला लें, और एक कुप्पी 20 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol (सेमी) के साथ 100 मिलीलीटर लेग मीडिया से युक्त करने के लिए विभाज्य जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा और एक प्रकार के बरतन में incubated 225 आरपीएम के लिए आगे बढ़ें।
  2. 3 घंटे के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस incubated प्रकार के बरतन से कुप्पी को हटा दें। करने के लिए scFv पुस्तकालय की अभिव्यक्ति की अनुमति15 से 20 डिग्री सेल्सियस पर 22 घंटा और 225 आरपीएम के लिए आगे बढ़ना हे / एन एक प्रकार के बरतन में incubated।
    नोट: कोई inducer जरूरत है, जब pIMD प्लाज्मिड का उपयोग करते हुए, के रूप में प्रमोटर टपका हुआ है। ध्यान दें कि MC4100 कोशिकाओं लाख repressor overexpress नहीं है (और Laci प्लाज्मिड पर नहीं पाया जाता है)।

चित्र तीन
चित्रा 3. कोलाई कोशिकाओं और स्फेरोप्लास्ट। (ए) ई कोलाई कोशिकाओं के आकार में बेलनाकार हैं। (बी) EDTA और लाइसोजाइम, ई की बाहरी झिल्ली का उपयोग कर spheroplasting के बाद कोलाई कोशिकाओं उठी है, और जिसके परिणामस्वरूप स्फेरोप्लास्ट आकार में गोलाकार कर रहे हैं। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी छवियों एक औंधा माइक्रोस्कोप पर एक 100X उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त किया गया। कृपया गयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ चाटना।

  1. पुस्तकालय स्फेरोप्लास्ट तैयार करें।
    नोट: स्फेरोप्लास्ट ई की बाहरी झिल्ली फटने से बनते हैं कोलाई और आकार में गोलाकार (चित्रा 3) कर रहे हैं।
    1. आवश्यक बफ़र्स तैयार करें।
      नोट: सभी बफ़र्स बाँझ होना चाहिए।
      1. आसुत एच 2 1000 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा हे में 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.2 ग्राम KCl, 1.44 छ ना 2 भंग 4 HPO द्वारा, (7.4 पीएच पीबीएस), और 0.24 छ के.एच. 2 4 पीओ 1 × फॉस्फेट बफर खारा तैयार करें। बर्फ पर रखें।
      2. 0.1% के साथ पीबीएस तैयार (w / v) गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 200 मिलीलीटर 1 × पीबीएस में 0.2 ग्राम बीएसए भंग द्वारा। बर्फ पर रखें।
      3. मिश्रण बाँझ फ़िल्टर 1 एम सुक्रोज, 1 एम Tris बफर (पीएच 8.0), और 1.5 मिलीग्राम के 1 मिलीलीटर आसुत एच 2 ओ के 7.5 मिलीलीटर से विभाजन बफर (एफबी) तैयार बर्फ पर रखें।
      4. 30 μl ओ जोड़कर 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) तैयारएफ 0.5 एम EDTA के लिए 14.97 मिलीलीटर आसुत एच 2 ओ
      5. 0.5 एम 2 MgCl तैयार 100 मिलीलीटर में 4.76 जी 2 MgCl भंग द्वारा आसुत एच 2 ओ बर्फ पर रखें।
    2. एक प्रकार के बरतन से कुप्पी निकालें, और सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने। गणना प्रेरित संस्कृति की मात्रा में इस तरह की जरूरत है 1 × 10 10 कोशिकाओं है कि spheroplasting के लिए प्रत्येक नमूना।
      नोट: एक आयुध डिपो 1 की 600 ई के लिए 10 9 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता का संकेत के सन्निकटन कोलाई 24 का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. अपकेंद्रित्र गणना प्रेरित संस्कृति का एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 12,000 × छ आरटी पर 5 मिनट के लिए मात्रा। घटना है कि एक मुद्दा नमूना तैयार करने में उठता में कम से कम दो नमूने तैयार करें।
    4. centrifuged संस्कृतियों से सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंडा अमेरिकन प्लान के 100 μl में प्रत्येक कोशिका गोली resuspend। 12,000 × पर अपकेंद्रित्र1 मिनट के लिए आरटी पर जी, और फिर pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 10 मिलीग्राम / एमएल लाइसोजाइम के 3.5 μl के साथ पूरक ठंडा अमेरिकन प्लान के 350 μl में प्रत्येक गोली Resuspend।
    5. धीरे धीरे प्रत्येक ट्यूब भंवर, जबकि उनका कहना है dropwise, 1 मिमी EDTA के 700 μl, और फिर 20 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं, जबकि धीरे धीरे एक ट्यूब रोटेटर पर घूर्णन नमूने मिश्रण करने के लिए। रोटेटर से ट्यूबों निकालें, प्रत्येक ट्यूब ठंडा 0.5 एम 2 MgCl के 50 μl जोड़ने के लिए, और 10 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें सेते हैं। अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पर 11,000 × छ ट्यूबों।
    6. spheroplast गोली अलग।
      1. 1 मिलीलीटर टिप के साथ एक micropipette का उपयोग धीरे-धीरे गोली के हिस्से को खींचने के लिए। सीधे एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब ऊपर खुलने के साथ एक कोण पर ट्यूब धारण करते हुए, धीरे-धीरे सतह पर तैरनेवाला के बाहर विंदुक टिप उठा और नया ट्यूब में गोली स्लाइड।
      2. सतह पर तैरनेवाला का एक महत्वपूर्ण मात्रा नया ट्यूब को सौंप दिया है, तो यह pipetting द्वारा हटा दें। गोली फर्म इनो नहीं है, तोऊ फिर 2 मिनट और प्रयास गोली अलगाव के लिए 11,000 × छ पर स्थानांतरण करने के लिए, फिर से सेंट्रीफ्यूज।
    7. ठंडा 1 × पीबीएस के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक ट्यूब में spheroplast गोली Resuspend। pipetting और धीरे धीरे एक भंवर धारक पर vortexing जब तक पूरी तरह से गोली resuspended है के बीच वैकल्पिक। एक समय में अधिक से अधिक 2 मिनट के लिए बर्फ के बंद के नमूने रखने के लिए, और फिर बर्फ से हटाने से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ को वापस नहीं है। जब तक चरण 4 में panning के लिए इस्तेमाल किया 4 डिग्री सेल्सियस (अप करने के लिए 2 दिनों के लिए) पर स्फेरोप्लास्ट रखें।

3. चुंबकीय मोती पर लक्ष्य प्रतिजन स्थिर

  1. ई में पुनः संयोजक उत्पादन के दौरान विवो में लक्ष्य प्रतिजन Biotinylate कोलाई कोशिकाओं। वैकल्पिक रूप से, रासायनिक विकार 25 या खरीद के लक्ष्य प्रतिजन कि पहले से ही biotinylated किया गया है का उपयोग करें, और 3.2 कदम आगे बढ़ना।
    1. 50 मिलीलीटर पानी के लिए 816 जी bicine जोड़े 10 × bicine बफर बनाने के लिए। buf पतला50 डिग्री सेल्सियस के लिए आसुत एच 2 हे और गर्मी में फेर करने के लिए 1 *। गरम 1 * bicine बफर के 12 मिलीलीटर के लिए 14.7 मिलीग्राम बायोटिन जोड़े एक बायोटिन समाधान यह है कि 10 मिमी bicine बफर में 5 मिमी बायोटिन बनाने के लिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर तक की जरूरत है।
    2. एक्सप्रेस और pAK400cb-BCCP प्लाज्मिड 26 है, जो बायोटिन carboxyl वाहक प्रोटीन (BCCP) के लिए एक संलयन के रूप में लक्ष्य प्रतिजन के उत्पादन की अनुमति देता का उपयोग कर लक्ष्य प्रोटीन biotinylate।
      नोट: ई कोलाई कोशिकाओं natively biotinylate BCCP, शुद्ध और रासायनिक streptavidin लिपटे मोतियों पर स्थिरीकरण करने से पहले लक्ष्य प्रोटीन biotinylate नष्ट करने की जरूरत। मूल निवासी ई कोलाई बायोटिन ligase बीरा संलयन प्रोटीन biotinylating के लिए पर्याप्त है।
      1. ई बढ़ो कोलाई biotinylation प्लाज्मिड हे (लक्ष्य प्रतिजन BCCP के एन टर्मिनस के लिए एक संलयन के रूप में सम्मिलित साथ) युक्त / N के लिए 15 से 18 घंटा में 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलीलीटर सेमी 20 माइक्रोग्राम / साथ पूरक जबकि पर झटकों लेग मीडिया के 5 मिलीलीटर 225 आरपीएम।
      2. समीकरण का उपयोग 20 माइक्रोग्राम / एमएल मुख्यमंत्री के साथ 0.05 25 में मिलीलीटर ताजा लेग मीडिया के एक आयुध डिपो शुरू करने पर 600 एनएम पर आयुध डिपो उपाय के एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग और गणना संस्कृति की जरूरत है (वी जोड़) उपसंस्कृति करने की मात्रा: वी जोड़ें = (0.05 × 25 मिलीलीटर) / (600 आयुध डिपो - 0.05), जहां आयुध डिपो के 600 हे / एन संस्कृति और वी जोड़ने के ऑप्टिकल घनत्व है ताजा पौंड में जोड़ने के लिए हे / एन संस्कृति की मात्रा है उपसंस्कृति और 37 डिग्री सेल्सियस और 225 rpm पर एक incubated प्रकार के बरतन में 0.8 करने के लिए 0.5 के एक आयुध डिपो के लिए जाना।
      3. isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता और 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए बायोटिन में जोड़े। 20 डिग्री सेल्सियस और 225 rpm पर 15 से 22 घंटा के लिए एक प्रकार के बरतन में incubated अभिव्यक्ति प्रेरित।
    3. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 × छ centrifugation द्वारा हार्वेस्ट बैक्टीरिया। सतह पर तैरनेवाला निकालें। उपयोग के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली स्टोर।
    4. जोड़नाप्रति सेल गोली की 0.2 ग्राम एक सेल डिटर्जेंट के 1 मिलीलीटर। pipetting द्वारा Resuspend और धीरे 20 मिनट के लिए बारी बारी से कोशिकाओं lyse करने के लिए। सेल के बाद, पर 16,000 × छ सेंट्रीफ्यूज और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस। एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में घुलनशील lysate (सतह पर तैरनेवाला) पिपेट।
    5. अपार बायोटिन दूर करने के लिए एक 3 केडीए आणविक वजन कटऑफ स्तंभ का प्रयोग करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ में lysate, और सेंट्रीफ्यूज पिपेट निर्माता के निर्देशों के अनुसार। 1 × पीबीएस के साथ धोने तक lysate में बायोटिन 100 गुना पतला कर दिया गया है और धोया lysate की मात्रा lysate के मूल मात्रा के बराबर है। एक नया ट्यूब lysate स्थानांतरण।
  2. streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों पर biotinylated लक्ष्य प्रतिजन स्थिर।
    1. चरण 2.3.1 में वर्णित के रूप में 1 × पीबीएस और 0.1% के साथ 1 × पीबीएस (w / v) बीएसए तैयार करें।
    2. चुंबकीय मोती तैयार करें।
      नोट: यह एक चुंबकीय जुदाई रैक के उपयोग की आवश्यकता है।
      1. resuspend streptavउनके मूल शीशी में Idin लेपित चुंबकीय मोती। या कम से कम 30 सेकंड के लिए या तो भंवर 5 मिनट के लिए बारी बारी से।
      2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब 7-10 × 10 9 मोती स्थानांतरण।
        नोट: मात्रा की आवश्यकता मनका एकाग्रता निर्माता द्वारा आपूर्ति पर निर्भर हो जाएगा।
      3. ट्यूब के किनारे पर मोती को इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबक रैक पर मोती युक्त ट्यूब रखें। चुंबक पर ट्यूब के साथ अभी भी है, ध्यान से मोती बाधा पहुँचा के बिना pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      4. धोने के लिए, चुंबक से ट्यूब निकालें, और बुलबुले पैदा करने के बिना pipetting द्वारा 1 × पीबीएस के 1 मिलीलीटर में मोती resuspend। मोती को इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबक ट्यूब वापसी, और ध्यान से pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। तीन washes के एक कुल के लिए प्रक्रिया दो बार दोहराएँ। सुनिश्चित करें कि कोई तरल ट्यूब में छोड़ दिया है अंतिम धोने के बाद।
    3. biotinylated प्रतिजन युक्त lysate चुंबकीय बिया में जोड़ेडी एस।
      1. चुंबक से ट्यूब निकालें और lysate (चरण 3.1.5 से) के 1 मिलीलीटर में मोती resuspend। 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं जबकि धीरे घूर्णन।
      2. 3 मिनट के प्रतिजन लिपटे मोतियों को इकट्ठा करने के लिए चुंबक पर ट्यूब रखें। लिपटे मोतियों पांच बार कदम 3.2.2.4 करने के लिए 3.2.2.3 में वर्णित के रूप में एक ही तरीके से 0.1% BSA के साथ 1 × पीबीएस के साथ धो लें। अंतिम धोने के बाद, चरण 3.2.2.2 में इस्तेमाल एक ही मात्रा को 0.1% BSA के साथ 1 × पीबीएस में मोती resuspend।
      3. तो स्थिर लक्ष्य प्रतिजन 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है, जब तक panning के लिए आवश्यक 4 डिग्री सेल्सियस पर लिपटे मोतियों की दुकान। अन्यथा, चरण 4 पर आगे बढ़ें।

4. स्क्रीन scFv लाइब्रेरी लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ panning से (चित्रा 4)

चित्रा 4
चित्रा 4. Panning (चरण 4)। एंटीजन लेपित चुंबकीय मोतियों की गिरफ्तारीई एंटीबॉडी पुस्तकालय वेरिएंट व्यक्त स्फेरोप्लास्ट के साथ incubated। मनका बाध्य स्फेरोप्लास्ट से प्लास्मिड डीएनए बरामद किया है और एक sublibrary, जो एलिसा आधारित माध्यमिक स्क्रीन का उपयोग कर जांच की है उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रोटोकॉल कदम इसी रहे हैं उल्लेख किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. स्फेरोप्लास्ट के साथ लेपित मोती सेते हैं।
    1. लगभग 5 के अनुपात मनका के लिए एक spheroplast का प्रयोग करें: 1। 4 × 10 9 स्फेरोप्लास्ट और 8 × 10 8 मोती एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़े।
      नोट: मान लें कि कोई कोशिकाओं, spheroplasting प्रक्रिया के दौरान खो गए थे इसलिए एकाग्रता अभी भी 1 × 10 10 स्फेरोप्लास्ट / एमएल है।
    2. 1 × पीबीएस 0.1% BSA के साथ जोड़े 4 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाने के लिए। 1 मिलीलीटर प्रत्येक के साथ चार 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में विभाज्य। 5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं जबकि धीरे घूर्णन।
  2. पीआरपोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए मनका बाध्य स्फेरोप्लास्ट epare।
    1. 3 मिनट के लिए चुंबक पर panning प्रतिक्रिया ट्यूबों रखें। pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें, और मनका बाध्य स्फेरोप्लास्ट चार बार बर्फ के साथ ठंड 1 × पीबीएस 0.1% BSA के साथ एक ही तरीके से 3.2.2.4 करने के लिए कदम 3.2.2.3 में वर्णित के रूप में धो लें। आसुत एच 2 ओ के 25 μl में प्रत्येक ट्यूब में मनका बाध्य स्फेरोप्लास्ट Resuspend -20 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों की दुकान या 4.3 चरण के लिए आगे बढ़ना।
  3. मनका बाध्य scFvs के लिए जीन युक्त plasmids बढ़ाना मनका बाध्य स्फेरोप्लास्ट पर पूरे प्लाज्मिड पीसीआर प्रदर्शन करना।
    1. निम्नलिखित दृश्यों के साथ प्राइमरों प्राप्त करें: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '(आगे प्राइमर) और 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (रिवर्स प्राइमर)।
      नोट: ये अंत करने के लिए अंत pIMD प्लाज्मिड के विपरीत किस्में पर (चित्रा 2) बाध्य होगा और pIMD की एक आम सुविधा के लिए पानी रखना करने के लिए तैयार कर रहे हैं, तो प्रवर्धन की परवाह किए बिना घटित होगाscFv संस्करण अनुक्रम।
    2. प्राइमरों phosphorylate।
      नोट: फोस्फोराइलेशन के बिना, फिर से बंधाव घटित नहीं होगा। प्राइमर भी बल्कि इस प्रोटोकॉल में इस फोस्फोराइलेशन विधि का उपयोग करने से, 5'-फोस्फोराइलेशन साथ आदेश दिया जा सकता है।
      1. एक 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में, आगे पीसीआर प्राइमर तालिका 1 में वर्णित के रूप में के लिए एक फोस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया की स्थापना की। रिवर्स प्राइमर के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
      2. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं। तब उन्हें 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते टी -4 polynucleotide kinase (PNK) को निष्क्रिय करने के लिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फोरिलेटेड प्राइमरों स्टोर।
    3. पीसीआर प्रदर्शन करना।
      1. एक पीसीआर ट्यूब में, पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार तालिका 2 में वर्णित है।
        नोट: एकाधिक प्रतिक्रियाओं अधिक उपज के लिए तैयार हो सकता है। अप्रयुक्त मनका बाध्य स्फेरोप्लास्ट -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      2. एक थर्मल cycler में 15 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं गर्मी पूर्ण सेल सुनिश्चित करने के लिए स्फेरोप्लास्ट की। थर्मल साइक्लर से ट्यूबों निकालें, और प्रत्येक के लिए एक उच्च निष्ठा पोलीमर्स के 0.5 μl जोड़ें। थर्मल साइक्लर ट्यूब लौटें और कार्यक्रम तालिका 3 में विस्तृत का उपयोग कर चलाते हैं।
      3. के रूप में उपयुक्त पीसीआर उत्पादों पूल। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या 4.4 कदम आगे बढ़ना।

तालिका 1 पी एन फोस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया (चरण 4.3.2.1)।

अभिकर्मक मात्रा (μl)
आसुत एच 2 ओ 15
10x टी -4 डीएनए ligase प्रतिक्रिया बफर 2
100 सुक्ष्ममापी प्राइमर 2
टी -4 polynucleotide kinase (PNK) 1
ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "के लिए: रखने के-साथ-next.within-पेज =" हमेशा "> तालिका 2 पूरे प्लाज्मिड पीसीआर प्रतिक्रिया (चरण 4.3.3.1)।

अभिकर्मक मात्रा (μl)
आसुत एच 2 ओ 28.5
5x उच्च निष्ठा पोलीमर्स बफर 10
10 माइक्रोन फॉस्फोरिलेटेड आगे प्राइमर 2.5
10 माइक्रोन फॉस्फोरिलेटेड रिवर्स प्राइमर 2.5
40 मिमी dNTP मिश्रण (10 मिमी प्रत्येक dNTP) 1
मनका बाध्य स्फेरोप्लास्ट 5

तालिका 3. पीसीआर कार्यक्रम (चरण 4.3.3.2)।

चरण तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय (मिनट: सेकंड) चक्रों की संख्या
प्रारंभिक denature 98 0:30 1
denature 98 0:10 35
एनीलिंग 69 0:30
एक्सटेंशन 72 00:30 केबी प्रति
अंतिम विस्तार 72 6:00 1
पकड़ 12 अनंत 1
  1. पुनः परिपत्र फेरना पूरे प्लाज्मिड पीसीआर उत्पादों, और MC4100 ई परिणत करने के लिए ligated उत्पाद का उपयोग कोलाई कोशिकाओं।
    1. एक agarose जेल 23 पर पीसीआर प्रतिक्रिया चल रहा है, जेल में 23 डीएनए धुंधला, और एक का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद शुद्धजेल सफाई किट निर्देश निर्माता द्वारा आपूर्ति का पालन करके linearized प्लाज्मिड शुद्ध करने के लिए। एकाग्रता उपाय 260 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग। -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध टुकड़ा स्टोर की जरूरत है जब तक, या 4.4.2 कदम के लिए जारी।
    2. पीसीआर उत्पाद से प्लाज्मिड पुनः परिपत्र फेरना।
      1. पीसीआर उत्पाद के आणविक बंधाव रोकने के लिए, एक कम एकाग्रता 1 एनजी / पीसीआर उत्पाद के μl के 27 के साथ बंधाव प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले। मात्रा इस एकाग्रता में एक 800 μl बंधाव प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए जरूरत की गणना।
      2. बर्फ पर बंधाव प्रतिक्रिया तैयार करें। एक ट्यूब में, मात्रा पीसीआर उत्पाद के चरण 4.4.2.1 में गणना, 10 × डीएनए ligase बफर के 80 μl, और आसुत एच 2 ओ 800 μl को जोड़ें। टी -4 डीएनए ligase के 4 μl जोड़ें, और तुरंत एक पानी के स्नान या थर्मल cycler में 16 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों की जगह। 14 से 18 घंटे के लिए 16 ° सीओ / एन सेते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर पूरा बंधाव प्रतिक्रियाओं स्टोरजब तक जरूरत है, या 4.4.3 कदम आगे बढ़ना।
    3. 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक पर बंधाव प्रतिक्रिया 15 मिनट के लिए जगह-गर्मी निष्क्रिय करने के लिए डीएनए ligase। फिर नमक डे के लिए ligated डीएनए एक microdialysis झिल्ली या डीएनए सफाई किट का उपयोग करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या 4.4.4 कदम आगे बढ़ना।
    4. MC4100 ई बदलने के लिए पूरे गर्मी निष्क्रिय, डे-नमकीन बंधाव उत्पाद का प्रयोग करें कोलाई कोशिकाओं 23। ग्लिसरॉल शेयरों, -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.3 चरण में वर्णित के रूप में जिसके परिणामस्वरूप panned sublibrary युक्त कोशिकाओं, और दुकान aliquots की, तैयार करें।
  2. अपनी संपूर्णता में दोहराएँ चरण 4 चरण 4.4.4 से एक विभाज्य का उपयोग कर sublibrary पर एक दूसरे पैनिंग करने के लिए।
    ध्यान दें: एक दूसरे पैनिंग पुस्तकालय घटक है कि लक्ष्य प्रतिजन 19 को अच्छी तरह से बाँध लिए समृद्ध मदद करता है।

5. एक माध्यमिक स्क्रीन प्रदर्शन करना एक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख विधि (चित्रा 5) का उपयोग करते हुए आगे लक्षण वर्णन के लिए आशाजनक क्लोन की पहचान करने के लिए </ P>

चित्रा 5
चित्रा 5. एलिसा आधारित माध्यमिक स्क्रीनिंग (चरण 5)। Sublibrary पैनिंग दौरान समृद्ध से (ए) लाइब्रेरी वेरिएंट विकास और अभिव्यक्ति के लिए एक संस्कृति की थाली के व्यक्तिगत कुओं में inoculated हैं। (बी) के एक एलिसा प्लेट लक्ष्य प्रतिजन के साथ लेपित है। (सी) पुस्तकालय वेरिएंट एलिसा आधारित माध्यमिक स्क्रीन प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग कर जांच कर रहे हैं। माध्यमिक स्क्रीन से प्राप्त आंकड़ों के विश्लेषण पर, ब्याज की वेरिएंट का चयन किया है और आगे की विशेषता है। प्रोटोकॉल कदम इसी रहे हैं उल्लेख किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. panned sublibrary और प्लेट लेग अगर प्लेटों पर (कदम 4.4.4 से) की एक ट्यूब गला लें। प्लेट कई dilutions(- करने के लिए 10 6 गुना dilutions जैसे, 10 2) काफी कम व्यक्तिगत कालोनियों सुनिश्चित करने के लिए सांद्रता में। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 से 18 घंटा के लिए प्लेटें सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों स्टोर या 5.2 कदम आगे बढ़ना।
  2. panned sublibrary से संस्कृति और प्रेरित कालोनियों। बाँझ शर्तों के तहत सभी चरणों का प्रदर्शन। 96 अच्छी तरह प्लेटें शामिल चरणों के लिए एक मल्टीचैनल pipettor का प्रयोग करें।
    1. एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुएं में 20 माइक्रोग्राम / एमएल सेमी के साथ लेग के 200 μl जोड़ें।
    2. , एक विंदुक टिप के साथ अगर थाली से एक व्यक्ति कॉलोनी उठाओ 96 अच्छी तरह से थाली के पहले अच्छी तरह से टिप जगह है, और धीरे टीका लगाना करने के लिए हलचल। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक नए सिरे का प्रयोग करें। प्रत्येक कुएं में एक कॉलोनी टीका लगाना। एक नियंत्रण के रूप में, कम से कम एक बाँझपन नियंत्रण में अच्छी तरह से साथ कोई कॉलोनी टीका शामिल हैं।
    3. दोहराएँ कदम 5.2.1 और 5.2.2 कई 96 अच्छी तरह प्लेटें टीका लगाना।
    4. 310 rpm पर एक microplate प्रकार के बरतन पर 96 अच्छी तरह प्लेटें रखें। 37 पर सेते6; 20 से 24 घंटा के लिए सी scFvs व्यक्त करने के लिए।
  3. कदम 5.2 में तैयार प्रत्येक संस्कृति की थाली, कोट लक्ष्य प्रतिजन के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए एलिसा।
    1. 1 × पीबीएस में एक उपयुक्त एकाग्रता (जैसे, 1 माइक्रोग्राम / एमएल 4 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए शुद्ध लक्ष्य प्रतिजन पतला कोटिंग समाधान बनाने के लिए। प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए कोटिंग समाधान के 5 मिलीलीटर बनाओ।
      ध्यान दें: उचित एकाग्रता विशिष्ट प्रतिजन इस्तेमाल किया जा रहा है पर निर्भर करता है और समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    2. एक 96 अच्छी तरह से उच्च बाध्यकारी स्पष्ट polystyrene एलिसा थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए कोटिंग समाधान के 50 μl जोड़ें। धीरे सुनिश्चित करना है कि हर अच्छी तरह से की पूरी सतह लेपित है benchtop सतह पर थाली नल। प्रत्येक प्लेट के लिए दोहराएँ। 4 डिग्री सीओ / एन प्लेटें सेते हैं।
  4. अगर प्लेट पर 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों से कालोनियों को दोहराने।
    1. एक बाँझ polystyrene replicator एक संस्कृति की थाली के कुओं में जगह liqu की एक छोटी राशि एकत्र करने के लिएआईडी। ध्यान से replicator बढ़ाने के लिए और एक 15 सेमी लेग अगर प्लेट को हस्तांतरण कि इस तरह के सभी सुझावों प्लेट को छू रहे हैं। एक बार तरल स्थानांतरित कर दिया है, replicator सीधे ऊपर उठा। प्रत्येक संस्कृति की थाली के लिए दोहराएँ।
    2. सही ओरिएंटेशन तो यह है कि 96 अच्छी तरह से थाली में माध्यमिक स्क्रीन से परिणाम, थाली पर सही दोहराया कॉलोनी के साथ मिलान किया जा सकता है, तो आगे लक्षण वर्णन वांछित है साथ अगर प्लेट लेबल। 15 से 18 घंटा के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर तक की जरूरत है।
  5. एलिसा माध्यमिक स्क्रीन प्रदर्शन करना।
    1. 2% कर रही है (डब्ल्यू / वी) 1 × पीबीएस में सूखे दूध द्वारा अवरुद्ध समाधान तैयार है। एलिसा प्लेटों से कोटिंग समाधान खाली। प्रत्येक अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान के 100 μl जोड़ें। कम से कम 2 घंटा, या ब्लॉक हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर लिए आरटी पर सेते हैं।
    2. 1 × पीबीएस में 0.05% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए polysorbate 20 जोड़कर धो बफर तैयार करें। एलिसा प्लेट प्रति 250 मिलीलीटर बनाओ।
    3. एक के 20 μl जोड़ेदौर नीचे संस्कृति की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित सेल डिटर्जेंट, और 15 से 20 मिनट के लिए आरटी पर एक microplate प्रकार के बरतन पर संस्कृति की थाली सेते हैं। एक ही समय है कि एलिसा प्लेटों के अवरुद्ध पूरा हो गया है, इसलिए है कि सेल और धोने कदम 5.5.4 समवर्ती किया जा सकता है पर सेल शुरू करो।
    4. एलिसा प्लेटों से अवरुद्ध समाधान खाली। अवरुद्ध एलिसा प्लेटें धोने प्रति अच्छी तरह से प्रति धोने बफर के 200 μl के साथ चार बार धोएं। कुओं से धो बफर खाली।
    5. एलिसा थाली की अच्छी तरह से इसी में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक नया टिप का उपयोग करने के लिए सेल की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 50 μl स्थानांतरण। 1 से 2 घंटे के लिए आरटी पर एलिसा थाली सेते हैं।
    6. बाध्य scFvs पता लगाने के लिए एंटीबॉडी समाधान तैयार है।
      1. का प्रयोग करें एक हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) प्राथमिक एंटीबॉडी कि झंडा मिलान टैग पुस्तकालय scFvs से जुड़े हुए को बांधता संयुग्मित।
      2. उचित कमजोर पड़ने के लिए एंटीबॉडी पतला (एक एलिसा में उपयोग आपूर्तिकर्ता & # देखने के लिए39 की सिफारिशें) 2% (डब्ल्यू 1 × पीबीएस में 0.05% polysorbate 20 में / वी) सूखा दूध। एक थाली के लिए 5 मिलीलीटर की तैयारी।
    7. चरण 5.5.4 में वर्णित के रूप में एलिसा प्लेटें धोने बफर के साथ चार बार धोएं।
    8. एलिसा थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एंटीबॉडी समाधान के 50 μl जोड़ें। आरटी पर 1 से 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    9. निर्माता प्रोटोकॉल प्रति आसुत एच ओ में -phenylenediamine dihydrochloride (ओपीडी) गोलियाँ भंग 2 हे जबकि प्रकाश से बचने के द्वारा एचआरपी सब्सट्रेट तैयार करें। एलिसा प्रति प्लेट 20 मिलीलीटर की तैयारी।
    10. आवश्यक के रूप में आसुत एच 2 ओ के साथ केंद्रित एच 2 अतः 4 गिराए द्वारा 3 महाराष्ट्र 2 अतः 4 तैयार करें। एलिसा प्लेट प्रति 5 एमएल तैयार करें।
      सावधानी: एच 2 अतः 4 एक मजबूत एसिड है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए सुनिश्चित करें।
    11. एलिसा प्लेटों चरण 5.5.4 में वर्णित है, धोने बफर के साथ चार बार धोएं।
    12. एचआरपी substra साथ एलिसा प्लेटें सेतेते।
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से एचआरपी सब्सट्रेट के 200 μl जोड़ें। प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए, एक समय में एक एलिसा थाली करने के लिए सब्सट्रेट जोड़ने के लिए, और अगले थाली करने के लिए आगे बढ़ने से पहले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटो। अंधेरे में आरटी पर 30 से 60 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं।
      2. पहले 30 मिनट के बाद, सब्सट्रेट का काला पड़ना के लिए प्लेटों की जांच, और अब सेते अगर रंग के विकास की कल्पना करने की जरूरत है।
    13. प्रतिक्रिया बुझाने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 3, महाराष्ट्र 2 अतः 4 के 50 μl जोड़ें। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक अलग टिप का उपयोग करना, धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कुओं में समाधान मिश्रण झाग के बिना। स्थिरता के लिए और संतृप्ति को रोकने के लिए, एच 2 अतः 4 जल्दी से और ध्यान से एलिसा प्लेटों के सभी के लिए पहले एक थाली के लिए समाधान मिश्रण में जोड़ें।
    14. 492 एनएम पर एक थाली के कुओं में समाधान के absorbance के उपाय एक प्लेट रीडर का उपयोग।
    15. absorbance के डेटा का विश्लेषण scFv कि exhib वेरिएंट की पहचान करने के लिएयह बाध्यकारी संकेतों का वादा किया है और इन होनहार scFvs विशेषताएँ। scFvs कि absorbance के संकेतों को पृष्ठभूमि संकेत की तुलना में अधिक है और एक थाली पर औसत संकेत दिखा रहे हैं की तुलना में अधिक का चयन करें।
      नोट: absorbance के स्तर प्रतिजन और विरोधी झंडा एंटीबॉडी के गुणों का इस्तेमाल किया, scFv वेरिएंट कि स्क्रीनिंग में अलग थे की ताकत के साथ-साथ पर निर्भर हो जाएगा।

Representative Results

Intracellular प्रोटीन तह ई में गूंथना मार्ग की गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र कोलाई प्रोटीन है कि अच्छी तरह से कम करने cytoplasmic वातावरण में जोड़ रहे हैं करने के लिए आंतरिक कोशिका झिल्ली भर में परिवहन की सीमा। SsTorA संकेत अनुक्रम (तोरा प्रोटीन है, जो स्वाभाविक रूप से गूंथना मार्ग 20 से ले जाया जाता है से संकेत अनुक्रम) के लिए एक scFv के एक संलयन overexpressing द्वारा, translocation ठप है, भीतर की झिल्ली 19 पर scFvs के प्रदर्शन में जिसके परिणामस्वरूप। बाहरी झिल्ली के enzymatic विघटन के बाद प्रदर्शित एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध कराया जाता है। ScFv प्रदर्शन के लिए गूंथना मार्ग का लाभ लेने की क्षमता कार्लसन एट अल द्वारा दिखाया गया था। 19 (चित्रा 6)। scFv एंटीबॉडी scFv13 और scFv13.R4 या तो मूल ssTorA अनुक्रम या एक संशोधित ssTorA कि arginine-arginine अवशेषों जोड़ी द्वारा मान्यता प्राप्त अभाव से जुड़े हुए थेगूंथना मार्ग। scFv13.R4 निर्देशित विकास के चार राउंड के माध्यम से scFv13 Martineau एट अल द्वारा इंजीनियर था। और कोशिका द्रव्य 9 में अच्छी तरह से गुना करने के लिए जाना जाता है। इस scFv भीतर की झिल्ली पर प्रदर्शित किया गया था, लेकिन चित्रा (6) केवल जब देशी ssTorA संकेत अनुक्रम को एक संलयन के रूप में व्यक्त किया। इसके विपरीत, scFv13 अच्छी तरह cytoplasmically जोड़ रहा है नहीं 9, तो यह भीतरी झिल्ली पर अच्छी तरह से प्रदर्शित नहीं किया जाता, संकेत अनुक्रम की परवाह किए बिना जो इसे जुड़े हुए है। इसके अलावा, यदि scFvs कोशिकाओं है कि TatC प्रोटीन, जैसे मशीनरी 20,28 के एक महत्वपूर्ण घटक कमी रह गई थी, प्रदर्शन भीतरी झिल्ली प्रदर्शन और गूंथना मार्ग के बीच महत्वपूर्ण कड़ी दिखा रहा है, नहीं मनाया गया में व्यक्त किया गया। ये परिणाम दिखाना है कि केवल प्रोटीन है कि जैसे संकेत पेप्टाइड होते हैं और कि सही ढंग से कोशिका द्रव्य में जोड़ रहे हैं भीतरी झिल्ली पर प्रदर्शित कर रहे हैं, intracellular fol के लिए एक स्क्रीन के रूप में कार्य करने के लिए गूंथना मार्ग के माध्यम से परिवहन की इजाजत दीडिंग।

चित्रा 6
चित्रा 6 भीतरी झिल्ली पर प्रदर्शित scFvs की जांच। प्रवाह cytometry विश्लेषण भीतर की झिल्ली पर खराब मुड़ा scFv13 और अच्छी तरह से मुड़ा हुआ scFv13.R4 के प्रदर्शन का पता लगाने के लिए किया गया था। scFvs मूल निवासी ssTorA या ssTorA (केके), जहां ssTorA अनुक्रम में Arg-Arg जोड़ी लिस-लिस करने के लिए संशोधित किया गया था के लिए जुड़े हुए थे। सी टर्मिनल scFvs पर झंडा मिलान टैग एक fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के साथ पाया गया विरोधी झंडा एंटीबॉडी संयुग्मित। TatC प्रोटीन (ΔtatC) और झंडा टैग के बिना ssTorA-scFv13 बिना कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में परीक्षण किया गया। एम मंझला प्रतिदीप्ति मूल्य इंगित करता है। अनुमति के साथ संदर्भ 19 से पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

19 में सुधार होगा। इस प्रदर्शन, एक त्रुटि प्रवण पीसीआर पुस्तकालय scFv13, जो β-galactosidase के लिए आत्मीयता के बंधन का स्तर कम है, के आधार पर प्रदर्शन का उपयोग और प्रोटोकॉल में वर्णित विधि पैनिंग लक्ष्य प्रतिजन β-galactosidase के खिलाफ सराहा। scFv 1-4 mutagenesis और पैनिंग में से एक दौर के बाद अलग-थलग, और बीटा-galactosidase को scFv13 (चित्रा 7A) की तुलना में और cytoplasmic घुलनशीलता के एक उच्च स्तर (चित्रा 7B) उच्च बंधन आत्मीयता प्रदर्शित किया गया था।

एक नए पुस्तकालय, scFv 1-4 के आधार पर, त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग किया गया था, और इस के खिलाफ दूसरी पीढ़ी के पुस्तकालय की panningβ-galactosidase वर्णित प्रोटोकॉल के एक संशोधन का उपयोग किया गया था। विकास के दूसरे दौर के लिए β-galactosidase के खिलाफ पैनिंग एक प्रतियोगी के रूप में शुद्ध, घुलनशील scFv 14 की उपस्थिति में किया गया था scFv 1-4 की तुलना में अधिक आत्मीयता के साथ क्लोन को अलग-थलग करने की संभावना में सुधार होगा। mutagenesis और पैनिंग के इस दूसरे दौर के बाद, scFv 2-1 और 2-3 scFv एलिसा आधारित माध्यमिक स्क्रीनिंग का उपयोग कर अलग कर दिया गया। ये scFvs केवल scFv13 से β-galactosidase के लिए उच्च बंधन संबंध नहीं प्रदर्शन किया, लेकिन यह भी पहले दौर क्लोन scFv 1-4 की तुलना में बेहतर बाध्यकारी प्रदर्शन किया। scFv 2-1 β-galactosidase scFv13.R4 (चित्रा 7A) के बराबर बाइंडिंग का प्रदर्शन किया। scFv 2-3 भी scFv 14 की तुलना में cytoplasmic घुलनशीलता में एक और वृद्धि से पता चलता घुलनशीलता और प्रतिजन बाध्यकारी के एक साथ इंजीनियरिंग पर प्रकाश डाला। चूंकि समानता और scFvs के घुलनशील अभिव्यक्ति एक साथ के लिए जांच कर रहे हैं, यह संभव है कि एक चयनित scFv आधुनिक गया हैerate घुलनशीलता लेकिन उच्च बंधन या इसके विपरीत। उदाहरण के लिए, scFv 2-1 scFv 2-3 की तुलना में कम घुलनशील अभिव्यक्ति है, लेकिन यह बीटा-galactosidase करने के लिए उच्च बंधन संबंध दर्शाती है।

चित्रा 7
चित्रा 7. लक्ष्य बाध्यकारी और scFv के cytoplasmic अभिव्यक्ति भीतरी झिल्ली प्रदर्शन का उपयोग कर अलग वेरिएंट। (ए) scFvs ई की कोशिका द्रव्य में व्यक्त किया गया एक hexahistidine (6 × -His) टैग के साथ कोलाई कोशिकाओं (जैसे।, ssTorA संकेत अनुक्रम के बिना) और निकल nitrilotriacetic एसिड स्पिन स्तंभों का उपयोग कर शुद्ध। शुद्ध scFvs के बंधन बीटा galactosidase करने के लिए एक एलिसा के साथ मापा गया था। शुद्ध scFvs β-galactosidase लेपित एलिसा प्लेटों पर भरी हुई थी, और बाध्य scFvs एक विरोधी 6 × -His एंटीबॉडी के साथ पाया गया। डेटा छह प्रतिकृति की एक औसत रहे हैं, और त्रुटि बार मतलब की मानक त्रुटि से पता चलता है।(बी) scFvs cytoplasmically एक पश्चिमी धब्बा एक विरोधी 6 × -His एंटीबॉडी के साथ जांच से विश्लेषण किया गया व्यक्त कोशिकाओं से सेल lysates के घुलनशील और अघुलनशील अंशों। कुल प्रोटीन एकाग्रता नमूनों की लोडिंग को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (ए) पुनर्प्रकाशित और अनुमति के साथ 19 से संदर्भ (बी) के लिए अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

Cytoplasmic गतिविधि के लिए एंटीबॉडी इंजीनियरिंग कोशिका द्रव्य, जो डाइसल्फ़ाइड बांड 6.7 स्थिर के गठन में बाधा उत्पन्न की कम करने के वातावरण के कारण एक मुश्किल काम है। यह सबसे एंटीबॉडी जब तक वे समानता के लिए बाध्य किया जा रहा करने के लिए इंजीनियर, स्थिरता और कोशिका द्रव्य में घुलनशीलता के लिए इंजीनियर हैं, इसके अलावा में cytoplasmically निष्क्रिय होने का कारण बनता है। फेज प्रदर्शन, बैक्टीरियल सतह प्रदर्शन, और खमीर सतह प्रदर्शन के तरीकों के मौजूदा तरीकों सब इंजीनियर एंटीबॉडी के प्रदर्शन के लिए स्रावी मार्ग 14-16 इस्तेमाल करते हैं, लेकिन इन तरीकों intracellular तह इंजीनियर को कोई मतलब है। भीतरी झिल्ली प्रदर्शन का उपयोग कर इंजीनियर एंटीबॉडी cytoplasmic स्थिरता और घुलनशीलता सुधार हुआ है क्योंकि गूंथना मार्ग की तह गुणवत्ता नियंत्रण एंटीबॉडी कि खराब मुड़ा और कोशिका द्रव्य में अस्थिर कर रहे हैं की translocation रोकता है। इस विधि आत्मीयता के एक इंजीनियरिंग के लिए intracellular एंटीबॉडी के चलने की प्रक्रिया को सरलएन डी घुलनशीलता, के रूप में दो गुण एक कदम में इंजीनियर हैं। हालांकि इस पद्धति को कम करने के intracellular वातावरण में घुलनशीलता साथ एंटीबॉडी इंजीनियरिंग के लिए डिजाइन किया गया था, यह भी गैर को कम करने की स्थिति में कार्य करने के बाद से प्रोटीन इस विधि periplasm का ऑक्सीकरण वातावरण में अपने तह बनाए रखने का उपयोग कर इंजीनियर इंजीनियरिंग एंटीबॉडी के लिए लागू किया जा सकता है।

हालांकि इस तकनीक उच्च आत्मीयता और उच्च cytoplasmic घुलनशीलता साथ एंटीबॉडी इंजीनियरिंग की प्रक्रिया को सरल, कई सीमाओं जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। जब माध्यमिक स्क्रीन एलिसा संकेतों का विश्लेषण करने का वादा किया है की पहचान करने के scFv वेरिएंट, संभावित दिलचस्प वेरिएंट और उन है कि पर्याप्त प्रतिजन बाध्यकारी प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं के बीच समझदार के लिए सीमा के बाद जब तक कई क्लोन आगे विशेषता किया गया है स्पष्ट होने की संभावना नहीं है। यह माता पिता के एंटीबॉडी से अधिक बाध्यकारी में सुधार के लिए देखने के लिए महत्वपूर्ण है; तथापि,एक असामान्य रूप से उच्च संकेत उत्सुकता 29 या एकत्रीकरण प्रभाव 30, एक चुनौती है जो भीतरी झिल्ली प्रदर्शन स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए अद्वितीय नहीं है का संकेत हो सकता है। एक प्रमुख सीमा याद है जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग panning के बाद स्फेरोप्लास्ट को ठीक करने में असमर्थता है, के रूप में वे अलाभकारी (अप्रकाशित डेटा) कर रहे हैं। इस एंटीबॉडी एन्कोडिंग plasmids ठीक करने के लिए डीएनए प्रवर्धन और परिवर्तन कदम जरूरी है।

प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण कदम तह और एंटीबॉडी के बंधन के एक साथ इंजीनियरिंग सक्षम करें। स्क्रीनिंग के सफल होने के लिए, scFv पुस्तकालय जांच की जा रही ssTorA संकेत पेप्टाइड को एक संलयन के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए। इस क्रम के बिना, एंटीबॉडी गूंथना मार्ग के लिए निर्देशित नहीं किया जाएगा और इस प्रकार periplasm से 19 translocated नहीं किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, यह जरूरी है कि एक सी टर्मिनल मिलान टैग एंटीबॉडी से जुड़े हुए है बिन में दिखाया गया है एंटीबॉडी का पता लगाने की अनुमतिडिंग assays। जाहिर है, ई कोलाई तनाव scFvs भी आवश्यक गूंथना मार्ग मशीनरी होनी चाहिए व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन यह आमतौर पर इस्तेमाल ई का सच है कोलाई उपभेदों।

इस प्रोटोकॉल में संशोधन वांछित विशेषताओं के साथ एंटीबॉडी को अलग-थलग करने के लिए अपनी क्षमता में सुधार करने के लिए संभव हो रहे हैं। एक subtractive पैनिंग कदम लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ पैनिंग गैर वांछित घटक के scFv पुस्तकालय ख़ाली करने से पहले पूरा किया जा सकता है। पुस्तकालय स्फेरोप्लास्ट एक गैर वांछित प्रोटीन के साथ अकेले या लेपित BCCP के साथ लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ incubated किया जा सकता है, और स्फेरोप्लास्ट कि उन मोतियों के लिए बाध्य वांछित लक्ष्य के लिए बाध्य करने के लिए शेष अपार स्फेरोप्लास्ट स्क्रीनिंग से पहले खारिज किया जा सकता है। के रूप में प्रतिनिधि परिणाम में उल्लेख किया है, एक पद्धति में सुधार करने के लिए एक अलग scFv की आत्मीयता पैनिंग प्रतिक्रिया में एक घुलनशील प्रतियोगी scFvs स्फेरोप्लास्ट पर प्रदर्शित साथ प्रतिस्पर्धा करने में शामिल करने के लिए है। क्योंकि घुलनशील कंप्यूटर अनुप्रयोगetitor, एक शुद्ध प्रोटीन है कोई डीएनए से यह परिलक्षित होता है, scFvs स्फेरोप्लास्ट पर प्रदर्शित की तो केवल दृश्यों पीसीआर प्रतिक्रिया में बरामद किया जाएगा। साथ ही, इस विधि एंटीबॉडी के या गैर एंटीबॉडी बाध्यकारी प्रोटीन के लिए अन्य प्रकार के इंजीनियरिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है।

ई कोलाई भीतरी झिल्ली प्रदर्शन उच्च आत्मीयता और intracellular घुलनशीलता के उच्च स्तर के साथ इंजीनियरिंग एंटीबॉडी के लिए एक शक्तिशाली मंच है। इस विधि को विशेष रूप से intracellular वातावरण में कार्य करने के लिए बनाया गया एंटीबॉडी के कुशल इंजीनियरिंग के लिए अनुकूल है। ये intracellular एंटीबॉडी पहले से ही खेतों की संख्या में संभावित चिकित्सा विज्ञान, neurodegenerative रोगों, कैंसर, और वायरल संक्रमण के 31 सहित के रूप में पता लगाया जा रहा है। इस तकनीक अनुसंधान और इन क्षेत्रों में चिकित्सा और किसी भी अन्य क्षेत्र है, जहां पढ़ाई बगल में एक प्रोटीन लक्ष्य वांछित है के लिए उपकरण के रूप में intracellular एंटीबॉडी के अधिक व्यापक उपयोग में सक्षम होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
scFv library Varies A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source.
MC4100 E. coli cells Coli Genetic Stock Center 6152 Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method.
Glycerol Fisher Scientific BP229-4
Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) BD 244610
Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358-1
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-500
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP9706-100
Sucrose Fisher Scientific BP220-1
Tris base Fisher Scientific BP1521
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M Fisher Scientific BP2482-500
Magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Lysozyme Sigma Aldrich L3790-10X1ML
Vortex mixer VWR 97043-564
Bicine Fisher Scientific BP2646100
D-Biotin Fisher Scientific BP232-1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher Scientific BP1755-1
BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) EMD Millipore 71456
Vivaspin 2 MWCO, 3,000 daltons GE Healthcare Sciences 28932240
Target antigen Varies N/A Purified target antigen may be purchased or produced/purified.
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen 65601
Dynamag-2 magnet Invitrogen 12321D
Tube rotator VWR 13916-822
PCR primers IDT N/A Primer sequences are as described in the protocol.
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England BioLabs B0202S
T4 Polynucelotide kinase (PNK) New England BioLabs M0201S Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. 
5x Phusion HF buffer pack New England BioLabs B0518S
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP New England BioLabs N0447L
Phusion DNA polymerase New England BioLabs M0530S Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted.
C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module Bio-Rad 185-1148
Agarose Promega V3121
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102
Wizard SV gel and PCR clean-up system Promega A9281
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
Microdialysis membrane filter EMD Millipore VSWP04700
Agar BD 214030
96-well polystyrene round-bottom cell culture plates VWR 10062-902
Costar general polystyrene assay plate lids Corning 3931
Microtitre plate shaker VWR 12620-926
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate Corning 3369
Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool Bel-Art Products 378760002
Instant nonfat dry milk Quality Biological A614-1000
Tween 20 (polysorbate 20) Fisher Scientific BP337-500
PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) EMD Millipore 71092-3
Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse Sigma Aldrich A8592
SigmaFast OPD Sigma Aldrich P9187-50SET
Sulfuric acid (H2SO4), 10 N solution Fisher Scientific SA200-1
Reynolds Wrap aluminum foil VWR 89079-075
BioTek Epoch microplate spectrophotometer Fisher Scientific 11120570

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References

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Moghaddam-Taaheri, P., Ikonomova, S. P., Gong, Z., Wisniewski, J. Q., Karlsson, A. J. Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments. J. Vis. Exp. (116), e54583, doi:10.3791/54583 (2016).

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