We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.
Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.
तह और intracellular वातावरण में कार्य करने में सक्षम एंटीबॉडी दोनों अनुसंधान और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए होनहार उपकरण हैं। वे कोशिकाओं के अंदर एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत रोकने प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत बाधित, या एंजाइमों 1-5 सब्सट्रेट उपयोग को रोकने के द्वारा प्रोटीन गतिविधि मिलाना करने की क्षमता है।
हालांकि एंटीबॉडी intracellular अनुप्रयोगों के लिए ज्यादा क्षमता है, उन्हें उचित तह और intracellular वातावरण में घुलनशीलता के लिए इंजीनियरिंग, जबकि लक्ष्य प्रतिजन के लिए बाध्य करने की क्षमता को बनाए रखने के चुनौतीपूर्ण है। को कम करने cytoplasmic पर्यावरण डाइसल्फ़ाइड बांड सामान्य रूप से पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी और एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) 6.7 एंटीबॉडी सहित एंटीबॉडी टुकड़े, के स्थिर मोड़ने के लिए आवश्यक के गठन से बचाता है। निर्देशित विकास के दृष्टिकोण के एक नंबर ज के साथ एंटीबॉडी इंजीनियर करने के लिए नियोजित किया गया हैलक्ष्य के लिए igh समानताएं 8-10 प्रतिजनों। इन तरीकों सामान्यतः फेज प्रदर्शन, खमीर सतह प्रदर्शन, या बैक्टीरियल सतह प्रदर्शन का उपयोग एंटीबॉडी 11-13 के बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए। इन तरीकों से शक्तिशाली और एंटीबॉडी कि लक्ष्यों के लिए बाध्य की पहचान करने के लिए प्रभावी रहे हैं, फिर भी वे स्रावी मार्ग पर निर्भर प्रोटीन है कि 14-16 प्रदर्शित किया जाएगा परिवहन के लिए। स्रावी मार्ग खमीर में या बैक्टीरिया में periplasm में जालिका लुमेन में कम करने कोशिका द्रव्य से सामने आया प्रोटीन translocates। प्रोटीन तो ऑक्सीकरण की शर्तों के तहत गुना और कोशिका की सतह पर प्रदर्शित या समानता 17,18 बाइंडिंग के लिए स्क्रीन करने के लिए फेज कणों में पैक कर रहे हैं। नतीजतन, इन तकनीकों का उपयोग कर अलग एंटीबॉडी जरूरी कोशिका द्रव्य में अच्छी तरह से गुना नहीं होगा, और intracellular घुलनशीलता अक्सर अलग से इंजीनियर किया जाना चाहिए एंटीबॉडी intracellular अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा।
सुधार करने के लिएइंजीनियरिंग एंटीबॉडी कि अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में जोड़ रहे हैं की क्षमता, हम पहले से पागल जाल (जोड़ प्रोटीन का गूंथना आधारित मान्यता के लिए झिल्ली लंगर प्रदर्शन) की सफलता, एक scFv एंटीबॉडी कोलाई inner- का उपयोग कर पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए एक विधि सूचना दी झिल्ली प्रदर्शन 19। बैक्टीरियल भीतरी झिल्ली प्रदर्शन दिखाया गया एंटीबॉडी के परिवहन, अन्य आम प्रदर्शन के तरीकों कि स्रावी मार्ग का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत के लिए जुड़वां arginine translocation (बुनना) मार्ग पर निर्भर करता है। गूंथना मार्ग एक गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र है कि केवल अनुमति देता है घुलनशील, सही ढंग से मुड़ा प्रोटीन ई से ले जाया जा रहा होता है कोलाई कोशिका द्रव्य, भीतरी झिल्ली के पार, और periplasm 20,21 में। Overexpressed गूंथना substrates (अर्थात्।, प्रोटीन जैसे संकेत पेप्टाइड ssTorA के लिए एक एन टर्मिनल संलयन के साथ गूंथना मार्ग को निशाना बनाया) है कि अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में जोड़ रहे हैं एक लंबे समय रहते translocation एन टर्मिनस के साथ मध्यवर्ती फार्म मैंn कोशिका द्रव्य और periplasm 19 में सी टर्मिनस। इस एंटीबॉडी टुकड़े सहित सही ढंग से मुड़ा गूंथना substrates, के प्रदर्शन की अनुमति देता है, ई की periplasmic चेहरे पर कोलाई भीतर की झिल्ली। Enzymatic पाचन द्वारा बाहरी झिल्ली को हटाने स्फेरोप्लास्ट उत्पन्न करने के बाद, एंटीबॉडी बाह्य अंतरिक्ष (चित्रा 1) के संपर्क में हैं। यह अनुमति देता है जैसे substrates के भीतर की झिल्ली पर प्रदर्शित एक विशेष लक्ष्य के लिए बाध्य करने के लिए जांच की जानी है। महत्वपूर्ण बात है, सेल सतह प्रदर्शन के लिए गूंथना मार्ग का दोहन सुनिश्चित करता है कि केवल पुस्तकालय में एंटीबॉडी कि अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में जोड़ रहे हैं बाध्यकारी, आत्मीयता और intracellular तह बाइंडिंग का एक साथ इंजीनियरिंग की अनुमति के लिए पूछताछ की जाएगी। इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे ई पर एक scFv पुस्तकालय को प्रदर्शित करने का वर्णन कोलाई भीतर की झिल्ली, एक लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ पुस्तकालय पैन, और पुस्तकालय की सबसे होनहार घटक की पहचान करने के लिए एक उच्च माध्यमिक स्क्रीन प्रदर्शन करते हैं। हम ध्यान केंद्रित करते हैं scFvs पर प्रोटोकॉल, विधि किसी भी प्रोटीन जिनके आवेदन बाध्यकारी और intracellular तह आवश्यकता इंजीनियरिंग के लागू हो सकता है।
चित्रा 1. गूंथना भीतरी झिल्ली प्रदर्शन ई। में कोलाई, scFv एंटीबॉडी कि ssTorA संकेत अनुक्रम को एक संलयन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं और सही ढंग से कोशिका द्रव्य में मुड़ा भीतरी झिल्ली भर में ले जाया जाता है। एक translocation मध्यवर्ती रूपों, जहां scFvs कोशिका द्रव्य में एन टर्मिनस और periplasm में सी टर्मिनस के साथ भीतरी झिल्ली में लंगर डाले हैं। ई कोलाई बाहरी झिल्ली enzymatically स्फेरोप्लास्ट के लिए फार्म पच जाता है, जिससे बाह्य अंतरिक्ष के लिए लंगर एंटीबॉडी को प्रकाश में लाने और एक एंटीबॉडी कि प्रदर्शित एंटीबॉडी पर सी-टर्मिनली इनकार मिलान टैग के लिए बांध का उपयोग करके उन्हें पता लगाने के लिए उपलब्ध कर रही है।लोड / 54583 / 54583fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Cytoplasmic गतिविधि के लिए एंटीबॉडी इंजीनियरिंग कोशिका द्रव्य, जो डाइसल्फ़ाइड बांड 6.7 स्थिर के गठन में बाधा उत्पन्न की कम करने के वातावरण के कारण एक मुश्किल काम है। यह सबसे एंटीबॉडी जब तक वे समानता के लिए बाध्य किया जा रहा करने के लिए इंजीनियर, स्थिरता और कोशिका द्रव्य में घुलनशीलता के लिए इंजीनियर हैं, इसके अलावा में cytoplasmically निष्क्रिय होने का कारण बनता है। फेज प्रदर्शन, बैक्टीरियल सतह प्रदर्शन, और खमीर सतह प्रदर्शन के तरीकों के मौजूदा तरीकों सब इंजीनियर एंटीबॉडी के प्रदर्शन के लिए स्रावी मार्ग 14-16 इस्तेमाल करते हैं, लेकिन इन तरीकों intracellular तह इंजीनियर को कोई मतलब है। भीतरी झिल्ली प्रदर्शन का उपयोग कर इंजीनियर एंटीबॉडी cytoplasmic स्थिरता और घुलनशीलता सुधार हुआ है क्योंकि गूंथना मार्ग की तह गुणवत्ता नियंत्रण एंटीबॉडी कि खराब मुड़ा और कोशिका द्रव्य में अस्थिर कर रहे हैं की translocation रोकता है। इस विधि आत्मीयता के एक इंजीनियरिंग के लिए intracellular एंटीबॉडी के चलने की प्रक्रिया को सरलएन डी घुलनशीलता, के रूप में दो गुण एक कदम में इंजीनियर हैं। हालांकि इस पद्धति को कम करने के intracellular वातावरण में घुलनशीलता साथ एंटीबॉडी इंजीनियरिंग के लिए डिजाइन किया गया था, यह भी गैर को कम करने की स्थिति में कार्य करने के बाद से प्रोटीन इस विधि periplasm का ऑक्सीकरण वातावरण में अपने तह बनाए रखने का उपयोग कर इंजीनियर इंजीनियरिंग एंटीबॉडी के लिए लागू किया जा सकता है।
हालांकि इस तकनीक उच्च आत्मीयता और उच्च cytoplasmic घुलनशीलता साथ एंटीबॉडी इंजीनियरिंग की प्रक्रिया को सरल, कई सीमाओं जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। जब माध्यमिक स्क्रीन एलिसा संकेतों का विश्लेषण करने का वादा किया है की पहचान करने के scFv वेरिएंट, संभावित दिलचस्प वेरिएंट और उन है कि पर्याप्त प्रतिजन बाध्यकारी प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं के बीच समझदार के लिए सीमा के बाद जब तक कई क्लोन आगे विशेषता किया गया है स्पष्ट होने की संभावना नहीं है। यह माता पिता के एंटीबॉडी से अधिक बाध्यकारी में सुधार के लिए देखने के लिए महत्वपूर्ण है; तथापि,एक असामान्य रूप से उच्च संकेत उत्सुकता 29 या एकत्रीकरण प्रभाव 30, एक चुनौती है जो भीतरी झिल्ली प्रदर्शन स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए अद्वितीय नहीं है का संकेत हो सकता है। एक प्रमुख सीमा याद है जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग panning के बाद स्फेरोप्लास्ट को ठीक करने में असमर्थता है, के रूप में वे अलाभकारी (अप्रकाशित डेटा) कर रहे हैं। इस एंटीबॉडी एन्कोडिंग plasmids ठीक करने के लिए डीएनए प्रवर्धन और परिवर्तन कदम जरूरी है।
प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण कदम तह और एंटीबॉडी के बंधन के एक साथ इंजीनियरिंग सक्षम करें। स्क्रीनिंग के सफल होने के लिए, scFv पुस्तकालय जांच की जा रही ssTorA संकेत पेप्टाइड को एक संलयन के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए। इस क्रम के बिना, एंटीबॉडी गूंथना मार्ग के लिए निर्देशित नहीं किया जाएगा और इस प्रकार periplasm से 19 translocated नहीं किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, यह जरूरी है कि एक सी टर्मिनल मिलान टैग एंटीबॉडी से जुड़े हुए है बिन में दिखाया गया है एंटीबॉडी का पता लगाने की अनुमतिडिंग assays। जाहिर है, ई कोलाई तनाव scFvs भी आवश्यक गूंथना मार्ग मशीनरी होनी चाहिए व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन यह आमतौर पर इस्तेमाल ई का सच है कोलाई उपभेदों।
इस प्रोटोकॉल में संशोधन वांछित विशेषताओं के साथ एंटीबॉडी को अलग-थलग करने के लिए अपनी क्षमता में सुधार करने के लिए संभव हो रहे हैं। एक subtractive पैनिंग कदम लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ पैनिंग गैर वांछित घटक के scFv पुस्तकालय ख़ाली करने से पहले पूरा किया जा सकता है। पुस्तकालय स्फेरोप्लास्ट एक गैर वांछित प्रोटीन के साथ अकेले या लेपित BCCP के साथ लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ incubated किया जा सकता है, और स्फेरोप्लास्ट कि उन मोतियों के लिए बाध्य वांछित लक्ष्य के लिए बाध्य करने के लिए शेष अपार स्फेरोप्लास्ट स्क्रीनिंग से पहले खारिज किया जा सकता है। के रूप में प्रतिनिधि परिणाम में उल्लेख किया है, एक पद्धति में सुधार करने के लिए एक अलग scFv की आत्मीयता पैनिंग प्रतिक्रिया में एक घुलनशील प्रतियोगी scFvs स्फेरोप्लास्ट पर प्रदर्शित साथ प्रतिस्पर्धा करने में शामिल करने के लिए है। क्योंकि घुलनशील कंप्यूटर अनुप्रयोगetitor, एक शुद्ध प्रोटीन है कोई डीएनए से यह परिलक्षित होता है, scFvs स्फेरोप्लास्ट पर प्रदर्शित की तो केवल दृश्यों पीसीआर प्रतिक्रिया में बरामद किया जाएगा। साथ ही, इस विधि एंटीबॉडी के या गैर एंटीबॉडी बाध्यकारी प्रोटीन के लिए अन्य प्रकार के इंजीनियरिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है।
ई कोलाई भीतरी झिल्ली प्रदर्शन उच्च आत्मीयता और intracellular घुलनशीलता के उच्च स्तर के साथ इंजीनियरिंग एंटीबॉडी के लिए एक शक्तिशाली मंच है। इस विधि को विशेष रूप से intracellular वातावरण में कार्य करने के लिए बनाया गया एंटीबॉडी के कुशल इंजीनियरिंग के लिए अनुकूल है। ये intracellular एंटीबॉडी पहले से ही खेतों की संख्या में संभावित चिकित्सा विज्ञान, neurodegenerative रोगों, कैंसर, और वायरल संक्रमण के 31 सहित के रूप में पता लगाया जा रहा है। इस तकनीक अनुसंधान और इन क्षेत्रों में चिकित्सा और किसी भी अन्य क्षेत्र है, जहां पढ़ाई बगल में एक प्रोटीन लक्ष्य वांछित है के लिए उपकरण के रूप में intracellular एंटीबॉडी के अधिक व्यापक उपयोग में सक्षम होगा।
The authors have nothing to disclose.
We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.
scFv library | Varies | N/A | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. |
MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
10X T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
5X Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
Agarose | Promega | V3121 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
Agar | BD | 214030 | |
96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |