Introduction
Antikroppar med förmåga att vikning och fungera i den intracellulära miljön är lovande verktyg för både forskning och terapeutiska tillämpningar. De har förmågan att modulera proteinaktivitet genom att binda till ett målprotein inuti celler för att förhindra protein-protein interaktioner och störa protein-nukleinsyra-interaktioner, eller förhindra substrat tillgång till enzymer 1-5.
Även om antikroppar har stor potential för intracellulära tillämpningar, ingenjörs dem för korrekt veckning och löslighet i den intracellulära miljön under bibehållande av förmågan att binda till ett målantigen är en utmaning. Den reducerande cytoplasmatiska miljö förhindrar bildandet av disulfidbindningarna som normalt krävs för den stabila vikningen av fullängds antikroppar och antikroppsfragment, inklusive variabelt fragment (scFv) enkelkedjiga antikroppar 6,7. Ett antal riktad evolution tillvägagångssätt har använts för att konstruera antikroppar med hIgH affinitet för målantigen 8-10. Dessa metoder använder ofta fagdisplay, jäst yta display, eller bakterieytan displayen för att screena stora bibliotek av antikroppar 11-13. Dessa metoder är kraftfulla och effektiva för att identifiera antikroppar som binder till mål, men de är beroende av den sekretoriska vägen för att transportera proteiner som kommer att visas 14-16. Den sekretoriska vägen translokerar ovikta proteiner från den reducerande cytoplasman i endoplasmanätet lumen i jäst eller i periplasman i bakterier. De proteiner veckas därefter under oxiderande betingelser och visas på cellytan eller förpackas i fagpartiklar för att screena för bindningsaffinitet 17,18. Som ett resultat kommer antikroppar isolerade med hjälp av dessa tekniker inte nödvändigtvis viker väl i cytoplasman, och intracellulär löslighet måste ofta konstruerad separat om antikropparna kommer att användas i intracellulära tillämpningar.
Att förbättraeffektiviteten i ingenjörs antikroppar som är väl vikta i cytoplasman, vi tidigare rapporterat framgången för MAD-TRAP (membran-förankrad display för Tat-baserade erkännande av associerande proteiner), ett förfarande för screening av ett scFv antikroppsbibliotek med användning av Escherichia coli inner- membran display 19. Bakteriella innermembranet display förlitar sig på twin-arginin sloka (Tat) -vägen för transport av uttryckta antikroppar, till skillnad från andra vanliga visningsmetoder som använder den sekretoriska vägen. Tat pathway innehåller en kontrollmekanism kvalitet som bara tillåter lösliga, korrekt veckade proteiner som skall transporteras från E. coli cytoplasman, över det inre membranet, och in i periplasman 20,21. Överuttryckta Tat substrat (dvs., Proteiner riktade till Tat pathway med en N-terminal fusion till Tat-signalpeptiden ssTorA) som är väl vikta i cytoplasman bildar en långlivad slokamellanprodukten med N-terminalen in cytoplasman och C-terminalen i periplasman 19. Detta möjliggör visning av korrekt veckade Tat substrat, inklusive antikroppsfragment på det periplasmatiska ytan av E. coli inre membranet. Efter avlägsnande av yttre membranet genom enzymatisk digerering för att generera sfäroplaster används antikroppar exponeras för det extracellulära utrymmet (Figur 1). Detta medger Tat substraten som visas på det inre membranet som ska screenas för bindning till ett specifikt mål. Viktigt är att utnyttja Tat vägen för cellytan display säkerställer att endast de antikroppar i biblioteket som är väl vikta i cytoplasman kommer att förhöras för bindning, vilket gör samtidig konstruktion av affinitet och intracellulär vikning. I detta protokoll, beskriver vi hur du vill visa en scFv bibliotek på E. coli inre membran, panorera biblioteket mot ett målantigen, och utför en sekundär skärmen för att identifiera de mest lovande beståndsdelarna i biblioteket. Medan vi fokuserar protokollet om scFv kan metoden tillämpas på ingenjörs något protein vars tillämpning kräver bindande och intracellulär vikning.
Figur 1. Tat innermembran display. I E. coli, är scFv-antikroppar som är uttryckta som en fusion till den ssTorA signalsekvensen och korrekt veckade i cytoplasman transporteras över det inre membranet. En translokamellanformer, där scFv är förankrade i det inre membranet med N-terminalen i cytoplasman och C-terminalen i periplasman. E. coli yttre membran är enzymatiskt digererad för att bilda sfäroplaster, därigenom exponerande de förankrade antikroppar mot det extracellulära utrymmet och göra dem tillgängliga för detektering genom användning av en antikropp som binder till den C-terminalt smält epitopmärkning på den visade antikroppen.belastning / 54.583 / 54583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
1. Förbered scFv bibliotek som en fusion till ssTorA Signal Sequence
- Erhålla en deoxiribonukleinsyra (DNA) bibliotek innehållande varianter av en scFv-gen.
OBS: Biblioteket kan också konstrueras med användning av någon lämpligt läge för att generera mångfalden över hela scFv genen eller riktade domäner 22 (t.ex. den tredje komplementaritetsbestämmande regionerna, CDR3.). - Infoga DNA-biblioteket in i pimd plasmiden (Figur 2) med användning av standardmässiga molekylärkloningsmetoder 23.
OBS: Denna plasmid uttrycker scFv: n som en genetisk fusion till ssTorA-signalsekvensen (N-terminalt till scFv) och FLAG-epitopen tag (C-terminalen till scFv). Utformningen av plasmid för inre membranet display har beskrivits tidigare 19. Den pimd plasmiden är tillgänglig från författarna.
Figur 2. Inner-membran display plasmid (pimd) map (steg 1.2 via 1,3). Denna plasmid innehåller en lac-promotorn, ColE1 replikationsursprung, och en kloramfenikolresistens-gen. Den insatta scFv-genen fuseras till ssTorA signalsekvensen att rikta den scFv till Tat pathway och en FLAG-epitop-tagg, med alla tre i samma läsram. Restriktionsenzymställen är indikerade. För ett bibliotek införas mellan Xbal och NotI restriktionsenzymställen, storleken på plasmiden är 2219 bp plus storleken på scFv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Omvandla plasmid DNA innehållande biblioteket i MC4100 E. coli-celler 23. Återhämta sig och växa denna bakterieformen av biblioteket. Centrifugera vid 4000 x g under 15 min vid RT för att samla upp cellerna. Avlägsna supernatanten och återsuspendera de uppsamlade cellernai 25% glycerol i Luria-Bertani (LB) media. Förvara alikvoter vid -80 ° C tills det behövs, eller gå vidare till steg 2.
OBS: Protokollet har verifierats med MC4100 celler, men andra E. coli-stammar förväntas också vara kompatibelt med protokollet. Elektroporering är den föredragna metoden för transformation, på grund av dess höga transformationseffektivitet. Biblioteket bör normalt bestå av minst 10 9 scFv-varianter i detta skede, och varje alikvot bör innehålla tillräckligt med celler på så sätt att biblioteket är täckt 100-faldigt.
2. Uttryck biblioteket och förbereda sfäroplaster
- Tina en alikvot av bakterie bibliotek (från steg 1,3) vid RT, och lägg portionen till en kolv innehållande 100 ml LB-medium med 20 mikrogram / ml kloramfenikol (Cm). Växa under 3 h vid 37 ° C och 225 rpm i en inkuberade shaker.
- Efter 3 timmar, ta bort kolven från 37 ° C inkuberade shaker. Tillåta uttryck av scFv-bibliotek för attfortsätt O / N för 15 till 22 timmar vid 20 ° C och 225 rpm i en inkuberade shaker.
OBS: Ingen inducerare behövs när du använder pimd plasmiden, som promotorn är läckande. Observera att MC4100 celler inte överuttrycker Lac repressor (och LacI inte hittas på plasmiden).
Figur 3. E. coli-celler och sfäroplaster. (A) E. coli-celler är cylindriska till formen. (B) Efter spheroplasting använder EDTA och lysozym, det yttre membranet hos E. coli-celler bryts, och de resulterande sfäroplasterna är sfäriska till formen. Differentialinterferenskontrast (DIC) mikroskopiska bilder erhölls med användning av ett 100X mål på ett inverterat mikroskop. Vänligen cslicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbered biblioteket sfäroplaster.
OBS: Sfäroplaster bildas genom bristning det yttre membranet hos E. coli och är sfäriska till formen (Figur 3).- Förbereda de nödvändiga buffertar.
OBS: Alla buffertar bör vara sterila.- Förbereda en × fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH 7,4) genom att lösa 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, och 0,24 g KH 2 PO 4 i destillerat H2O till en slutvolym av 1000 ml. Håll på is.
- Förbereda PBS med 0,1% (vikt / volym) bovint albumin serum (BSA) genom att lösa upp 0,2 g BSA till 200 ml 1 x PBS. Håll på is.
- Förbereda fraktioneringsbuffert (FB) genom att blanda 7,5 ml sterilfiltrerad 1 M sackaros, 1 ml av en M Tris-buffert (pH 8,0), och 1,5 ml destillerat H2O Håll på is.
- Förbereda en mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) genom tillsats av 30 | il of 0,5 M EDTA till 14,97 ml destillerat H2O
- Förbereda 0,5 M MgCl2 genom att lösa 4,76 g MgCl 2 i 100 ml destillerat H2O Håll på is.
- Ta ut kolven ur skakapparaten och mät den optiska densiteten (OD) vid 600 nm med användning av en spektrofotometer för att bestämma celldensitet. Beräkna volymen av inducerad kultur behövs så att varje prov för spheroplasting har 1 x 10 10 celler.
OBS: approximation av en OD 600 av en som indikerar en koncentration av 10 9 celler / ml för E. coli kan användas 24. - Centrifugera den beräknade volymen av inducerad kultur i en 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 12.000 x g vid RT under 5 min. Bered minst två prov i händelse av att ett problem uppstår i provberedning.
- Avlägsna supernatanten från de centrifugerade kulturerna och resuspendera varje cellpelleten i 100 | il iskall FB. Centrifugera vid 12.000 xg vid RT under 1 minut, och sedan avlägsna supernatanten genom pipettering. Resuspendera varje pelleten i 350 | il iskall FB kompletterat med 3,5 pl 10 mg / ml lysozym.
- Långsamt Vortexa varje rör under tillsats, droppvis, 700 | il av 1 mM EDTA, och sedan inkubera rören vid RT under 20 min medan långsamt roterar på ett rör rotator för att blanda proverna. Avlägsna rören från rotatorn, tillsätt 50 | il iskall 0,5 M MgCl2 till varje rör, och inkubera dem på is under 10 min. Centrifugera rören vid 11000 x g vid 4 ° C under 10 min.
- Isolera sferoplast pelleten.
- Använd en mikropipett med en 1 ml tips att långsamt dra upp en del av pellets. Medan du håller röret vid en vinkel med öppningen direkt ovanför ett nytt 1,5 ml rör, lyft långsamt pipettspetsen ur supernatanten och skjut pelleten in i nytt rör.
- Om en betydande del av supernatanten överförs till den nya röret, ta bort den genom att pipettera. Om pelleten inte är fast enough att överföra, åter centrifugera vid 11.000 x g under 2 minuter och försök pellets isolering igen.
- Suspendera sfäroplast pelleten i varje rör i 1 ml iskall 1 x PBS. Växla mellan pipettering och långsamt vortexa på en virvelhållaren tills pelleten är helt återsuspenderas. Förvara inte prover från isen under mer än två minuter åt gången, och återvänder till isen i minst fem minuter innan du tar bort från isen igen. Hålla sfäroplasterna vid 4 ° C (för upp till 2 dagar) tills den användes för vaskning i Steg 4.
- Förbereda de nödvändiga buffertar.
3. Immobilisera målantigenet på magnetiska pärlor
- Biotinylera målantigenet in vivo under rekombinant produktion i E. coli-celler. Alternativt kan du använda kemisk konjugering 25 eller köp målantigen som redan har biotinylerad, och fortsätt till steg 3,2.
- Lägg 816 g bicin till 50 ml vatten för att göra 10 × bicinbuffert. Späd buffer till 1 × i destillerat H2O och värme till 50 ° C. Lägga 14,7 mg biotin till 12 ml av den uppvärmda 1 × bicinbuffert att göra en biotin lösning som är 5 mM biotin i 10 mM bicinbuffert. Förvara vid -20 ° C tills det behövs.
- Uttrycka och biotinylera målproteinet använder pAK400cb-BCCP plasmid 26, som tillåter framställning av målantigenet som en fusion till den biotin-bärarprotein (BCCP).
OBS: E. coli-celler native biotinylera BCCP, vilket eliminerar behovet att rena och kemiskt biotinylera målproteinet före immobilisering på streptavidinbelagda pärlor. Personen E. coli biotin-ligas BirA är tillräcklig för biotinylering av fusionsproteinet.- Växa E. coli innehållande biotinylering plasmiden (med målantigenet infogas som en fusion till N-terminalen av BCCP) O / N för 15 till 18 h i 5 ml LB-medium kompletterat med 20 | ig / ml Cm vid 37 ° C under skakning vid 225 rpm.
- Mät OD vid 600 nm med en spektrofotometer och beräkna volymen av kulturen behövs (V tillägg) till subkultur vid en start OD av 0,05 i 25 ml färskt LB-medium med 20 mikrogram / ml Cm med hjälp av ekvationen: V lägga = (0,05 × 25 ml) / (OD 600 till 0,05), där OD 600 är den optiska densiteten för O / N-kulturen och V add är volymen av O / N-kulturen för att lägga till den färska LB. Subkultur och växa till en OD på 0,5 till 0,8 i en inkuberades skakanordning vid 37 ° C och 225 rpm.
- Lägg isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid till en slutkoncentration av 100 pM och biotin till en slutlig koncentration av 5 ^ M. Inducera uttryck i ett inkuberade shaker i 15 till 22 timmar vid 20 ° C och 225 rpm.
- Skörd bakterier genom centrifugering vid 4000 x g vid 4 ° C under 10 min. Avlägsna supernatanten. Lagra pelleten vid -20 ° C tills redo för användning.
- Lägg till1 ml av en cell-lys detergent per 0,2 g cellpellet. Resuspendera genom pipettering och försiktigt rotera under 20 min för att lysera cellerna. Efter lys, centrifugera vid 16.000 x g och 4 ° C under 20 min. Pipettera det lösliga lysatet (supernatant) in i ett nytt 1,5 ml rör.
- Använd en 3 kDa molekylviktgräns kolonn för att avlägsna det obundna biotin. Pipettera lysatet in i kolonnen, och centrifugera vid 20 ° C enligt tillverkarens instruktioner. Tvätta med 1 × PBS tills biotin i lysatet har spätts ut 100-faldigt och volymen av den tvättade lysatet är lika med den ursprungliga volymen av lysatet. Överför lysatet till ett nytt rör.
- Immobilisera biotinylerade målantigenet på streptavidinbelagda magnetiska pärlor.
- Förbereda en × PBS och 1 × PBS med 0,1% (vikt / volym) BSA såsom beskrivs i steg 2.3.1.
- Förbereda de magnetiska pärlorna.
OBS: Detta kräver användning av en magnetisk separation rack.- Resuspendera streptavIDIN belagda magnetiska pärlor i sin originalflaska. Antingen virvel minst 30 sek eller rotera under 5 min.
- Överför 7-10 × 10 9 pärlor till ett 1,5 ml rör.
OBS: Den volym som behövs kommer att vara beroende på pärlan koncentration som levereras av tillverkaren. - Placera röret innehållande de pärlor på magneten rack under 2 min för att samla pärlorna på sidan av röret. Med röret fortfarande på magneten, försiktigt bort supernatanten genom pipettering utan att störa pärlorna.
- Att tvätta bort röret från magneten och resuspendera pärlorna i 1 ml 1 x PBS genom att pipettera utan att generera bubblor. Återgå röret till magneten under 2 minuter för att samla pärlorna, och försiktigt bort supernatanten genom att pipettera. Upprepa processen två gånger till för totalt tre tvättar. Säkerställa att ingen vätska finns kvar i röret efter den sista tvätten.
- Lägg lysatet innehållande biotinylerat antigen till den magnetiska beads.
- Ta bort röret från magneten och resuspendera pärlorna i 1 ml lysat (från steg 3.1.5). Inkubera vid rumstemperatur under 30 min under försiktig rotation.
- Placera röret på magneten under 3 min för att samla in de antigenbelagda pärlor. Tvätta de belagda pärlorna fem gånger med 1 x PBS med 0,1% BSA på samma sätt som beskrivits i steg 3.2.2.3 till 3.2.2.4. Efter den slutliga tvätten, resuspendera kulorna i en × PBS med 0,1% BSA till samma volym som används i steg 3.2.2.2.
- Om det immobiliserade målantigenet är stabilt vid 4 ° C, lagra de belagda pärlorna vid 4 ° C tills det behövs för panorering. Annars går du vidare till steg 4.
4. Skärm scFv bibliotek genom att panorera mot målantigenet (Figur 4)
Figur 4. Panning (steg 4). Antigen-belagda magnetiska pärlor are inkuberades med sfäroplaster uttrycker antikroppsbibliotek varianter. Plasmid-DNA från pärlbundna sfäroplaster återvinns och används för att generera en underbibliotek, som silas med användning av ELISA-baserade sekundära screeningen. Motsvarande protokollsteg noteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Inkubera de belagda pärlorna med sfäroplaster.
- Använda en sfäroplast till vulst förhållande av ca 5: 1. Tillsätt 4 × 10 9 sfäroplaster och 8 x 10 8 pärlor till ett sterilt 15 ml rör.
OBS: Antag att inga celler förlorades under spheroplasting process, så att koncentrationen är fortfarande 1 x 10 10 sfäroplaster / ml. - Lägg 1 × PBS med 0,1% BSA för att bringa den totala volymen till 4 ml. Alikvot i fyra 1,5 ml rör med en ml vardera. Inkubera reaktionerna vid 4 ° C under 5 h under försiktig rotation.
- Använda en sfäroplast till vulst förhållande av ca 5: 1. Tillsätt 4 × 10 9 sfäroplaster och 8 x 10 8 pärlor till ett sterilt 15 ml rör.
- prepare bead bundna sfäroplaster för polymeraskedjereaktion (PCR).
- Placera panorering reaktionsrören på magneten för 3 minuter. Avlägsna supernatanten genom pipettering, och tvätta pärlbundna sfäroplaster fyra gånger med iskall 1 × PBS med 0,1% BSA på samma sätt som beskrivits i steg 3.2.2.3 till 3.2.2.4. Resuspendera pärlbundna sfäroplaster i varje rör i 25 | il destillerat H2O Förvara pärlorna vid -20 ° C eller gå vidare till steg 4,3.
- Utför hela-plasmiden PCR på pärla bundna sfäroplaster att förstärka plasmider innehållande generna för pärla bundna scFv.
- Erhålla primers med följande sekvenser: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 (framåtriktad primer) och 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3 "(omvänd primer).
OBS: Dessa kommer att binda end-to-end på motsatta strängar av pimd plasmiden (Figur 2) och är utformade för att hybridisera till ett vanligt inslag i pimd, så förstärkning kommer att ske oberoende avscFv variantsekvens. - Fosforylera primrarna.
OBS: Utan fosforylering, re-ligering sker inte. Primers kan också beställas med 5'-fosforylering, istället för att använda denna fosforylering metod i detta protokoll.- I en 0,5 ml-rör, skapa en fosforyleringsreaktionen för den framåtriktade PCR-primer såsom beskrivs i Tabell 1. Upprepa denna process för den omvända primern.
- Inkubera reaktioner vid 37 ° C under 1 timme. Därefter inkubera dem vid 65 ° C under 20 min för att inaktivera T4-polynukleotidkinas (PNK). Förvara fosforylerade primers vid -20 ° C.
- Utföra PCR.
- I ett PCR-rör, förbereda PCR-reaktionen som beskrivs i tabell 2.
OBS: Flera reaktioner kan vara förberedda för högre avkastning. De oanvända pärlbundna sfäroplaster kan lagras vid -20 ° C. - Värm PCR-reaktionema vid 98 ° C under 15 min i en termocykler för att garantera full lys av sfäroplasterna. Ta bort rören från termocykeln och lägga 0,5 pl av en high fidelity-polymeras till varje. Returrören till termocyklern och kör med användning av programmet i detalj i tabell 3.
- Pool PCR-produkterna som är lämpligt. Förvara vid -20 ° C eller gå vidare till steg 4,4.
- I ett PCR-rör, förbereda PCR-reaktionen som beskrivs i tabell 2.
- Erhålla primers med följande sekvenser: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 (framåtriktad primer) och 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3 "(omvänd primer).
Tabell 1. PNK fosforyleringsreaktionen (steg 4.3.2.1).
| Reagens | Volym (il) |
| Destillerat H2O | 15 |
| 10x T4 DNA-ligas reaktionsbuffert | 2 |
| 100 | iM primer | 2 |
| T4-polynukleotidkinas (PNK) | 1 |
| Reagens | Volym (il) |
| Destillerat H2O | 28,5 |
| 5x Hi-fi-polymerasbuffert | 10 |
| 10 | iM Fosforylerad framåtriktad primer | 2,5 |
| 10 | iM Fosforylerad omvänd primer | 2,5 |
| 40 mM dNTP-blandning (10 mM av varje dNTP) | 1 |
| Pärlbundna sfäroplaster | 5 |
Tabell 3. PCR-program (steg 4.3.3.2).
| Steg | Temperatur (° C) | Tid (min: sek) | Antal cykler |
| initial denaturering | 98 | 00:30 | 1 |
| Denaturera | 98 | 00:10 | 35 |
| glödgning | 69 | 00:30 | |
| Förlängning | 72 | 00:30 per kb | |
| slutlig förlängning | 72 | 06:00 | 1 |
| Håll | 12 | Oändlig | 1 |
- Åter cirkularisera hela-plasmid PCR-produkter, och använda den ligerade produkten för att transformera MC4100 E. coli-celler.
- Rena PCR-produkten genom att köra PCR-reaktionen på en agarosgel 23, färgning av DNA i gelén 23, och med användning av engel rensning kit för att rena ariserade plasmiden genom att följa instruktionerna från tillverkaren. Mäta koncentrationen med användning av en spektrofotometer vid 260 nm. Förvara renade fragmentet vid -20 ° C tills det behövs, eller fortsätta till steg 4.4.2.
- Åter cirkularisera plasmiden från PCR-produkten.
- För att förhindra intermolekylär ligering av PCR-produkten, utför ligeringsreaktionen med en låg koncentration 27 av 1 ng / | il av PCR-produkt. Beräkna den volym som behövs för framställning av en 800 | j, l ligeringsreaktion vid denna koncentration.
- Förbereda ligeringsreaktionen på is. I ett rör, tillsätt volymen beräknas i steg 4.4.2.1 av PCR-produkten, 80 | il av 10 x DNA-ligasbuffert, och destillerat H2O upp till 800 | j, l. Tillsätt 4 | il av T4 DNA-ligas, och omedelbart placera rören vid 16 ° C i ett vattenbad eller termisk cykelapparat. Inkubera vid 16 ° CO / N i 14 till 18 timmar. Förvara de färdiga ligeringsreaktioner vid -20 ° Ctills det behövs, eller vidare till steg 4.4.3.
- Placera ligeringsreaktionen på ett värmeblock vid 65 ° C under 15 min för att värma-inaktivering av DNA-ligas. Använd sedan en mikrodialysmembran eller DNA rensning kit för att de-salt det ligerade DNA. Förvara vid 20 ° C eller gå vidare till steg 4.4.4.
- Använd hela värmeinaktiverat, de saltade ligeringsprodukten att omvandla MC4100 E. coli-celler 23. Förbereda glycerolstamlösningar, såsom beskrivs i steg 1,3, av de celler som innehåller den resulterande panoreras underbibliotek, och lagra alikvoter vid -80 ° C.
- Upprepa steg 4 i sin helhet genom att använda en alikvot från steg 4.4.4 att göra en andra vaskning på underbibliotek.
OBS: En andra panorering hjälper anrika biblioteks beståndsdelar som binder väl till målantigenet 19.
5. Gör en sekundär skärm användning av en enzymbunden immunosorbentanalys metod för att identifiera lovande kloner för ytterligare karakterisering (Figur 5) </ P>
Figur 5. ELISA-baserad sekundär screening (steg 5). (A) BIBLIOTEK varianter från underbibliotek anrikat under panorering inokuleras i individuella brunnar i en odlingsplatta för tillväxt och uttryck. (B) En ELISA-platta belagd med målantigen. (C) biblioteks varianterna screenas med hjälp av ELISA-baserade sekundära skärm som beskrivs i protokollet. Vid analys av data från den sekundära skärmen, är varianter av intresse väljs och kännetecknas vidare. Motsvarande protokollsteg noteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Tina ett rör av den panoreras underbibliotek (från steg 4.4.4) och plattan på LB-agarplattor. Plate flera utspädningarvid koncentrationer som är tillräckligt låga för att garantera individuella kolonier (t.ex. 10 2 - 10 6-faldig utspädningar). Inkubera plattorna under 15 till 18 h vid 37 ° C. Förvara plattorna vid 4 ° C eller gå vidare till steg 5,2.
- Kultur och inducerar kolonier från panoreras underbibliotek. Utför alla stegen under sterila förhållanden. Använda en flerkanalspipett för steg som involverar 96-brunnars plattor.
- Tillsätt 200 | il LB med 20 | ig / ml Cm i varje brunn i en rundbottnad 96-brunnars odlingsplatta.
- Plocka en individuell koloni från agarplattan med en pipettspets, placera spetsen i den första brunnen av 96-brunnar, och försiktigt rör för inokulering. Använd en ny spets för varje brunn. Ympa en koloni i varje brunn. Som en kontroll, åtminstone en sterilitetskontrollbrunnen utan koloni ympades.
- Upprepa steg 5.2.1 och 5.2.2 för att inokulera flera 96-brunnars plattor.
- Placera de 96-brunnsplattor på en mikroskakanordning vid 310 rpm. Inkubera vid 376; C under 20 till 24 timmar för att uttrycka scFv.
- För varje odlingsplatta som framställts i steg 5,2, päls en 96-brunnars ELISA-platta med målantigenet.
- Utspädd renad målantigen till en lämplig koncentration (t.ex. 1 | ig / ml till 4 | j, g / ml) i 1 x PBS för att göra beläggningslösningen. Gör 5 ml beläggningslösning för varje 96-brunnsplatta.
OBS: Den lämpliga koncentrationen beror på den specifika antigen som används och kan behöva justeras. - Tillsätt 50 pl av beläggningslösningen till varje brunn i en 96-brunnars hög bindande klar polystyren ELISA-platta. Knacka försiktigt plattan på bänk yta för att säkerställa att hela ytan av varje brunn är belagd. Upprepa för varje platta. Inkubera plattorna vid 4 ° CO / N.
- Utspädd renad målantigen till en lämplig koncentration (t.ex. 1 | ig / ml till 4 | j, g / ml) i 1 x PBS för att göra beläggningslösningen. Gör 5 ml beläggningslösning för varje 96-brunnsplatta.
- Replikera kolonier från 96-brunnars odlingsplattor på agarplattor.
- Placera en steril polystyren replikator i brunnar i en odlingsplatta för att samla in en liten mängd flytande tvid. Lyft försiktigt replikatorn och överför till en 15 cm LB-agarplatta så att alla tips vidrör plattan. När vätskan har överfört, lyft replika rakt upp. Upprepa för varje odlingsplatta.
- Märka agarplatta med korrekt orientering, så att resultaten från den sekundära skärm i 96-brunnar kan matchas med den korrekta replike koloni på plattan, om ytterligare karakterisering önskas. Växa vid 37 ° C under 15 till 18 timmar, och sedan lagra vid 4 ° C tills det behövs.
- Utföra ELISA sekundära screeningen.
- Förbereda den blockerande lösningen genom att göra 2% (vikt / volym) torrmjölk i 1 × PBS. Tömma beläggningslösningen från ELISA-plattorna. Tillsätt 100 pl av den blockerande lösningen till varje brunn. Inkubera vid rt under minst 2 h, eller blockera O / N vid 4 ° C.
- Bered tvättbufferten genom att tillsätta polysorbat 20 till en slutlig koncentration av 0,05% i en × PBS. Gör 250 ml per ELISA-platta.
- Tillsätt 20 | il av enkoncentrerad cellys detergent till varje brunn i den rundbottnade odlingsplatta, och inkubera odlingsplattan på en mikro skakare vid RT under 15 till 20 min. Börjar lys samtidigt som blockering av ELISA-plattor är komplett så som kan utföras lys och tvätt Steg 5.5.4 samtidigt.
- Tömma blockerande lösningen från ELISA-plattorna. Tvätta de blockerade ELISA-plattor fyra gånger med 200 pl tvättbuffert per brunn per tvätt. Töm tvättbufferten från brunnarna.
- Överför 50 ul från varje brunn i cellys plattan till motsvarande brunn i ELISA-plattan, med hjälp av en ny spets för varje brunn. Inkubera ELISA-plattan vid RT under 1 till 2 h.
- Förbered antikroppslösningen för att detektera bundna scFv.
- Använda en pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad primär antikropp som binder till FLAG-epitopen markör fuserad till biblioteket scFv.
- Späd antikroppen till den lämpliga spädningen för användning i en ELISA (se leverantör & #39; s rekommendationer) i 2% (vikt / volym) torrmjölk i 0,05% polysorbat 20 i en × PBS. Förbered 5 ml för varje platta.
- Tvätta ELISA-plattorna fyra gånger med tvättbuffert såsom beskrivits i steg 5.5.4.
- Tillsätt 50 pl av antikropplösningen till varje brunn i ELISA-plattan. Inkubera under 1 till 2 h vid RT.
- Förbered HRP-substrat genom upplösning av o-fenylendiamin (OPD) tabletter i destillerat H2O per tillverkarens protokoll och samtidigt undvika ljus. Förbered 20 ml per ELISA-platta.
- Förbereda 3 MH 2 SO 4 genom att späda koncentrerad H 2 SO 4 med destillerat H2O vid behov. Förbered 5 ml per ELISA-platta.
Försiktighet: H 2 SO 4 är en stark syra. Var noga med att bära lämplig personlig skyddsutrustning. - Tvätta ELISA-plattorna fyra gånger med tvättbuffert, såsom beskrivits i steg 5.5.4.
- Inkubera ELISA-plattorna med HRP substrate.
- Tillsätt 200 pl av HRP-substrat till varje brunn. För att minimera ljusexponering, lägga substratet till en ELISA-platta i taget, och linda med aluminiumfolie innan man går vidare till nästa platta. Inkubera plattorna under 30 till 60 min vid RT i mörker.
- Efter den första 30 min, ta plattorna under mörkfärgning av substratet, och inkubera längre om så behövs för att visualisera utveckla färg.
- Tillsätt 50 pl av 3 MH 2 SO 4 till varje brunn för att stoppa reaktionen. Användning av en annan spets för varje brunn, blanda lösningen i brunnarna genom att försiktigt pipettera upp och ned utan skumning. För överensstämmelse och för att förhindra mättning, tillsätt H 2 SO 4 snabbt och noggrant till alla de ELISA-plattor före blandning av lösningen för varje platta.
- Mät absorbansen hos lösningen i brunnarna i varje platta vid 492 nm med användning av en plattläsare.
- Analysera absorbansvärdena data för att identifiera scFv varianter som Exhibdet lovande bindande signaler och karakterisera dessa lovande scFv. Välj scFv som uppvisar absorbansenheter signaler högre än bakgrundssignalen och högre än den genomsnittliga signal på varje platta.
OBS: Absorbansen nivån kommer att vara beroende på egenskaperna hos antigenet och anti-FLAG-antikropp som används, tillsammans med styrkan av de scFv-varianterna som isolerades i screeningen.
Representative Results
Den intracellulära kvalitetskontroll mekanismen hos Tat pathway i E. proteinveckning coli begränsar transport över inre cellmembranet till proteiner som är väl vikta i den reducerande cytoplasmatiska miljön. Genom att överuttrycka en fusion av en scFv till ssTorA signalsekvensen (signalsekvensen från tora-proteinet, vilket naturligtvis transporteras av Tat pathway 20), är transloka avstannat, vilket resulterar i visning av scFv: n på det inre membranet 19. Efter enzymatisk sönderdelning av det yttre membranet är de uttryckta antikroppar görs tillgängliga för screening med avseende på antigenbindande aktivitet. Förmågan att dra nytta av Tat vägen för scFv display visades av Karlsson et al. 19 (figur 6). ScFv antikropparna scFv13 och scFv13.R4 fusionerades till antingen den nativa ssTorA sekvens eller en modifierad ssTorA som saknar arginin-argininresten par erkänns avTat-reaktionsvägen. scFv13.R4 var konstruerad av Martineau et al. från scFv13 genom fyra rundor av riktad evolution och är känd för att vika väl i cytoplasman 9. Denna scFv visades på det inre membranet, men endast när den uttrycks som en fusion med den nativa ssTorA signalsekvensen (Figur 6). I motsatts är scFv13 inte väl vikta cytoplasmatiskt 9, så det visas inte väl på det inre membranet, oberoende av signalsekvensen till vilken den är fuserad. Dessutom, om scFv uttrycktes i celler som saknade TatC protein, en viktig del av maskinen Tat 20,28, display observerades inte, visar det viktiga sambandet mellan inre membran displayen och Tat vägen. Dessa resultat visar att endast proteiner som innehåller Tat-signalpeptiden och som är korrekt veckat i cytoplasman visas på det inre membranet, vilket möjliggör transport genom Tat pathway att fungera som en skärm för intracellulär folding.
Figur 6. Detektion av visade scFv på det inre membranet. Flödescytometrianalys utfördes för att detektera visning av dåligt vikta scFv13 och väl vikta scFv13.R4 på det inre membranet. scFv: n fusionerad till nativt ssTorA eller ssTorA (KK), där Arg-Arg paret i ssTorA sekvensen modifierades till Lys-Lys. De C-terminala FLAG epitop-taggar på de scFv: n detekterades med ett fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerad anti-FLAG-antikropp. Celler utan den TatC proteinet (ΔtatC) och ssTorA-scFv13 utan FLAG-märkning testades som kontroller. M indikerar medianfluorescensvärdet. Utdrag ur referens 19 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
19. För att demonstrera detta, en felbenägen PCR bibliotek baserat på scFv13, som har en låg nivå av bindningsaffinitet för β-galaktosidas, vaskades mot målantigenet β-galaktosidas med hjälp av displayen och panorering metod beskrivs i protokollet. scFv 1-4 isolerades efter en omgång av mutagenes och panorering, och uppvisade högre bindningsaffinitet till P-galaktosidas än scFv13 (figur 7A) och en högre nivå av cytoplasmisk löslighet (Figur 7B).
Ett nytt bibliotek, baserat på scFv 1-4, framställdes med användning felbenägen PCR, och panorering av denna andra generationens bibliotek motβ-galaktosidas utfördes med användning av en modifiering av det beskrivna protokollet. Panorering mot β-galaktosidas för den andra omgången av utveckling skedde i närvaro av renat, lösligt scFv 14 som en konkurrent för att förbättra sannolikheten för att isolera kloner med högre affinitet än scFv 1-4. Efter denna andra omgång av mutagenes och panorering, var scFv 2-1 och scFv 2-3 isolerades med användning av ELISA-baserade sekundär screening. Dessa scFv inte bara uppvisade högre affinitet för β-galaktosidas än scFv13, men också uppvisade bättre bindning än den första omgången klon scFv 1-4. scFv 2-1 uppvisade β-galaktosidas-bindning jämförbar med den hos scFv13.R4 (figur 7A). scFv 2-3 visar också en ytterligare ökning av cytoplasma löslighet jämfört med scFv 14, belyser samtidig konstruktion av löslighet och antigenbindande. Eftersom affinitet och löslig uttryckning av scFv screenas för att samtidigt, är det möjligt att en vald scFv har modrera löslighet men hög bindnings eller vice versa. Till exempel, har scFv 2-1 lägre löslig uttryckning än scFv 2-3, men den uppvisar högre bindningsaffinitet till p-galaktosidas.
Figur 7. Mål-bindande och cytoplasmisk expression av scFv varianter isoleras med hjälp av innermembran display. (A) scFv uttrycktes i cytoplasman av E. coli-celler (t ex., utan ssTorA signalsekvensen) med en hexahistidin (6 x His) tag och renas med hjälp av nickel-nitrilotriättiksyra spin-kolonner. Bindningen av de renade scFv till p-galaktosidas mättes med en ELISA. Renade scFv: n laddades på β-galaktosidas-belagda ELISA-plattor, och de bundna scFv: n detekterades med en anti-6 × His antikropp. Uppgifterna är ett genomsnitt av sex replikat, och felet stapeln visar standardfelet av medelvärdet.(B) De lösliga och olösliga fraktionerna av cellysaten från celler som uttrycker scFv cytoplasmatiskt analyserades med en Western blöt sonderades med en anti-6 × His antikropp. Total proteinkoncentration användes för att normalisera laddningen av proverna. Omtryckt (A) och anpassad (B) från referens 19 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Engineering antikroppar för cytoplasmisk aktivitet är en svår uppgift på grund av den reducerande miljön i cytoplasman, vilket hindrar bildandet av stabiliserande disulfidbindningar 6,7. Detta orsakar de flesta antikroppar att vara cytoplasmatiskt inaktiv om de inte är konstruerade för stabilitet och löslighet i cytoplasman, förutom att vara konstruerad för bindningsaffinitet. De befintliga metoderna för fagdisplay, bakterieytan display, och jäst yta display metoder använder alla den sekretoriska vägen 14-16 för visning av manipulerade antikroppar, men dessa metoder har ingen möjlighet att konstruera intracellulär vikning. Antikroppar manipulerade med hjälp av innermembran display har förbättrad cytoplasma stabilitet och löslighet eftersom fällbara kvalitetskontroll av Tat vägen förhindrar translokation av antikroppar som är dåligt vikta och instabila i cytoplasman. Denna metod förenklar iterativ process av tekniska intracellulära antikroppar för affinitets ennd löslighet, eftersom de två fastigheterna är konstruerade i ett steg. Även om denna metod var avsedd för ingenjörs antikroppar med löslighet i den reducerande intracellulära miljön, kan det även tillämpas på ingenjörs antikroppar för att fungera i icke-reducerande betingelser, eftersom proteinerna engineered med den här metoden bevarar deras vikning i den oxiderande miljön i periplasman.
Även om denna teknik förenklar processen att konstruera antikroppar med hög affinitet och hög cytoplasmisk löslighet, flera begränsningar är viktigt att tänka på när du använder detta protokoll. Vid analys av de sekundära skärm ELISA-signaler för att identifiera lovande scFv varianter, är tröskeln för kräsna mellan potentiellt intressanta varianter och de som inte kan uppvisa tillräcklig antigenbindande inte sannolikt att vara uppenbara förrän efter flera kloner har ytterligare karakteriserats. Det är viktigt att leta efter förbättrad bindning över moderantikroppen; dock,en onormalt hög signal kan tyda på affinitet 29 eller aggregering effekter 30, en utmaning som inte är unikt för innermembran display screening. En viktig begränsning att komma ihåg när man använder detta protokoll är oförmågan att återvinna sfäroplaster efter vaskning, eftersom de är icke-livskraftiga (opublicerade data). Detta gör det nödvändigt att DNA-förstärkning och omvandlingssteg för att återvinna antikropps kodar plasmider.
Flera kritiska stegen i protokollet möjliggör samtidig konstruktion av vikning och bindning av antikroppar. För screening för att bli framgångsrik, måste scFv bibliotek som screenas uttryckas som en fusion till ssTorA signalpeptiden. Utan denna sekvens, kommer antikroppar inte att dirigeras till Tat pathway och således inte kommer att translokeras till periplasman 19. Dessutom är det absolut nödvändigt att en C-terminal epitop-taggen är fuserad till antikropparna för att möjliggöra detektion av de uttryckta antikroppar på lagerplatsending analyser. Tydligt, E. coli-stam som används för att uttrycka scFv måste också ha de nödvändiga Tat väg maskiner, men detta gäller för de vanligaste E. coli-stammar.
Ändringar i detta protokoll är möjligt att förbättra sin förmåga att isolera antikroppar med de önskade egenskaperna. En subtraktiv vask steget kan vara avslutad före panorering mot målantigenet att utarma scFv bibliotek av icke-önskade beståndsdelar. Biblioteks sfäroplaster kan inkuberas med magnetiska pärlor belagda med BCCP enbart eller belagd med ett icke-önskat protein, och sfäroplasterna som binder till dessa pärlor kan kasseras innan screening de återstående obundna sfäroplaster för bindning till det önskade målet. Som nämnts i Representativa resultat, en metod att förbättra affiniteten hos en isolerad scFv är att inkludera en löslig konkurrent i panorering reaktion konkurrera med scFv visas på sfäroplasterna. Eftersom den lösliga kompetitor är ett renat protein, inget DNA amplifieras från den, så att endast sekvenser av de scFv: n som visas på sfäroplasterna kommer att återvinnas i PCR-reaktionen. Dessutom kan denna metod utvidgas till ingenjörs andra typer av antikroppar eller till icke-antikroppsbindningsproteiner.
E. coli innermembran displayen är en kraftfull plattform för ingenjörs antikroppar med hög affinitet och höga nivåer av intracellulär löslighet. Denna metod är särskilt lämpad för effektiv konstruktion av antikroppar avsedda att fungera i den intracellulära miljön. Dessa intracellulära antikroppar redan utforskas som potentiella läkemedel inom en rad områden, bland annat neurodegenerativa sjukdomar, cancer och virusinfektioner 31. Denna teknik gör det möjligt för en mer utbredd användning av intracellulära antikroppar som verktyg för forskning och medicin inom dessa områden och andra områden där studerar ett protein mål på plats önskas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| scFv library | Varies | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. | |
| MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
| Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
| Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
| D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
| BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
| Vivaspin 2 MWCO, 3,000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
| Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
| Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
| PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
| T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
| 5x Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
| Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
| C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
| Agar | BD | 214030 | |
| 96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
| Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
| Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
| Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
| Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
| SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
| Sulfuric acid (H2SO4), 10 N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
| Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
| BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |
References
- Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies. Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).
- Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy. Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).
- Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family. J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).
- Mhashilkar, A. M., et al. Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies. Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).
- Strube, R. W., Chen, S. Y. Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies. J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).
- Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs. J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).
- Wörn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).
- Knappik, A., Plückthun, A. Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding. Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).
- Martineau, P., Jones, P., Winter, G. Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm. J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).
- Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain. J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).
- Daugherty, P. S.
- Lener, M., et al. Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies. Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).
- Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity. J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).
- Gai, S. A., Wittrup, K. D. Yeast surface display for protein engineering and characterization. Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).
- Kieke, M. C., et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).
- Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display. Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).
- Pugsley, A. P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).
- Rapoza, M. P., Webster, R. E. The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane. J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).
- Karlsson, A. J., et al. Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins. J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).
- DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).
- Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway. Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).
- Maynard, J., Georgiou, G.
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--the database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Third, Elsevier/Academic Press. (2013).
- Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production. J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).
- Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells. Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).
- Bogsch, E. G., et al. An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).
- Julian, M. C., et al. Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies. Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).
- Garber, K.
- Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies. MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).
