We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.
Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.
Antikroppar med förmåga att vikning och fungera i den intracellulära miljön är lovande verktyg för både forskning och terapeutiska tillämpningar. De har förmågan att modulera proteinaktivitet genom att binda till ett målprotein inuti celler för att förhindra protein-protein interaktioner och störa protein-nukleinsyra-interaktioner, eller förhindra substrat tillgång till enzymer 1-5.
Även om antikroppar har stor potential för intracellulära tillämpningar, ingenjörs dem för korrekt veckning och löslighet i den intracellulära miljön under bibehållande av förmågan att binda till ett målantigen är en utmaning. Den reducerande cytoplasmatiska miljö förhindrar bildandet av disulfidbindningarna som normalt krävs för den stabila vikningen av fullängds antikroppar och antikroppsfragment, inklusive variabelt fragment (scFv) enkelkedjiga antikroppar 6,7. Ett antal riktad evolution tillvägagångssätt har använts för att konstruera antikroppar med hIgH affinitet för målantigen 8-10. Dessa metoder använder ofta fagdisplay, jäst yta display, eller bakterieytan displayen för att screena stora bibliotek av antikroppar 11-13. Dessa metoder är kraftfulla och effektiva för att identifiera antikroppar som binder till mål, men de är beroende av den sekretoriska vägen för att transportera proteiner som kommer att visas 14-16. Den sekretoriska vägen translokerar ovikta proteiner från den reducerande cytoplasman i endoplasmanätet lumen i jäst eller i periplasman i bakterier. De proteiner veckas därefter under oxiderande betingelser och visas på cellytan eller förpackas i fagpartiklar för att screena för bindningsaffinitet 17,18. Som ett resultat kommer antikroppar isolerade med hjälp av dessa tekniker inte nödvändigtvis viker väl i cytoplasman, och intracellulär löslighet måste ofta konstruerad separat om antikropparna kommer att användas i intracellulära tillämpningar.
Att förbättraeffektiviteten i ingenjörs antikroppar som är väl vikta i cytoplasman, vi tidigare rapporterat framgången för MAD-TRAP (membran-förankrad display för Tat-baserade erkännande av associerande proteiner), ett förfarande för screening av ett scFv antikroppsbibliotek med användning av Escherichia coli inner- membran display 19. Bakteriella innermembranet display förlitar sig på twin-arginin sloka (Tat) -vägen för transport av uttryckta antikroppar, till skillnad från andra vanliga visningsmetoder som använder den sekretoriska vägen. Tat pathway innehåller en kontrollmekanism kvalitet som bara tillåter lösliga, korrekt veckade proteiner som skall transporteras från E. coli cytoplasman, över det inre membranet, och in i periplasman 20,21. Överuttryckta Tat substrat (dvs., Proteiner riktade till Tat pathway med en N-terminal fusion till Tat-signalpeptiden ssTorA) som är väl vikta i cytoplasman bildar en långlivad slokamellanprodukten med N-terminalen in cytoplasman och C-terminalen i periplasman 19. Detta möjliggör visning av korrekt veckade Tat substrat, inklusive antikroppsfragment på det periplasmatiska ytan av E. coli inre membranet. Efter avlägsnande av yttre membranet genom enzymatisk digerering för att generera sfäroplaster används antikroppar exponeras för det extracellulära utrymmet (Figur 1). Detta medger Tat substraten som visas på det inre membranet som ska screenas för bindning till ett specifikt mål. Viktigt är att utnyttja Tat vägen för cellytan display säkerställer att endast de antikroppar i biblioteket som är väl vikta i cytoplasman kommer att förhöras för bindning, vilket gör samtidig konstruktion av affinitet och intracellulär vikning. I detta protokoll, beskriver vi hur du vill visa en scFv bibliotek på E. coli inre membran, panorera biblioteket mot ett målantigen, och utför en sekundär skärmen för att identifiera de mest lovande beståndsdelarna i biblioteket. Medan vi fokuserar protokollet om scFv kan metoden tillämpas på ingenjörs något protein vars tillämpning kräver bindande och intracellulär vikning.
Figur 1. Tat innermembran display. I E. coli, är scFv-antikroppar som är uttryckta som en fusion till den ssTorA signalsekvensen och korrekt veckade i cytoplasman transporteras över det inre membranet. En translokamellanformer, där scFv är förankrade i det inre membranet med N-terminalen i cytoplasman och C-terminalen i periplasman. E. coli yttre membran är enzymatiskt digererad för att bilda sfäroplaster, därigenom exponerande de förankrade antikroppar mot det extracellulära utrymmet och göra dem tillgängliga för detektering genom användning av en antikropp som binder till den C-terminalt smält epitopmärkning på den visade antikroppen.belastning / 54.583 / 54583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Engineering antikroppar för cytoplasmisk aktivitet är en svår uppgift på grund av den reducerande miljön i cytoplasman, vilket hindrar bildandet av stabiliserande disulfidbindningar 6,7. Detta orsakar de flesta antikroppar att vara cytoplasmatiskt inaktiv om de inte är konstruerade för stabilitet och löslighet i cytoplasman, förutom att vara konstruerad för bindningsaffinitet. De befintliga metoderna för fagdisplay, bakterieytan display, och jäst yta display metoder använder alla den sekretoriska vägen 14-16 för visning av manipulerade antikroppar, men dessa metoder har ingen möjlighet att konstruera intracellulär vikning. Antikroppar manipulerade med hjälp av innermembran display har förbättrad cytoplasma stabilitet och löslighet eftersom fällbara kvalitetskontroll av Tat vägen förhindrar translokation av antikroppar som är dåligt vikta och instabila i cytoplasman. Denna metod förenklar iterativ process av tekniska intracellulära antikroppar för affinitets ennd löslighet, eftersom de två fastigheterna är konstruerade i ett steg. Även om denna metod var avsedd för ingenjörs antikroppar med löslighet i den reducerande intracellulära miljön, kan det även tillämpas på ingenjörs antikroppar för att fungera i icke-reducerande betingelser, eftersom proteinerna engineered med den här metoden bevarar deras vikning i den oxiderande miljön i periplasman.
Även om denna teknik förenklar processen att konstruera antikroppar med hög affinitet och hög cytoplasmisk löslighet, flera begränsningar är viktigt att tänka på när du använder detta protokoll. Vid analys av de sekundära skärm ELISA-signaler för att identifiera lovande scFv varianter, är tröskeln för kräsna mellan potentiellt intressanta varianter och de som inte kan uppvisa tillräcklig antigenbindande inte sannolikt att vara uppenbara förrän efter flera kloner har ytterligare karakteriserats. Det är viktigt att leta efter förbättrad bindning över moderantikroppen; dock,en onormalt hög signal kan tyda på affinitet 29 eller aggregering effekter 30, en utmaning som inte är unikt för innermembran display screening. En viktig begränsning att komma ihåg när man använder detta protokoll är oförmågan att återvinna sfäroplaster efter vaskning, eftersom de är icke-livskraftiga (opublicerade data). Detta gör det nödvändigt att DNA-förstärkning och omvandlingssteg för att återvinna antikropps kodar plasmider.
Flera kritiska stegen i protokollet möjliggör samtidig konstruktion av vikning och bindning av antikroppar. För screening för att bli framgångsrik, måste scFv bibliotek som screenas uttryckas som en fusion till ssTorA signalpeptiden. Utan denna sekvens, kommer antikroppar inte att dirigeras till Tat pathway och således inte kommer att translokeras till periplasman 19. Dessutom är det absolut nödvändigt att en C-terminal epitop-taggen är fuserad till antikropparna för att möjliggöra detektion av de uttryckta antikroppar på lagerplatsending analyser. Tydligt, E. coli-stam som används för att uttrycka scFv måste också ha de nödvändiga Tat väg maskiner, men detta gäller för de vanligaste E. coli-stammar.
Ändringar i detta protokoll är möjligt att förbättra sin förmåga att isolera antikroppar med de önskade egenskaperna. En subtraktiv vask steget kan vara avslutad före panorering mot målantigenet att utarma scFv bibliotek av icke-önskade beståndsdelar. Biblioteks sfäroplaster kan inkuberas med magnetiska pärlor belagda med BCCP enbart eller belagd med ett icke-önskat protein, och sfäroplasterna som binder till dessa pärlor kan kasseras innan screening de återstående obundna sfäroplaster för bindning till det önskade målet. Som nämnts i Representativa resultat, en metod att förbättra affiniteten hos en isolerad scFv är att inkludera en löslig konkurrent i panorering reaktion konkurrera med scFv visas på sfäroplasterna. Eftersom den lösliga kompetitor är ett renat protein, inget DNA amplifieras från den, så att endast sekvenser av de scFv: n som visas på sfäroplasterna kommer att återvinnas i PCR-reaktionen. Dessutom kan denna metod utvidgas till ingenjörs andra typer av antikroppar eller till icke-antikroppsbindningsproteiner.
E. coli innermembran displayen är en kraftfull plattform för ingenjörs antikroppar med hög affinitet och höga nivåer av intracellulär löslighet. Denna metod är särskilt lämpad för effektiv konstruktion av antikroppar avsedda att fungera i den intracellulära miljön. Dessa intracellulära antikroppar redan utforskas som potentiella läkemedel inom en rad områden, bland annat neurodegenerativa sjukdomar, cancer och virusinfektioner 31. Denna teknik gör det möjligt för en mer utbredd användning av intracellulära antikroppar som verktyg för forskning och medicin inom dessa områden och andra områden där studerar ett protein mål på plats önskas.
The authors have nothing to disclose.
We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.
scFv library | Varies | N/A | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. |
MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
10X T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
5X Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
Agarose | Promega | V3121 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
Agar | BD | 214030 | |
96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |