Introduction
신진 효모의 포자 형성은 감수 분열 (1), 유전자 재조합 2의 메커니즘 (3) 세포 신호에 의해 발전의 제어, 개발 4의 영양 관리, 전사시 염색체 분리의 제어를 포함 생물학의 여러 측면, 통찰력을 제공하기 위해 연구되고있다 개발 5의 규제 및 포자 형성 (6)의 시험. 포자 형성 보호 포자 벽 (6)의 증착에 이어 머더 셀 내의 새로운 멤브레인 구획의 형성을 포함하는 신규 한 세포 분열 이벤트를 포함한다. 포자 세포 검사 이러한 연구들은 상대적으로 효율적인 방식으로 7,8- 약 24 시간에 포자 형성 과정을 거칠 수있는 급속 포자 효모 SK1, 활용. 효모 신진 포자 조건의 최적화는 9-13,이 실험 설명되었지만S는 고체 배지 또는 포자를 배양 튜브 또는 플라스크를 사용하여 수행되는 대규모의 액체 배양 물에서 포자를 조사 하였다.
여기에서 우리는 96 멀티 웰 플레이트 형식으로 효모 포자하는 방법을 설명합니다. 우리는이 방법에 대해, 통기 동기와 효율적인 포자 형성에 중요한 것을 발견하고, 작은 볼륨 멀티 웰 형식으로 충분한 포자 형성을 보장하기 위해 기술을 고안했다. 세포는 높은 처리량 기술과 바둑판 라이브러리 14-16을 사용하여 높은 카피 억제하는 멀티 웰 플레이트 형식 그러한 스크리닝에 최적화 된 시약을 사용하여 스크리닝 될 수 있도록 96- 멀티 웰 플레이트 형식으로 포자 것은 허용한다.
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Protocol
1. 포자 형성을위한 준비
참고 :.이 프로토콜에 설명 된 미디어는 표준 조리법과 방법을 사용하여 제조하는 13, 17 표 1은이 프로토콜에서 사용되는 다양한 미디어의 1 L에 대한 제제를 제공합니다.
| 박토 펩톤 | 효모 추출물 | 박토 한천 | 우선 당 | 칼륨 아세테이트 | 글리세린 | DDH 2 O | |
| YPG 판 | 20g | 10g | 20g | - | - | 30 ml의 | 970 ml의 |
| YPD 판 | 20g | 10g | 20g | 20g | - | - | 1,000 ml의 |
| YPD 액체 | 20g | 10g | - | 20g | - | - | 1,000 ml의 |
| YPA 액체 | 20g | 10g | - | - | 20g | - | 1,000 ml의 |
| 포자 형성 미디어 | - | - | - | - | 10g | - | 1,000 ml의 |
표 1. 미디어 제제 금액은 미디어의 1 L에 대해 제공됩니다. 미디어에 대한 세부 사항재료는 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
- 모든 포자 세포는 동일한 유전자형을 할 경우,이 절차를 따르십시오 :
- 해동 효모 균주는 YPG (YPGlycerol) 접시에 사용합니다. 30 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 효모 성장. 중요한 것은, SK1 세포도 그렇게 SK1 균주 YPG 판에 너무 오래 남아해서는 안 sporulate 태세, 또는 그들이 접시에 sporulate 수 있습니다.
참고 YPG 성장 갓 해동 균주가 탄소원으로서 글리세롤의 이용으로 산화 적 인산화 필요 바람직하고, 따라서 기능적 미토콘드리아 DNA가 세포에 대해 선택된다. SK1 세포 기능 미토콘드리아 DNA를 잃고 PETITES가되는 경향이있다. 기능 미토콘드리아 DNA는 포자 형성에 필요합니다. - 하나의 식민지에 대한 YPD (YPDextrose) 판 상에 YPG 판에서 행진 효모. 30 ° C에서 YPD 판 24 ~ 28 시간에 효모를 성장.
- YPD 고체 배지에서 성장의 약 36-48 시간 후, 하나의 식민지를 사용하여 25 ml의 YPD 문화를 시작YPD 판에서. 세포는 7.0 = 4.0 OD (600)에 대해 때까지이 문화를 성장. 220 rpm으로 진탕, 진탕 배양기에서 하룻밤 30 ° C에서이 단계를 수행합니다.
- YPD 문화에서 (220 진탕 30 ° C 진탕 배양기에서 효모 성장 2 제 각 96 웰 플레이트의 필요성에 대해 OD 600 = 0.1입니다 YPA (YPAcetate) 문화의 1,000 mL로 시작하는 세포의 적절한 양을 사용 OD (600)는 1.5-1.3 사이 인 문화까지 회전).
참고 : 네 96 멀티 웰 플레이트를 선별 경우 각각 96 멀티 웰 플레이트에 대한 YPA 문화의 100 ㎖를 접종은, 예를 들어 제 2 절에서 상영 될, YPA 문화의 400 ml의 필요합니다. YPA 문화에서 10 % 추가 볼륨부터는 증발 볼륨 손실을 방지 할 필요가있다. 세포가 적절한 OD 600에 도달하기 위해 일반적으로는 12 ~ 16 시간 사이에 걸립니다; 시간은 효모 균주의 유전형에 따라 달라질 수있다. YPA는 presporulation 미디어입니다. Pregrowth아세테이트 유전자의 발현 (예 : IME1)을 효율적이고 동기 포자 6 필요를 유도하는 데 도움이됩니다. - 5 분을위한 테이블 탑 원심 분리기에서 1,800 XG에 스핀 YPA에서 자란 세포 펠렛합니다. 세척 세포는 멸균 멸균 탈 이온수의 0.5 볼륨 1 배. 다시 스핀, 씻어 버린다. 1 배 볼륨 포자의 미디어를 Resuspend 세포. 제 2 절을 계속합니다.
- 해동 효모 균주는 YPG (YPGlycerol) 접시에 사용합니다. 30 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 효모 성장. 중요한 것은, SK1 세포도 그렇게 SK1 균주 YPG 판에 너무 오래 남아해서는 안 sporulate 태세, 또는 그들이 접시에 sporulate 수 있습니다.
- 다른 유전자형,의이다 포자에 대한 세포를 사용하여 (다른 플라스미드로 형질 전환 즉, 또는 다른 일반적으로 획득 및 냉동 주식으로 저장 돌연변이 포함) 96 멀티 웰 형식으로 다른 유전자형의 배열 세포를합니다. 그런 다음이 절차를 따르십시오 :
- YPG 고체 배지에 96 멀티 웰 플레이트 (들)에 해동 냉동 주식에서 세포를 전송하는 멸균 96 구 프로 거를 사용합니다. 30 ° C에서 효모 밤새 성장.
- 멸균 96 구 프로 거를 사용하여 YPD 고체 배지 또는 선택에 YPG 고체 배지에서 세포를 전송고체 미디어 (세포가 선택이 필요 플라스미드가 포함 된 경우 즉, 합성 최소 배지는 아미노산을 결여). 선택적 미디어가 필요한 경우 식민지가 이일 YPD에 일반적으로 1 일, 각 변형에 대해 형성 될 때까지 30 ° C에서 효모를 성장.
- 나누어지는 96 깊은 2 ml의 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 YPD 액체 매체 또는 선택적 액체 매체의 1.2 ml의. 프로 거를 사용하여 액체 매질에 고체 미디어에서 전송 세포는 테이프로 고정 플라스틱 뚜껑으로 덮고, 220 rpm으로 떨고, 30 ° C 통에 밤새 성장.
주 : 오염을 최소화하기 위해, 직사각형 페트리 접시에서 플라스틱 뚜껑을 사용하여 커버 플레이트. 공기 순환이 최소한으로 제한되어 있으므로 테이프의 조각을 사용하여 장소에 뚜껑을 잡으십시오. - 어댑터 스윙 버킷 원심 분리기를 이용하여 5 분 동안 1,800 XG에 원심 분리기 판은, 96 웰 플레이트를 수용한다. 세포에서 미디어를 붓고; YPA에서 펠렛 세포를 각각 500 μL의 YPA을 잘 추가하고 재현 탁. 덮개테이프로 고정 플라스틱 뚜껑.
- 220 rpm으로 진탕, 진탕 배양기에서 30 ° C에서 15 시간 동안 세포를 성장. 제 2 절을 계속합니다.
96 멀티 웰 형식 2. 포자 세포
- 하나 3mm 멸균 고체 유리 구슬 또는 1.3 ml의 우물과 96 웰 플레이트의 각 웰에 멸균 5mm X 2mm 자기 교반 막대를 추가합니다. (비드 또는 교반 막대 사용 여부에 대한 설명은 아래 대표 결과를 참조하십시오.)
- 스크리닝 될 수있는 모든 셀이 동일한 유전자형의 경우 2.2.1 간다. 상영하는 세포가 다른 유전자형의 경우, 2.2.2로 이동합니다.
- 96 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 단계 1.1.5 나누어지는 세포 플러스 미디어 500 μl를에서 세포를 가져 가라. 테이프로 고정 플라스틱 뚜껑 커버. 2.3로 넘어갑니다.
- 96 웰 플레이트를 수용하기 위해 어댑터 스윙 버킷 원심 분리기를 사용하여 1.2.4에서 5 분 1,800 XG에 YPA에 스핀 세포. 의 부어셀로부터 F 매체. 포자 미디어에서 펠렛 세포를 각 포자 매체의 500 μl를 잘 추가하고 재현 탁. 테이프로 고정 플라스틱 뚜껑 커버. 2.3로 넘어갑니다.
- 유리 비드를 사용하는 경우, 장소 30 ° C에서 진탕 배양기에서 샘플 및 포자 220 rpm으로 흔들. 포자 형성을위한 30 ° C 배양기의 내부에 교반 접시에 자기 교반 막대, 장소 샘플을 사용하는 경우.
참고 : 모든 바 정력적으로 이동하고 문화 폭기 된 바와 같이 자기 교반 막대에 대한 정확한 교반 속도만큼 매우 중요하지 않습니다. - , 포자 형성을 통해 진행을 모니터링 시각화의 포자 배양에서 샘플을 철회, 96 웰 커버 슬립 판에 포자 미디어의 24 μL에 포자 배양에서 세포의 6 μl를 추가하는 방법 (1 : 5 희석). 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 검사하기 전에 5 분 동안 정착 세포를 남겨주세요.
주 : 야생형 SK1 세포 컴팩트 성숙한 포자 (3)에 의해 형성 할포자 매체로 전사 후 6 시간이다. 포자 형성을 통해 진행이 같은 핵 마커 형광 마커를 사용하여 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다 (즉, Htb2-mCherry 18)가 감수 분열 또는 prospore 막 마커를 조사하는 (즉, G20 19) 포자 형태 형성을 검사합니다. 대안 적으로, 굴절 포자의 포자 형성을 용지에 전사 한 후 약 12 시간을 시작 노멀 스키 DIC 현미경을 사용하여 알 수있다.
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Representative Results
이 프로토콜을 평가하기 위해, (전술 한 바와 같이) 멀티 웰 플레이트에서 세포를 포자로부터 얻어진 포자 효율은 형틀 (표 2)에 큰 볼륨을 사용 포자 세포를 비교 하였다. 멀티 웰 플레이트의 사용은 ~ 80 %의 효율은 통상적으로 볼 수있는 플라스크에 포자 볼 때 높은 효율을 달성하지 않았다. (유리 비드 또는 교반 막대로 제공됨) 적합한 통기 멀티 웰 플레이트에서 포자 것은 최적의 결과 (66 % 효율)를 5mm X 2mm 교반 막대를 사용하여 수득으로 충분한 포자 효율을 50 % 이상을 달성 할 수있다. 두 개의 서로 다른 균주 (야생 유형 및 smk1Δ)의 대표적인 포자는 여기 (그림 1) 표시됩니다. 이 세포는 포자 형성 배지에서 36 시간 후에 검사하고 96 웰 유리 바닥 판을 사용하여 시각입니다.
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그림 1 :. 대표 포자로부터 세포를 포자 야생 유형 및 smk1Δ 셀 (20)은 96 멀티 웰 플레이트에 포자. 세포는 거꾸로 현미경에 63X 목표를 사용하여 시각 하였다. 굴절 tetrads (화살촉) smk1Δ 아닌 세포를 함유하는 배양에서는 야생형 배양에서 볼 수있다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
포자는 5mm 또는 96 1.3 ml의 멀티 웰 플레이트 (표 2)의 잘 들어가고 각각 7mm 교반 막대를 사용하여 시험 하였다. 7 밀리미터 교반 막대를 사용하면 높은 효율 (66 %)에 비해 가난한 포자 형성 효율 (28 %) 결과 5 밀리미터 교반 막대를 사용하여 달성. 잘의 7mm 교반 바는에 교반 막대와 상호 작용하는 경향이n은 인접도 (그림 1), 제대로 자극과 문화의 적절한 통기를 제공 할 수있는에서 막대를 방지 할 수있다.
| 포자 세포 (%) | SEM (%) | |
| 셰이커 플라스크 | (82) | 1.8 |
| 통에는 비드 없습니다 | (17) | 2.4 |
| 셰이커 비드 | (56) | 삼 |
| 볶음 접시에 더 교반 막대 없음 | (10) | 2.2 |
| 5mm는 볶음 접시에 막대를 저어 | (66) | 3.9 |
| 7mm은 볶음 접시에 막대를 저어 | (28) | 6.7 |
| SEM은 평균의 표준 오차 = |
표 2 :주목하면 포자 형성 배지 50 ㎖를 포함하는 500 mL의 플라스크에서, 전술, 또는 포자 효율 상이한 조건을 사용. 포자는 96 웰 멀티 웰 플레이트에서 수행 하였다. 8 개의 우물은 멀티 웰 플레이트에서 수행 각각의 조건에 대해 평균되었다. 세 가지 다른 플라스크는 포자했다. 모든 문화는 기술 복제하고, (LH902 18) mCherry - 태그 Htb2하지만, 그렇지 않은 야생형 이배체 SK1 효모 균주의 같은 식민지에서 시작했다. 전술 한 바와 같이 이러한 세포는 포자 형성 배지를 함유하는 96- 웰 플레이트에 접종 한 다음 분할 YPD 단일 플라스크 YPA 단일 플라스크에서 성장하고 있었다. 포자 형성 효율은 노멀 스키 DIC의 명 시야 현미경을 사용하여 포자 매체로 전사 한 후에 굴절 포자 36 시간을 카운트하여 측정 하였다.
그림 2 : 볶음포함 96 1.3 ml의 멀티 웰 플레이트에 바. 포자 형성 문화 중 하나 (A) 5mm X 2mm 볶음 바 (빨간색) 또는 (B) 자기 교반에 96 1.3 ml의 멀티 웰 플레이트에서 7mm × 2 밀리미터 교반 바 (파란색) 플레이트. 스케일 바 = 10 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 96 멀티 웰 형식으로 SK1 효모를 포자를위한 프로토콜을 제시한다. 폭기는 교반 막대 또는 아니라 각각의 유리 구슬 중 하나의 사용을 필요로 효율적인 포자 형성을위한 열쇠입니다. 세포가 비드 또는 교반 막대 하나없이 진탕 배양기에서 96 멀티 웰 플레이트에 포자 경우, 세포가 효율적으로 sporulate하지 않습니다. 세포가 비드 또는 (교반없이 30 ° C에서 표 1 인에 비해 진탕 배양기에서 교반 막대, 하나없이 포자 때 포자 효율 단지 작은 증가는 볼 수 10 % 대 통에 17 %가 혼란에 배치 플레이트). 마찬가지로, 7mm의 교반 막대의 사용은 7mm가 바 인해 인접 우물에 교반 막대와의 상호 작용에 제대로 문화를 공기에 쐬다하지 않았다 저어 가능성이 있기 때문에, 가난한 포자 형성 효율 (28 %) 결과. 이 프로토콜은 SPO을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 동기 효율적으로 포자 SK1 효모 균주 7,8를 사용하여 포자 형성을위한 조건을 설명rulation; 이 프로토콜을 사용하는 다른 효모 균주를 얻을 수있다 포자 효율이 기술을 이용하여 큰 화면을 착수하기 전에 검사한다.
유리 비드, 충분히 교반을 구입하는데 필요한 비용 (5mm X 2mm 교반 막대 유리 비드 56 % 대 66 %)의 사용에 비해 약간 더 포자에서 5mm X 2mm 교반 막대 결과 비록 각 웰에 대한 막대가 금지 될 수 있습니다. 유리 비드를 사용하여 얻어진 포자 효율은 96 멀티 웰 형식 (16)의 높은 처리량 검사를위한 충분한 통기를 생성하는 저가의 솔루션을 제공합니다. 불행히도, 교반 막대 나 유리 비드를 첨가 플라스크 포자 때 보이는 높은 포자 효율 (일반적으로 ~ 80 % 이상)를 달성되지 않았고, 따라서 미세한 포자 표현형은도 96에서 선별 때를 검출하기 어렵다 체재.
앞에서 설명한 포자 형성 방법 9-13을 달리
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Acknowledgments
이 작품은 NIH에서 매사추세츠 보스턴 (LSH) 및 R15 GM86805 대학 (LSH)에서 조셉 P. 힐리 보조금에 의해 지원되었다. SMP는 매사추세츠 보스턴 대학에서 사노피 - 젠 자임 원정대에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
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