Introduction
وقد درس تبوغ في الخميرة في مهدها لتقديم رؤى في جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك السيطرة على الفصل كروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي 1، آليات إعادة التركيب الجيني 2، والسيطرة على التنمية من خلال خلية يشير 3، ومراقبة التغذية التنمية 4، والنسخي تنظيم التنمية 5، والنظر في تشكيل بوغ 6. يتضمن تشكيل بوغ حدث انقسام الخلايا رواية تنطوي على تشكيل المقصورات غشاء جديدة داخل الخلية الأم تليها ترسب جدار بوغ واقية 6. هذه الدراسات أن دراسة الخلايا sporulating في كثير من الأحيان الاستفادة من sporulating بسرعة الخميرة سلالة SK1، والتي يمكن أن تخضع لعملية تكاثر في حوالي 24 ساعة بطريقة فعالة نسبيا 7،8. وعلى الرغم من وصفت تحسين ظروف تبوغ لفي مهدها الخميرة 13/9، هذه التجربةالصورة فحص تبوغ على وسائل الاعلام الصلبة أو في جو من الثقافات السائل على نطاق وحين ينفذ تبوغ من استخدام أنابيب ثقافة أو قوارير.
نحن هنا تصف طريقة لsporulating الخميرة في شكل لوحة multiwell 96. نجد أن لهذا الأسلوب، تهوية أمر بالغ الأهمية للتبوغ متزامن وكفاءة، وقد ابتكرت تقنيات لضمان تبوغ كافية لصغيرة الحجم شكل multiwell. Sporulating في شكل 96 لوحة multiwell يسمح للخلايا ليتم عرضه باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية والكواشف الأمثل لشكل لوحة multiwell، مثل هذا الفحص لالمكثفات نسخة عالية باستخدام مكتبة مزينة بالبلاط 14-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الاستعداد للتبوغ
ملاحظة: وسائل الإعلام وصفها في هذا البروتوكول تتم باستخدام وصفات وطرق معيارية 13،17 يعطي الجدول 1 صياغة ل1 لتر من وسائل الإعلام المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول.
| Bacto ببتون | خلاصة الخميرة | Bacto آجار | سكر العنب | البوتاسيوم خلات | الغليسيرول | ده 2 O | |
| لوحات YPG | 20 ز | 10 ز | 20 ز | - | - | 30 مل | 970 مل |
| لوحات YPD | 20 ز | 10 ز | 20 ز | 20 ز | - | - | 1000 مل |
| YPD السائل | 20 ز | 10 ز | - | 20 ز | - | - | 1000 مل |
| YPA السائل | 20 ز | 10 ز | - | - | 20 ز | - | 1000 مل |
| وسائل الإعلام تبوغ | - | - | - | - | 10 ز | - | 1000 مل |
يتم إعطاء صيغ وسائل الإعلام مبالغ ل1 لتر من وسائل الإعلام: الجدول 1. تفاصيل حول وسائل الإعلامالمكونات يمكن العثور عليها في جدول المواد.
- إذا جميع خلايا Sporulating سوف يكون التركيب الوراثي نفسه، اتبع هذا الإجراء:
- ذوبان الخميرة سلالة لاستخدامها في الصعود إلى (YPGlycerol) لوحة YPG. تنمو الخميرة ل12-16 ساعة عند 30 درجة مئوية. الأهم من ذلك، تستعد خلايا SK1 أيضا إلى sporulate، لذلك سلالات SK1 لا ينبغي أن تترك وقتا طويلا على لوحات YPG، أو أنها قد sporulate على لوحة.
ملاحظة: يفضل سلالة إذابة حديثا نمت على YPG، والاستفادة من الجلسرين كمصدر الكربون يتطلب الفسفرة التأكسدية، وبالتالي يختار لالخلايا التي تحتوي الحمض النووي وظيفية. خلايا SK1 لديهم ميل لفقدان الحمض النووي وظيفية وتصبح خادمات. وهناك حاجة الحمض النووي وظيفية للتبوغ. - الخميرة متتالية من لوحة YPG الصعود إلى (YPDextrose) لوحة YPD لالمستعمرات واحد. تنمو الخميرة على لوحة YPD 24-28 ساعة عند 30 درجة مئوية.
- بعد حوالي 36-48 ساعة من النمو على YPD وسائل الاعلام الصلبة، وبدء 25 مل ثقافة YPD باستخدام مستعمرة واحدةمن لوحة YPD. تنمو هذه الثقافة حتى الخلايا حول OD 600 = 4،0-7،0. تنفيذ هذه الخطوة عند 30 درجة مئوية خلال الليل في حاضنة تهتز، تهتز في 220 دورة في الدقيقة.
- من ثقافة YPD، استخدم مبلغ مناسب من الخلايا لبدء 1000 مل من YPA (YPAcetate) الثقافة التي هي OD 600 = 0.1 لكل حاجة 96 لوحة جيدا في القسم 2. تنمو الخميرة في 30 ° C هز حاضنة (اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة) حتى ثقافة OD 600 ما بين 1،3-1،5.
ملاحظة: تطعيم 100 مل من ثقافة YPA لكل لوحة multiwell 96 ليتم عرضه في القسم 2. على سبيل المثال، إذا فحص أربعة 96 لوحات multiwell، ستكون هناك حاجة إلى 400 مل من ثقافة YPA. بدءا من حجم إضافي 10٪ في الثقافة YPA غير الضرورية لحماية ضد فقدان حجم التبخر. عادة، سوف يستغرق ما بين 12-16 ساعة للخلايا للوصول الى OD المناسب 600. مقدار الوقت قد تختلف اعتمادا على التركيب الوراثي لسلالة الخميرة. YPA هو وسائل الإعلام presporulation. Pregrowthفي خلات يساعد لحث على التعبير عن الجينات (مثل IME1) اللازمة لكفاءة ومتزامن تبوغ 6. - تدور في 1800 x ج في أعلى الجدول أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا المزروعة في YPA. غسل الخلايا 1X مع 0.5 حجم الماء منزوع الأيونات تعقيمها العقيمة. تدور مرة أخرى، وتجاهل يغسل. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام حجم تبوغ 1X. الاستمرار في القسم 2.
- ذوبان الخميرة سلالة لاستخدامها في الصعود إلى (YPGlycerol) لوحة YPG. تنمو الخميرة ل12-16 ساعة عند 30 درجة مئوية. الأهم من ذلك، تستعد خلايا SK1 أيضا إلى sporulate، لذلك سلالات SK1 لا ينبغي أن تترك وقتا طويلا على لوحات YPG، أو أنها قد sporulate على لوحة.
- في حالة استخدام الخلايا للتبوغ التي هي من المورثات المختلفة، (أي، تحولت مع البلازميدات مختلفة أو تحتوي على الطفرات المختلفة، التي تم الحصول عليها عادة وتخزينها على شكل أسهم المجمدة)، وخلايا مجموعة من التراكيب المختلفة في شكل multiwell 96. ثم اتبع هذا الإجراء:
- استخدام معقم عبة Frogger 96 الشق لنقل الخلايا من الأسهم المجمدة المذابة في 96 لوحة multiwell (ق) على YPG وسائل الاعلام الصلبة. تنمو الخميرة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- استخدام معقم عبة Frogger 96 الشق، ونقل الخلايا من YPG وسائل الاعلام الصلبة على YPD وسائل الاعلام الصلبة أو انتقائيةوسائل الاعلام الصلبة (أي الحد الأدنى من وسائل الإعلام الاصطناعية تفتقر الأحماض الأمينية، وإذا احتوت الخلايا البلازميدات التي تتطلب الاختيار). تنمو الخميرة عند 30 درجة مئوية حتى يتم تشكيل مستعمرات لكل سلالة، عادة 1 يوم YPD و2 أيام إذا وسائل الإعلام الانتقائي أمر ضروري.
- قسامة 1.2 مل من YPD السائل وسائل الإعلام أو وسائل الإعلام السائلة انتقائية في كل بئر من 96 العميقة 2 مل لوحة multiwell. نقل الخلايا من وسائل الاعلام الصلبة إلى السائلة وسائل الإعلام باستخدام عبة Frogger، وتغطي بغطاء بلاستيكي في مكانها بواسطة الشريط، وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية شاكر، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: للحد من التلوث، وتغطية لوحات باستخدام الأغطية البلاستيكية من لوحة بتري مستطيلة. عقد الأغطية في مكان باستخدام قطعة من الشريط، لذلك يقتصر ذلك دوران الهواء الحد الأدنى. - لوحات أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 5 دقائق، وذلك باستخدام دلو الطرد المركزي يتأرجح مع محولات لاستيعاب 96 لوحات جيدة. تخلصي من وسائل الإعلام من الخلايا. إضافة 500 ميكرولتر YPA إلى كل بئر و resuspend الخلايا مكعبات في YPA. غطاء، يغطيمع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط.
- تنمو الخلايا لمدة 15 ساعة على 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز، تهتز في 220 دورة في الدقيقة. الاستمرار في القسم 2.
2. خلايا Sporulating في تنسيق Multiwell 96
- إضافة أي واحد 3 مم معقمة حبة الزجاج الصلبة أو معقمة 5 مم × 2 مم شريط مغناطيسي في كل بئر من 96 لوحة جيدا مع 1.3 مل الآبار. (انظر ممثل النتائج أدناه للحصول على مناقشة حول ما إذا كان استخدام حبة أو بقضيب).
- وإذا كان كل الخلايا ليتم عرضه من نفس النمط الجيني، انتقل إلى 2.2.1. إذا كانت الخلايا ليتم عرضه هي من المورثات مختلفة، انتقل إلى 2.2.2.
- أخذ خلايا من الخطوة 1.1.5 وقسامة 500 ميكرولتر من الخلايا بالإضافة إلى وسائل الإعلام في كل بئر من لوحة multiwell 96. تغطية مع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط. المضي قدما إلى 2.3.
- خلايا تدور التي هي في YPA من 1.2.4 في 1800 x ج لمدة 5 دقائق، وذلك باستخدام دلو الطرد المركزي يتأرجح مع محولات لاستيعاب 96 لوحات جيدة. صب لوسائل الإعلام و من الخلايا. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام تبوغ إلى كل بئر و resuspend الخلايا مكعبات في وسائل الإعلام تبوغ. تغطية مع غطاء من البلاستيك الذي عقد في مكان من الشريط. المضي قدما إلى 2.3.
- في حالة استخدام حبة الزجاج، وعينات من مكان في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية ويهز في 220 دورة في الدقيقة لتبوغ. في حالة استخدام شريط مغناطيسي، وعينات من مكان على طبق من ضجة داخل 30 درجة مئوية الحاضنة للتبوغ.
ملاحظة: سرعة ضجة الدقيق للقضبان تحريك مغناطيسي ليست مهمة جدا، ما دامت جميع الحانات تتحرك بنشاط وتهوية الثقافة. - لمراقبة التقدم من خلال تبوغ، سحب عينات من ثقافة sporulating عن التصور، إضافة 6 ميكرولتر من الخلايا من الثقافات sporulating إلى 24 ميكرولتر من وسائل الإعلام تبوغ في لوحة 96 ساترة جيدا (1: 5 تمييع). ترك الخلايا لتسوية لمدة 5 دقائق قبل فحص الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
ملاحظة: في خلايا SK1 نوع البرية، والجراثيم الناضجة المدمجة شكل من 36 ساعات بعد نقلها إلى وسائل الإعلام تبوغ. تقدم من خلال تبوغ يمكن رصدها بواسطة المجهر باستخدام علامات الفلورسنت، مثل علامة النووية (أي Htb2-mCherry 18) لفحص الميتوزي أو علامة غشاء prospore (أي G20 19) لدراسة بوغ التشكل. بدلا من ذلك، وتشكيل جراثيم سهل الانكسار ويمكن رؤيته باستخدام المجهر Nomarski مدينة دبي للإنترنت بدءا حوالي 12 ساعة بعد نقل إلى وسائل الإعلام تبوغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم هذا البروتوكول، وتمت مقارنة الكفاءة تبوغ تم الحصول عليها من sporulating الخلايا في لوحات multiwell (كما هو موضح أعلاه) إلى خلايا sporulated استخدام كميات أكبر في قوارير (الجدول 2). وقال إن استخدام لوحات multiwell لا يحقق كفاءة عالية ينظر عندما sporulating في قوارير، حيث كفاءة ~ 80٪ يمكن أن ينظر إليه بشكل روتيني. يمكن Sporulating في لوحات multiwell مع التهوية المناسبة (التي تقدمها الخرز الزجاجي أو أشرطة ضجة) تحقيق الكفاءة تبوغ كافية تزيد على 50٪، مع تحقيق أفضل النتائج (كفاءة 66٪) التي تم الحصول عليها باستخدام 5 مم × 2 مم بقضيب. ويرد تبوغ التمثيلي اثنين من سلالات مختلفة (نوع البرية وsmk1Δ) هنا (الشكل 1). ويتم فحص هذه الخلايا بعد 36 ساعة في وسائل الإعلام تبوغ وتصور باستخدام لوحة أسفل 96 الزجاج جيدا.
84 / 54584fig1.jpg "/>
الشكل 1: Sporulating خلايا من تبوغ التمثيلي نوع البرية وsmk1Δ خلايا 20 sporulated في 96 لوحات multiwell. وتصور الخلايا باستخدام الهدف 63X على مجهر مقلوب. tetrads سهل الانكسار (السهام) يمكن أن ينظر إليه في ثقافة نوع البرية، ولكن ليس في الثقافة التي تحتوي على خلايا smk1Δ. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم اختبار تبوغ سواء باستخدام 5 ملم أو 7 ملم بقضيب، كل منها يلائم داخل بئر من 96 1.3 مل لوحة multiwell (الجدول 2). باستخدام بقضيب 7 مم أدى إلى ضعف كفاءة تبوغ (28٪) مقارنة مع كفاءة أعلى (66٪) يتحقق باستخدام بقضيب 5 مم. شريط ضجة 7 مم في بئر تميل إلى التفاعل مع بقضيب فين جيدا المجاورة (الشكل 1)، ومنع قضبان من أن تكون قادرة على تحريك بشكل صحيح وتوفير التهوية الكافية للثقافة.
| خلايا sporulating (٪) | SEM (٪) | |
| قارورة في شاكر | 82 | 1.8 |
| لا حبة في شاكر | 17 | 2.4 |
| حبة في شاكر | 56 | 3 |
| لا بقضيب على لوحة ضجة | 10 | 2.2 |
| 5 مم تثير شريط على لوحة ضجة | 66 | 3.9 |
| 7 ملم تثير شريط على لوحة ضجة | 28 | 6.7 |
| SEM = الخطأ المعياري للمتوسط |
الجدول 2:الكفاءة تبوغ باستخدام ظروف مختلفة. وقد أجريت تبوغ في 96 لوحات multiwell جيدا كما هو موضح أعلاه، أو إذا لاحظت، في 500 مل القوارير التي تحتوي على 50 مل من وسائل الاعلام تبوغ. وبلغ متوسط ثمانية آبار مختلفة لكل حالة نفذت في لوحة multiwell. تم sporulated ثلاث قوارير مختلفة. جميع الثقافات مكررات التقنية، التي من نفس مستعمرة Htb2 الموسومة mCherry ولكن نوع خلاف البرية SK1 مضاعفا الخميرة سلالة (LH902 18). وقد نمت هذه الخلايا في قارورة واحدة من YPD وقارورة واحدة من YPA، ومن ثم تقسيمها إلى تطعيم لوحات 96-جيدا تحتوي على وسائل الإعلام تبوغ، كما هو موضح أعلاه. كان يعاير كفاءة تبوغ عن طريق عد جراثيم سهل الانكسار 36 ساعة بعد نقل إلى وسائل الإعلام تبوغ باستخدام Nomarski مدينة دبي للإنترنت brightfield المجهري.
الشكل 2: تحريكالحانات في 96 1.3 مل لوحات multiwell. الثقافة تبوغ التي تحتوي إما (أ) 5 مم × 2 مم قضبان ضجة (الحمراء) أو (B) قضبان 7 مم × 2 مم ضجة (الأزرق) في 96 1.3 مل لوحة multiwell على تحريك مغناطيسي طبق. شريط النطاق = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم بروتوكول للsporulating SK1 الخميرة في شكل multiwell 96. التهوية هي المفتاح للتبوغ كفاءة، الأمر الذي يتطلب استخدام إما بقضيب أو حبة الزجاج في كل بئر. عندما يتم sporulated الخلايا في لوحة multiwell 96 في حاضنة تهتز دون أي حبة أو بقضيب، الخلايا لا sporulate بكفاءة. وينظر فقط زيادة صغيرة في كفاءة تبوغ عندما يتم sporulated الخلايا دون أي حبة أو بقضيب في حاضنة تهتز، مقارنة يجري في 30 درجة مئوية دون التحريض (الجدول 1؛ 17٪ في شاكر مقابل 10٪ المفروضة على ضجة طبق). وبالمثل، فإن استخدام بقضيب 7 ملم في ضعف كفاءة تبوغ (28٪)، من المحتمل لأن 7 ملم تثير لم القضبان لا تهوية الثقافة بشكل صحيح بسبب التفاعلات مع قضبان ضجة في الآبار المجاورة. يصف هذا البروتوكول شروط تبوغ باستخدام sporulating بشكل متزامن وكفاءة SK1 الخميرة سلالة 7،8 تستخدم عادة لدراسة مكتب التخطيط الاستراتيجيrulation. يجب فحص الكفاءة تبوغ التي يمكن الحصول عليها مع سلالات الخميرة الأخرى التي تستخدم هذا البروتوكول قبل الشروع في شاشة كبيرة باستخدام هذه التقنيات.
على الرغم من أن 5 مم × 2 مم النتائج بقضيب في تبوغ أفضل قليلا بالمقارنة مع استخدام حبة الزجاج (66٪ مع 5 مم × 2 مم بقضيب مقابل 56٪ مع حبة الزجاج)، التكاليف اللازمة لشراء ما يكفي من ضجة الحانات لكل بئر يمكن أن تكون باهظة. الكفاءات تبوغ الحصول عليها باستخدام حبة الزجاج يوفر حلا منخفض التكلفة الذي يخلق تهوية كافية للكشف عن الإنتاجية العالية في 96 شكل multiwell 16. لسوء الحظ، فإن إضافة بقضيب أو حبة الزجاج لن يحقق الكفاءة تبوغ عالية جدا (عادة ~ 80٪ أو أكثر) ينظر عندما sporulating في قوارير، والظواهر تبوغ وبالتالي خفية قد يكون من الصعب الكشف عند فحص في 96 جيد شكل.
خلافا لأساليب تبوغ التي سبق وصفها 13/09
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة جوزيف هيلي من جامعة ماساتشوستس في بوسطن (LSH) وR15 GM86805 من المعاهد الوطنية للصحة (LSH). ويدعم SMP جزئيا على زمالة سانوفي-جنزايم في جامعة ماساتشوستس في بوسطن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
