Introduction
Sporulation in der Bäckerhefe wurde untersucht , Einblicke in viele Aspekte der Biologie zu schaffen, einschließlich der Kontrolle der Chromosomensegregation während der Meiose 1, Mechanismen der genetischen Rekombination 2, die Kontrolle der Entwicklung von Zelle 3 Signalisierung, Ernährungs - Management von Entwicklung 4, die Transkriptions Regulierung der Entwicklung 5 und die Prüfung der Sporenbildung 6. Sporenbildung beinhaltet eine neuartige Zellteilung Ereignis die Bildung neuer Membran Kompartimente innerhalb der Mutterzelle durch Abscheiden einer Schutzsporenwand 6 gefolgt beteiligt sind . Diese Studien , die sporulierendem Zellen oft nutzen die schnell sporulierendem Hefestamm SK1 zu untersuchen, die den Prozess der Sporulation in etwa 24 Stunden in einem relativ effiziente Art und Weise 7,8 eingehen können. Obwohl die Optimierung der Sporulationsbedingungen für Hefe - Knospung haben 9-13 beschrieben worden ist , diese Experiments geprüft Sporulation auf festen Medien oder in größerem Maßstab flüssige Kulturen, in denen die Sporenbildung durchgeführt wird Kulturröhrchen oder Kolben verwendet wird.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur sporulierenden Hefe in einem 96-Multiwell-Platten-Format. Wir finden, dass für dieses Verfahren, Belüftung für synchrone und effiziente Sporulation kritisch ist, und haben Techniken entwickelt, um eine ausreichende Sporulation ein kleinvolumiger Multiwell-Format zu gewährleisten. In einer 96 Multi - Well - Plattenformat sporulierendem ermöglicht Zellen für eine Multi - Well - Plattenformat, wie zum Screening für eine hohe Kopien Suppressoren mit einem gekachelten Bibliothek 14-16 optimierte Hochdurchsatztechniken und unter Verwendung von Reagenzien zu sehen sein.
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Protocol
1. Vorbereitung für Sporulation
. Anmerkung: Die Medien in diesem Protokoll beschrieben werden , hergestellt unter Verwendung Standardrezepturen und -verfahren 13,17 Tabelle 1 gibt die Formulierung für 1 L der verschiedenen Medien in diesem Protokoll verwendet.
| Bactopepton | Hefeextrakt | Bacto Agar | Traubenzucker | KALIUMACETAT | Glycerol | ddH 2 O | |
| YPG-Platten | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 ml | 970 ml |
| YPD-Platten | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1,000 ml |
| YPD Flüssigkeit | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1,000 ml |
| YPA Flüssigkeit | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1,000 ml |
| Sporulation Medien | - | - | - | - | 10 g | - | 1,000 ml |
Tabelle 1:. Medienformulierungen Die Beträge werden für 1 l Medien gegeben. Einzelheiten über MedienZutaten können in der Materialtabelle.
- Wenn alle sporulierendem Zellen die gleichen Genotyps sein, gehen Sie folgendermaßen vor:
- Thaw Hefestamm auf einem YPG (YPGlycerol) Platte verwendet werden. Wachsen Hefe für 12-16 h bei 30 ° C. Wichtig ist, dass SK1 Zellen auch sollte, so SK1 Stämme zur Sporulation balanciert nicht zu lange auf YPG-Platten belassen werden, oder sie können auf der Platte sporulieren.
Hinweis: Ein frisch aufgetauten Belastung auf YPG gezüchtet wird bevorzugt, wie Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle oxidative Phosphorylierung benötigt, und wählt somit für Zellen, die funktionelle mitochondrialen DNA aufweisen. SK1 Zellen haben eine Tendenz, funktionelle Mitochondrien-DNA zu verlieren und petites. Funktionelle mitochondrialer DNA ist für die Sporenbildung benötigt. - Streak Hefe aus der YPG Platte auf eine YPD (YPDextrose) Platte für einzelne Kolonien. Wachsen Hefe auf YPD-Platte 24-28 h bei 30 ° C.
- Nach etwa 36 bis 48 h Wachstum auf YPD festen Medien, starten Sie eine 25 ml YPD-Kultur eine einzige Kolonie mitvon der YPD Platte. Wachsen diese Kultur , bis die Zellen etwa OD 600 = 4,0 bis 7,0 liegen. Führen Sie diesen Schritt bei 30 ° C über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm schütteln.
- Von der YPD - Kultur, eine entsprechende Menge an Zellen verwenden , um 1000 ml YPA (YPAcetate) Kultur beginnen , die OD 600 = 0,1 für jede 96 - Well - Platte Bedarf in Abschnitt 2. wachsen Hefe in einem 30 ° C Schüttelinkubator ist (bei 220 Schütteln rpm) , bis die Kultur OD 600 zwischen 1,3 bis 1,5 ist.
Hinweis: Impfen 100 ml YPA Kultur für jede 96 Multiwellplatte in Abschnitt 2. Zum Beispiel zu sehen sein, wenn vier 96 Mikrotiterplatten Screening, 400 ml YPA Kultur benötigt. Beginnend mit 10% mehr Volumen in der YPA Kultur ist notwendig, gegen Verdunstungsvolumenverlust zu schützen. Typischerweise wird es zwischen 12 bis 16 Stunden dauern , Zellen , die die entsprechenden OD 600 zu erreichen; die Zeit kann in Abhängigkeit vom Genotyp des Hefestamm variieren. YPA ist die presporulation Medien. Pregrowthin Acetat hilft Expression von Genen (wie IME1) induzieren für einen effizienten und synchronen Sporulation 6 benötigt. - Spin bei 1.800 xg in einer Tischzentrifuge für 5 min Zellen in YPA gewachsen zu pelletieren. Waschen Sie die Zellen 1x mit 0,5 Volumen sterilen autoklaviert entsalztem Wasser. Spin wieder, und entsorgen Sie waschen. Die Zellen in 1x Volumen Sporulation Medien. Weiter zu Abschnitt 2.
- Thaw Hefestamm auf einem YPG (YPGlycerol) Platte verwendet werden. Wachsen Hefe für 12-16 h bei 30 ° C. Wichtig ist, dass SK1 Zellen auch sollte, so SK1 Stämme zur Sporulation balanciert nicht zu lange auf YPG-Platten belassen werden, oder sie können auf der Platte sporulieren.
- Bei Verwendung von Zellen für die Sporulation , die von verschiedenen Genotypen sind, (dh transformiert mit verschiedenen Plasmiden oder verschiedene Mutationen enthalten, in der Regel erhalten , und als gefrorene Vorräte gespeichert), array Zellen der verschiedenen Genotypen in eine 96 - Multiwell - Format. Dann gehen Sie folgendermaßen vor:
- Verwenden Sie eine sterile 96 Zinke Frogger Zellen aus aufgetauten gefrorenen Bestände in 96 Multiwellplatte zu übertragen (s) auf YPG festen Medien. Wachsen Hefe über Nacht bei 30 ° C.
- Mit einem sterilen 96 Zinke Frogger, Transfer-Zellen von YPG festen Medien auf YPD feste Medien oder selektivefeste Medien (dh synthetische Minimalmedien Aminosäuren fehlen, wenn die Zellen Plasmide enthalten , die Auswahl benötigen). Hefe wachsen bei 30 ° C bis Kolonien für jeden Stamm gebildet werden, typischerweise 1 Tag auf YPD und 2 Tage, wenn selektiven Medien notwendig.
- Aliquot 1,2 ml YPD flüssigen Medien oder selektive flüssige Medien in jede Vertiefung einer 96 tief 2 ml Multiwellplatte. Transfer-Zellen aus festen Medien in flüssige Medien ein Frogger mit, Deckel mit einem Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten und wachsen über Nacht in 30 ° C Schüttler bei 220 Umdrehungen pro Minute schütteln.
Hinweis: Zur Minimierung von Verschmutzung, Abdeckplatten mit den Kunststoffdeckel aus einem rechteckigen Petrischale. Halten Deckel anstelle ein Stück Klebeband, so dass die Luftzirkulation minimal eingeschränkt ist. - Zentrifugenplatten bei 1.800 × g für 5 min, eine Schwingbecherzentrifuge mit Adapter mit 96-Well-Platten aufzunehmen. Gießen Sie Medien von Zellen; Add 500 ul YPA in jede Vertiefung und resuspendieren in der YPA pelletierten Zellen. Abdeckungmit Kunststoffdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten.
- Wachsen Zellen für 15 Stunden bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm schütteln. Weiter zu Abschnitt 2.
2. sporulierendem Zellen in einer 96-Multiwell-Format
- Fügen Sie entweder ein 3 mm sterilen festen Glasperle oder eine sterile 5 mm x 2 mm magnetischen Rührstab in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 1,3 ml Brunnen. (Siehe Repräsentative Ergebnisse unten für eine Diskussion darüber , ob eine Perle oder einen Rührstab zu verwenden.)
- Wenn alle Zellen des gleichen Genotyps gescreent werden, um 2.2.1 gehen. Wenn Zellen von verschiedenen Genotypen gescreent werden, um 2.2.2 gehen.
- Nehmen Sie Zellen aus Schritt 1.1.5 und aliquoten 500 ul Zellen plus Medien in jede Vertiefung der 96 Multi-Well-Platte. Abdeckung mit Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten. Gehen Sie zu 2.3.
- Spin-Zellen, die für 5 min in YPA von 1.2.4 bei 1.800 xg sind, eine Schwingbecherzentrifuge mit Adapter mit 96-Well-Platten aufzunehmen. Gießen vonf Medien aus Zellen. Hinzufügen 500 ul Sporulation Medium zu jeder Vertiefung gegeben und resuspendieren pelletierten Zellen in der Sporulation Medien. Abdeckung mit Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten. Gehen Sie zu 2.3.
- Bei Verwendung einer Glasperle, Platz Proben in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute für die Sporenbildung. Wenn eine magnetische Rührstab verwenden, Ort Proben auf einer Rührplatte innerhalb einer 30 ° C-Inkubator für Sporulation.
Hinweis: Die genaue Rührgeschwindigkeit für die magnetischen Rührstäbe nicht sehr wichtig ist, solange alle Balken bewegen sich energisch und die Kultur belüftet wird. - Zu überwachen, die Progression durch Sporulation werden Proben aus der Kultur sporulierenden zur Visualisierung, In 6 ul von Zellen aus der sporulierenden Kulturen auf 24 & mgr; l der Sporulation Medium in einer 96-Well-Deckplatte (1: 5-Verdünnung). Lassen Sie Zellen für 5 Minuten absetzen, bevor Zellen mit einem inversen Mikroskop zu untersuchen.
Hinweis: In Wildtyp-SK1 Zellen, kompakt reifen Sporen von 3 bilden6 Stunden nach der Übertragung auf die Sporulation Medien. Progression durch Sporulation kann durch Mikroskopie unter Verwendung von fluoreszierenden Markern, wie beispielsweise ein Kernmarker (dh HTB2-mCherry 18) zu untersuchen , die meiotische Teilung oder eine prospore Membranmarker (dh G20 19) zu untersuchen sporen Morphogenese überwacht werden. Alternativ kann die Bildung von refractile Sporen Nomarski DIC-Mikroskopie beginnend etwa 12 Stunden nach dem Transfer auf die Sporulation Medien gesehen werden.
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Representative Results
Um dieses Protokoll Beurteilung Sporulation Effizienzen aus sporulierenden Zellen in Multi - Well - Platten erhalten (wie oben beschrieben) wurden im Vergleich zu Zellen sporuliert Verwendung größerer Volumen in den Flaschen (Tabelle 2). Die Verwendung von Multiwell-Platten nicht erreicht die hohe Effizienz gesehen, wenn in Flaschen sporulierenden, wobei ~ 80% Wirkungsgrad routinemäßig gesehen werden kann. Sporulierendem in Mikrotiterplatten mit der richtigen Belüftung (zur Verfügung gestellt von Glasperlen oder Rührstäbe) kann eine ausreichende Sporulation Wirkungsgrade von mehr als 50%, zu erreichen mit den besten Ergebnissen (66% Wirkungsgrad), erhalten mit einem 5 mm x 2 mm Rührstab verwenden. Ein Vertreter der Sporulation von zwei verschiedenen Stämmen (Wildtyp und smk1Δ) ist hier (Abbildung 1) gezeigt. Diese Zellen werden nach 36 Stunden in der Sporulation Medien untersucht und visualisiert eine 96-Well Glasbodenplatte verwendet wird.
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Abb . 1: sporulierendem Zellen aus einer repräsentativen Sporulation Wildtyp und smk1Δ 20 Zellen in einer 96 - Mikrotiterplatten sporulierten. Zellen wurden unter Verwendung eines 63X Ziel auf einem inversen Mikroskop sichtbar gemacht. Refraktile Tetraden (Pfeilspitzen) in der Wildtyp - Kultur, aber nicht in der Kultur smk1Δ Zellen enthalten , zu sehen. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Sporulation wurde entweder mit einem 5 mm oder 7 mm Rührstab getestet, von denen jeder passt in die Vertiefung einer 96 1,3 ml Multi - Well - Platte (Tabelle 2). in schlechten Sporulationseffizienz ergab eine 7 mm Rührstab Mit (28%) im Vergleich zu den höheren Wirkungsgrad (66%) erreicht die 5 mm Rührstab verwenden. Die 7 mm Rührstab in einem gepflegten mit einem Rührstab in ein interagierenn benachbarte gut (Abbildung 1), verhindern , dass die Stäbe von der Lage, richtig zu rühren und eine ausreichende Belüftung der Kultur bieten.
| sporulierenden Zellen (%) | SEM (%) | |
| Kolben in Shaker | 82 | 1.8 |
| kein Wulst im Shaker | 17 | 2.4 |
| Perle im Shaker | 56 | 3 |
| kein Rührstab auf Rührplatte | 10 | 2.2 |
| 5 mm Rührstab auf Rührplatte | 66 | 3.9 |
| 7 mm Rührstab auf Rührplatte | 28 | 6.7 |
| SEM = Standardfehler des Mittelwertes |
Tabelle 2:Sporulation Effizienzen unter Verwendung von verschiedenen Bedingungen. Sporulation wurde in 96 - Well - Mikrotiterplatten durchgeführt , wie oben beschrieben, oder, falls angegeben, in 500 ml - Kolben , die 50 ml Sporulation Medien. Acht verschiedene Vertiefungen wurden für jede Bedingung gemittelt in einer Multiwellplatte durchgeführt wird. Drei verschiedene Flaschen wurden Sporen gebildet. Alle Kulturen sind technische Replikate, angefangen von der gleichen Kolonie mCherry-markierten HTB2 aber ansonsten Wildtyp diploiden SK1 Hefestamm (LH902 18). Diese Zellen wurden in einem einzigen Kolben YPD und einem Einzelkolben YPA gezüchtet und dann unterteilt 96-Well-Platten zu inokulieren Sporulation Medien enthält, wie oben beschrieben. Sporulationseffizienz wurde durch Zählen Refraktil Sporen 36 Stunden nach der Übertragung auf die Sporulation Medien Nomarski DIC Hellfeldmikroskopie untersucht.
Abbildung 2: StirBars in 96 1,3 ml Multi - Well - Platten. Sporulation Kultur , die entweder (A) 5 mm x 2 mm Rührstäbe (rot) oder (B) 7 mm x 2 mm Rührstäbe (blau) in einer 96 1,3 ml Multi - Well - Platte auf einem Magnetrührstab Teller. Maßstabsbalken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll für sporulierendem SK1 Hefe in einem 96 Multi-Well-Format. Belüftung ist der Schlüssel für die effiziente Sporulation, die die Verwendung von entweder einem Rührstab oder einer Glasperle in jeder Vertiefung erfordert. Wenn Zellen ohne entweder in einer 96-Mikrotiterplatte in einem Schüttelinkubator sporulierten sind eine Perle oder einem Rührstab, Sporulation nicht effizient Zellen. Nur ein geringer Anstieg der Sporulationseffizienz gesehen wird , wenn Zellen ohne entweder einen Wulst oder einem Rührstab in einem Schüttelinkubator sporulierten werden, im Vergleich zu ohne Rühren bei 30 ° C zu sein (Tabelle 1; 17% im Shaker vs 10% auf einem stir platziert Teller). In ähnlicher Weise führte die Verwendung eines 7 mm Rührstab in einem schlechten Sporulationseffizienz (28%), wahrscheinlich, weil die 7 mm Rührstäbe nicht die Kultur richtig mit Rührstäbe in benachbarten Vertiefungen aufgrund von Wechselwirkungen belüften haben. Dieses Protokoll beschreibt die Bedingungen für die Sporenbildung unter Verwendung des synchron und effizient 7,8 sporulierendem SK1 Hefestamm häufig verwendet spo zu studierenrulation; Sporulation Wirkungsgrade, die mit anderen Hefestämmen mit diesem Protokoll erhalten werden können, sollten vor der Durchführung einen großen Bildschirm mit diesen Techniken untersucht werden.
Obwohl ein 5 mm x 2 mm Rührstab ergibt eine etwas bessere Sporulation im Vergleich zu der Verwendung einer Glasperle (66% mit 5 mm x 2 mm Rührstab vs 56% mit einer Glasperle), die Kosten erforderlich, um genug stir kaufen Bars für jeden gut können unerschwinglich sein. Die Sporulation Effizienzen einer Glasperle , erhalten unter Verwendung bietet eine kostengünstige Lösung , die für High-Throughput - Screening in einem 96 - Multiwell - Format 16 genügend Belüftung erzeugt. Leider hat die Zugabe von einem Rührstab oder einer Glasperle nicht die sehr hohen Sporulation Wirkungsgrade erreichen (in der Regel ca. 80% oder mehr) zu sehen, wenn sie in Flaschen sporulierendem und so subtil Sporulation Phänotypen schwierig sein kann, wenn sie in einem 96-Screening zur Erkennung gut Format.
Im Gegensatz zu früher beschriebenen Sporulation Methoden 9-13
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem Joseph P. Healey Zuschuss von der University of Massachusetts Boston (LSH) und R15 GM86805 vom NIH (LSH) unterstützt. SMP wird teilweise durch eine Sanofi-Genzyme Fellowship an der University of Massachusetts Boston unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
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