Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

נביגה יעילה של Published: September 17, 2016 doi: 10.3791/54584
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

Introduction

נביגה ב השמרים ניצני נחקרה לספק תובנות היבטים רבים של הביולוגיה, כולל שליטה על הפרדה כרומוזום במהלך המיוזה 1, מנגנוני שחלוף 2, שליטה של פיתוח על ידי התא איתות 3, שליטה התזונתי של פיתוח 4, תעתיק הסדרת פיתוח 5, ובחינת יצירת הנבגים 6. יצירת נבגים כוללת אירוע חלוקת תא רומן מעורב ההיווצרות של תאי קרום חדשים בתוך תא אמא ואחריו בתצהיר של קיר נבג מגן 6. מחקרים אלה הבוחנים תאים sporulating מנצלים לעתים קרובות זן שמרים sporulating במהירות sK1, אשר יכול לעבור תהליך של נביגה בערך 24 שעות בצורה יעילה יחסית 7,8. למרות אופטימיזציה של תנאי נביגה בשביל נבגי שמרים תוארו 9-13, אלה לביצוע הניסויs בחן נביגה על התקשורת מוצק או נוזלי בתרבויות בקנה מידה גדול יותר שבו נביגה מתבצעת באמצעות צינורות תרבות או צלוחיות.

כאן אנו מתארים שיטה sporulating שמרים במתכונת צלחת multiwell 96. אנו מוצאים כי בשיטה זו, אוורור הוא קריטי עבור נביגה סינכרוני ויעיל, פיתחו טכניקות כדי להבטיח נביגה מספיק בפורמט multiwell קטן-נפח. Sporulating במתכונת צלחת multiwell 96 מאפשר לתאים להיות מוקרנים באמצעות טכניקות תפוקה גבוהה ריאגנטים מותאם במיוחד בפורמט צלחת multiwell, הקרנה כזה מדכאי גבוהה עותק באמצעות ספריית רעפים 14-16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנות לקראת נביגה

הערה:. התקשורת המתוארת בפרוטוקול זה מבוצע באמצעות 13,17 מתכונים ושיטות תקן הטבלה 1 נותנת את הניסוח עבור 1 ליטר של התקשורת השונה בשימוש בפרוטוקול זה.

bacto Peptone תמצית שמרים bacto אגר דקסטרוז אשלגן יצטט גליצרול DDH 2 O
צלחות YPG 20 גרם 10 גרם 20 גרם - - 30 מ"ל 970 מ"ל
צלחות YPD 20 גרם 10 גרם 20 גרם 20 גרם - - 1,000 מ"ל
נוזלי YPD 20 גרם 10 גרם - 20 גרם - - 1,000 מ"ל
נוזל YPA 20 גרם 10 גרם - - 20 גרם - 1,000 מ"ל
תקשורת נביגה - - - - 10 גרם - 1,000 מ"ל

טבלה 1:. ניסוחים מדיה סכומים ניתנים 1 ליטר של התקשורת. פרטים על תקשורתניתן למצוא מרכיבים של חומרי הטבלה.

  1. אם כל תאי Sporulating יהיו גנוטיפ הזהה, בצע הליך זה:
    1. זן שמרים ההפשרה לשמש לצלחת YPG (YPGlycerol). לגדול שמרים במשך 12-16 שעות על 30 מעלות צלזיוס. חשוב לציין, תאי sK1 עומדים גם sporulate, כך זני sK1 אסור להשאיר יותר מדי זמן על צלחות YPG, או שהם עשויים sporulate על הצלחת.
      הערה: זן טרי מופשר גדל על YPG הוא העדיף, כמו ניצול של גליצרול כמקור פחמן דורש זרחון חמצוני, ובכך בוחר עבור תאים בעלי הדנ"א המיטוכונדרי פונקציונלי. יש sK1 תאים נטייה לאבד הדנ"א המיטוכונדרי פונקציונלי ולהיות petites. הדנ"א המיטוכונדרי פונקציונלי דרוש נביגה.
    2. שמרים Streak מהצלחת YPG לצלחת YPD (YPDextrose) עבור מושבות אחת. לגדול שמרים על 24-28 שעות צלחת YPD על 30 מעלות צלזיוס.
    3. אחרי בערך 36-48 שעות של צמיחה על תקשורת המוצקה YPD, להתחיל 25 מיליליטר תרבות YPD באמצעות מושבה אחתמהצלחת YPD. לגדול בתרבות זו עד תאים על OD 600 = 4.0 ל -7.0. בצע פעולה זו על 30 מעלות צלזיוס לילה חממה רועד, רועד ב 220 סל"ד.
    4. מתרבות YPD, השתמש כמות מתאימה של תאים להתחיל 1,000 מ"ל של YPA (YPAcetate) תרבות הוא OD 600 = 0.1 עבור כל צורך בצלחת 96 באר בסעיף 2. לגדול השמרים 30 ° C רועד חממה (רועד ב 220 סל"ד) עד התרבות OD 600 היא בין 1.3 1.5.
      הערה: לחסן 100 מ"ל של תרבות YPA עבור 96 כל צלחת multiwell שיוקרנו בסעיף 2. לדוגמה, אם ההקרנה ארבע 96 צלחות multiwell, 400 מ"ל של תרבות YPA יהיה צורך. החל נפח תוספת 10% בתרבות YPA יש צורך להגן מפני איבוד מסת אוויר. בדרך כלל, זה ייקח בין 12-16 שעות עבור תאים להגיע OD המתאים 600; את משך הזמן עשוי להשתנות תלוי גנוטיפ של זן השמרים. YPA הוא התקשורת presporulation. Pregrowthב תצטט עוזר להשרות ביטוי של גנים (כגון IME1) דרושי נביגה יעיל סינכרוני 6.
    5. ספין 1,800 XG בצנטריפוגה בראש הטבלה במשך 5 דקות עד גלולה התאים הגדלים YPA. לשטוף את התאים 1X עם 0.5 נפח של מים ללא יונים autoclaved סטרילי. ספין שוב, וזורקים לשטוף. Resuspend תאי תקשורת נביגה נפח 1x. המשך לסעיף 2.
  2. אם באמצעות תאים עבור נביגה כי הם של גנוטיפים שונים, (כלומר, הפך עם פלסמידים שונים או המכילים מוטציות שונות, בדרך כלל מתקבל ומאוחסנים כמו מניות קפוא), תאי מערך של גנוטיפים שונים לפורמט multiwell 96. לאחר מכן, בצע את התהליך הבא:
    1. השתמש Frogger 96 שיניים סטרילי להעביר תאים ממניות קפוא מופשר ב 96 צלחת multiwell (ים) על גבי מדיה YPG מוצק. לגדול לילה שמרים על 30 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות Frogger 96 שיניים סטרילי, להעביר תאי תקשורת מוצקה YPG גבי מדיה מוצקה YPD או סלקטיביתתקשורת מוצקה (כלומר, תקשורת מינימאלית סינטתית חסרת חומצות אמינו, אם התאים מכילים פלסמידים הדורשים מבחר). לגדול שמרים ב 30 מעלות צלזיוס עד מושבות נוצרות עבור כל זן, בדרך כלל 1 יום על YPD ו -2 ימים אם התקשורת סלקטיבית היא הכרחית.
    3. Aliquot 1.2 מיליליטר של תקשורת הנוזלת YPD או תקשורת הנוזלת סלקטיבית לבאר כל צלחת multiwell 96 עמוק 2 מיליליטר. העברת תאים מן התקשורת מוצקה לתוך תקשורת נוזלית באמצעות פרוגר, מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת, ולגדול לילה 30 ° C שייקר, רועד ב 220 סל"ד.
      הערה: כדי למזער זיהום, אטמים באמצעות מכסי הפלסטיק מתוך צלחת הפטר מלבני. החזק מכסה במקום באמצעות נייר דבק, כך זרימת האוויר מוגבלת מינימאלית.
    4. צלחות צנטריפוגה ב 1,800 XG במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגות דלי מתנדנד עם מתאמים כדי להכיל 96 צלחות היטב. יוצקים את התקשורת מתאי; להוסיף 500 μl YPA זה היטב resuspend התאים pelleted ב YPA. כיסויעם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת.
    5. לגדל תאים עבור 15 שעות ב 30 מעלות צלזיוס חממה רועדת, רועד ב 220 סל"ד. המשך לסעיף 2.

2. תאים Sporulating במתכונת 96 multiwell

  1. להוסיף אחד מהם 3 מ"מ חרוז זכוכית מוצקה סטרילי או בר ומערבבים מגנטי סטרילי 5 מ"מ x 2 מ"מ לבאר כל צלחת 96 גם עם 1.3 מ"ל בארות. (ראה תוצאות נציג להלן דיון בשאלה האם להשתמש חרוז או בר ומערבבים.)
  2. אם כל התאים שיוקרנו הם מאותו גנוטיפ, ללכת 2.2.1. אם תאים שיוקרנו הם של גנוטיפים שונים, ללכת 2.2.2.
    1. קח התאים משלב 1.1.5 ו aliquot 500 μl של תאים בתוספת התקשורת לבאר כל 96 הצלחת multiwell. מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת. המשך 2.3.
    2. תאי ספין הנמצאים YPA מ 1.2.4 1,800 XG במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגות דלי מתנדנד עם מתאמים כדי להכיל 96 צלחות היטב. יוצקים שלמדיה מתאי f. הוסף 500 μl של התקשורת נביגה זה היטב resuspend התאים pelleted בתקשורת נביגה. מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת. המשך 2.3.
  3. אם באמצעות חרוז זכוכית, דגימות מקום חממה רועדת ב 30 ° C ולנער ב 220 סל"ד במשך נביגה. אם אתם משתמשים במכשיר בר ומערבבים מגנטיים, דגימות מקום בצלחת ומערבבים בתוך חממת 30 מעלות צלזיוס במשך נביגה.
    הערה: המהירות והמערבבים המדויקת עבור הברים ומערבבים המגנטיים אינה חשובה מאוד, כל עוד כל הברים נעים במרץ ואת התרבות מוגזים.
  4. כדי לעקוב אחר התקדמות דרך נביגה, לסגת דגימות מתרבות sporulating להדמיה, להוסיף 6 μl של תאים מן התרבויות sporulating 24 μl של התקשורת נביגה בצלחת coverslip 96 באר (1: 5 דילול). השאירו תאים להסתפק 5 דקות לפני בחינת התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
    הערה: תאי sK1 סוג ברים, נבגים בוגרים קומפקטיים יהוו ידי 36 שעות לאחר העברת מדיה נביגה. התקדמות דרך נביגה ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ באמצעות סמנים ניאון, כגון סמן גרעיני (כלומר, Htb2-mCherry 18) לבחון את חלוקת meiotic או סמן קרום prospore (כלומר, G20 19) לבחון morphogenesis נבג. לחלופין, היווצרות נבגי refractile ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ Nomarski דסק"ש החל כ -12 שעות לאחר העברה למדיה נביגה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להעריך בפרוטוקול זה, יעילות נביגה המתקבלת sporulating תאי צלחות multiwell (כמתואר לעיל) הושוותה תאים התנבג באמצעות כמויות גדולות יותר צלוחיות (טבלה 2). השימוש צלחות multiwell לא להשיג את היעילות הגבוהה לראות כאשר sporulating צלוחיות, שבו ~ 80% יעילות ניתן לראות באופן שגרתי. Sporulating צלחות multiwell עם אוורור נאה (המסופק על ידי חרוזי זכוכית או ברים ומערבבים) יכולה להשיג יעילות נביגה מספיק גדול מ -50%, עם התוצאות הטובות ביותר (היעיל 66%) שהושג באמצעות בר ומערבב 5 מ"מ x 2 מ"מ. נביגה נציג של שני זנים שונים (סוג בר smk1Δ) מוצגת כאן (איור 1). תאים אלו נבחנים לאחר 36 שעות במדיה נביגה ו דמיינו באמצעות צלחת תחתית זכוכית 96 באר.

84 / 54584fig1.jpg "/>
איור 1:. Sporulating תאים מתוך נביגה נציג סוג הפרוע ותאי smk1Δ 20 התנבג בתוך 96 צלחות multiwell. התאים היו דמיינו באמצעות המטרה 63X על מיקרוסקופ הפוכה. Tetrads Refractile (ראשי חץ) ניתן לראות בתרבות הסוג הברה, אבל לא בתרבות המכילה תאי smk1Δ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נביגה נבדקה באמצעות אחת מעמד מ"מ 5 או 7 מ"מ ומערבבים בר, שכל אחד מהם מתאים בתוך הבאר של צלחת multiwell 1.3 מ"ל 96 (טבלה 2). שימוש בר 7 מ"מ ומערבבים הביא יעילות נביגה עלוב (28%) לעומת יעילות גבוהה יותר (66%) השיגו באמצעות סרגל 5 מ"מ ומערבבים. הבר ומערבבים 7 מ"מ באר נטו אינטראקציה עם בר ומערבביםn גם סמוכים (איור 1), מניעת הסורגים מלהיות מסוגל לעורר כראוי ולספק אוורור נאות של תרבות.

תאי sporulating (%) SEM (%)
בקבוק ב שייקר 82 1.8
לא חרוז שייקר 17 2.4
חרוז שייקר 56 3
לא בר ומערבבים בצלחת ומערבבים 10 2.2
5 מ"מ ומערבבים בר על צלחת ומערבבים 66 3.9
7 מ"מ ומערבבים בר על צלחת ומערבבים 28 6.7
SEM = סטיית התקן של הממוצע

טבלה 2:יעילות נביגה באמצעות תנאים שונים. נביגה נערכה ב 96 צלחות multiwell היטב כפי שתוארה לעיל, או, אם ציינו, ב 500 מיליליטר צלוחיות המכילות 50 מיליליטר של תקשורת נביגה. שמונה בארות שונות היו בממוצע עבור כל תנאים שבוצעו צלחת multiwell. שלושה בקבוקונים שונים היו התנבג. כל התרבויות משכפלות טכני, התחיל מאותה המושבה של Htb2 mCherry-tagged אבל חוץ מזה זן שמרים פראי סוג דיפלואידי sK1 (LH902 18). תאים אלה גדלו בבקבוק יחיד של YPD ובקבוק אחד של YPA, וחלקו אז לחסן צלחות 96-היטב המכילות תקשורת נביגה, כפי שתואר לעיל. יעילות נביגה היה assayed ידי ספירת נבגים refractile 36 שעות לאחר ההעברה למדיה נביגה באמצעות מיקרוסקופ brightfield Nomarski דסק"ש.

איור 2
איור 2: מערבביםברים ב 96 צלחות multiwell 1.3 מ"ל. תרבות נביגה המכיל גם (א) 5 מ"מ x 2 מ"מ ברים ומערבבים (אדום) או (ב) 7 מ"מ x ברים ומערבבים 2 מ"מ (כחול) בצלחת multiwell 96 1.3 מ"ל על סערה מגנטית צַלַחַת. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מציגים פרוטוקול sporulating שמרים sK1 במתכונת multiwell 96. אוורור הוא מפתח עבור נביגה יעילה, אשר מחייבת שימוש או בר ומערבב או חרוז זכוכית בכל טוב. כאשר תאים התנבג בצלחת multiwell 96 בתוך חממה רועדת בלי שאחד חרוז או ומערבבים ברים, תאים אינם sporulate ביעילות. רק עלייה קטנה יעילות נביגה נתפסת כאשר התאים התנבג מבלי שאיש חרוז או בר ומערבבים בתוך חממה רועד, לעומת להיות ב 30 מעלות צלזיוס ללא תסיסה (טבלה 1; 17% ב שייקר vs 10% להציב על ומערבבים צַלַחַת). באופן דומה, השימוש של בר 7 מ"מ ומערבבים הביא יעילות נביגה עלוב (28%), ככל הנראה משום 7 מ"מ ומערבבים ברים לא לאורר את התרבות כראוי עקב אינטראקציות עם ברים ומערבבים בבארות הסמוכות. פרוטוקול זה מתאר בעיות עבור נביגה באמצעות סינכרוני וביעילות sporulating זן שמרים sK1 7,8 נפוץ ללמוד SPOrulation; יעילות נביגה שניתן להשיג עם זני שמרים אחרים באמצעות פרוטוקול זה צריכה להיבדק לפני ביצוע מסך גדול באמצעות טכניקות אלה.

למרות תוצאות ברות ומערבב 5 מ"מ x 2 מ"מ בתוך נביגה מעט טוב יותר לעומת השימוש של חרוז זכוכית (66% עם 5 מ"מ x 2 מ"מימ ומערבבים ברי vs 56% עם חרוז זכוכית), העלות הנדרשת לרכישה ומערבבים מספיק ברים עבור כל טוב יכולים להיות מונעים. הנצילות נביגה שהושגו באמצעות חרוז זכוכית מספקות פתרון בעלות נמוכה שיוצר אוורור מספיק להקרנת תפוקה גבוהה בפורמט 96 multiwell 16. למרבה הצער, התוספת של בר ומערבב או חרוז זכוכית לא להשיג את יעילות נביגה גבוהה מאוד (בדרך כלל ~ 80% או יותר) לראות כאשר sporulating צלוחיות, ובכך פנוטיפים נביגה עדינים עשויים להיות קשים לזהות כאשר הקרנת 96 באר פוּרמָט.

בניגוד לשיטות נביגה שתוארו לעיל 9-13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ג'וזף פ הילי מאוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון (LSH) ו R15 GM86805 מ- NIH (LSH). SMP הוא נתמך בחלקו על ידי עמיתי Sanofi-ג'נזיים באוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates ThermoScientific 260251 Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates ThermoScientific 278743 Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead Fisher 11-312A Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 Fisher 14-511-82 Used for sporulation
96 well frogger V&P Scientific VP407 needed for step 1.2
library copier V&P Scientific VP381 needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular Petri dish ThermoScientific 264728 needed for step 1.2
Bacto Peptone BD 211677 needed for media
Yeast Extract BD 212750 needed for media
Bacto Agar BD 212750 needed for media
Dextrose Fisher D16-3 needed for media
Potassium Acetate Fisher P171-500 needed for media
Glycerol Fisher G33-500 needed for media
Black 96 well glass bottom plate MatTek PBK96G-1.5.5-F needed for step 2.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  2. Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
  3. Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
  4. Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
  5. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
  6. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  7. Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
  8. Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
  9. McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
  10. Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
  11. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
  12. Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
  13. Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
  14. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  15. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
  16. Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
  17. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  18. Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
  19. Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  20. Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 115 שמרים ניצנים המיוזה נבג gametogenesis מסך גנטי תנאים נביגה
נביגה יעילה של<em&gt; שמר האפייה</em&gt; בתוך פורמט 96 multiwell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paulissen, S. M., Huang, L. S.… More

Paulissen, S. M., Huang, L. S. Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format. J. Vis. Exp. (115), e54584, doi:10.3791/54584 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter