Introduction
Sporedannelse i knopskydende gær er blevet undersøgt for at give indsigt i mange aspekter af biologi, herunder kontrol af kromosom segregering under meiose 1, mekanismer for genetisk rekombination 2, kontrol med udvikling af cellesignalerende 3, ernæringsmæssige kontrol med udvikling 4, den transkriptionelle regulering af udvikling 5, og undersøgelsen af sporedannelse 6. Spore dannelsen indeholder et nyt celledeling begivenhed involverer dannelsen af nye membran rum inden moderen celle efterfulgt af aflejring af en beskyttende spore væg 6. Disse undersøgelser, der undersøger sporulerende celler tager ofte fordel af det hastigt sporedannende gærstamme SK1, som kan gennemgå processen med sporulering i omkring 24 timer i en relativt effektiv måde 7,8. Selvom optimering af sporulering betingelser for knopskydende gær er blevet beskrevet 9-13, disse forsøgs undersøgte sporedannelse på faste medier eller i større målestok flydende kulturer hvor sporedannelse udføres under anvendelse kultur rør eller kolber.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til sporedannende gær i en 96 flerbrøndsplade format. Vi finder, at denne metode, beluftning er kritisk for synkron og effektiv sporulering, og har udtænkt teknikker til at sikre tilstrækkelig sporulering et lille volumen brønde format. Sporedannende i en 96 flerbrøndsplade format giver mulighed for celler, der skal screenes ved hjælp af høj-throughput teknikker og reagenser optimeret til en flerbrøndsplade format, såsom screening for højt kopiantal suppressorer bruger flisebelagt bibliotek 14-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse til Sporulation
Bemærk:. De er beskrevet i denne protokol medier udføres med almindeligt opskrifter og metoder 13,17 Tabel 1 giver formuleringen til 1 l af de forskellige medier, der anvendes i denne protokol.
| Bacto Peptone | gærekstrakt | Bacto Agar | dextrose | kaliumacetat | Glycerol | Hedeselskabet 2 O | |
| YPG plader | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 ml | 970 ml |
| YPD-plader | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1000 ml |
| YPD flydende | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1000 ml |
| YPA væske | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1000 ml |
| sporulation medier | - | - | - | - | 10 g | - | 1000 ml |
Tabel 1:. Media formuleringer beløb er 1 liter medier. Specifikt om medieringredienser kan findes i Materialetabel.
- Hvis alle sporedannende Celler vil være den samme genotype, følge denne procedure:
- Tø gærstamme, der skal anvendes på en YPG (YPGlycerol) plade. Grow gær til 12-16 timer ved 30 ° C. Vigtigere, er SK1- celler også klar til at danne sporer, så SK1- stammer bør ikke stå for længe på YPG plader, eller de kan danne sporer på pladen.
Bemærk: En frisk optøet stamme dyrket på YPG foretrækkes, da anvendelse af glycerol som carbonkilde kræver oxidativ phosphorylering, og dermed selekterer for celler, der har funktionelle mitokondrie-DNA. SK1- celler har en tendens til at miste funktionel mitokondrie-DNA og blive petites. Der er behov for funktionelle mitokondrie-DNA til sporedannelse. - Streak gær fra YPG plade på en YPD (YPDextrose) plade til enkelte kolonier. Grow gær på YPD plade 24-28 timer ved 30 ° C.
- Efter omkring 36-48 timers vækst på YPD faste medier, start en 25 ml YPD kultur ved hjælp af en enkelt kolonifra YPD plade. Grow denne kultur indtil celler er om OD600 = 4,0 til 7,0. Udfør dette trin ved 30 ° C natten over i en rysteinkubator, ryster ved 220 rpm.
- Fra YPD kultur, bruge en passende mængde celler til at starte 1.000 ml YPA (YPAcetate) kultur, der er OD600 = 0,1 for hver plade med 96 brønde behov i kapitel 2. Dyrk gær i en 30 ° C rysteinkubator (omrystning ved 220 rpm), indtil kulturen OD600 er mellem 1,3 til 1,5.
Bemærk: Der podes 100 ml YPA kultur for hver 96 flerbrøndspladen der skal screenes i kapitel 2. Hvis f.eks screening fire 96 flerbrøndsplader, vil der være behov 400 ml YPA kultur. Startende med 10% ekstra volumen i YPA kultur er nødvendig for at beskytte mod tab ved fordampning volumen. Det vil typisk tage mellem 12-16 timer for celler til at nå det passende OD 600; den tid kan variere efter genotype gærstammen. YPA er presporulation medier. Pregrowthi acetat hjælper inducere ekspression af gener (såsom IME1) behov for effektiv og synkron sporulering 6. - Centrifugering ved 1.800 x g i en bordcentrifuge i 5 minutter for at pelletere celler dyrket i YPA. Vask cellerne 1x med 0,5 volumen sterilt autoklaveret deioniseret vand. Spin igen, og kassér vask. Resuspender cellerne i 1x volumen sporulering medier. Fortsæt til afsnit 2.
- Tø gærstamme, der skal anvendes på en YPG (YPGlycerol) plade. Grow gær til 12-16 timer ved 30 ° C. Vigtigere, er SK1- celler også klar til at danne sporer, så SK1- stammer bør ikke stå for længe på YPG plader, eller de kan danne sporer på pladen.
- Hvis der anvendes celler til sporedannelse, der er af forskellige genotyper, (dvs. transformeret med forskellige plasmider eller indeholder forskellige mutationer, der typisk er fremstillet og opbevaret som frosne lagre), array-celler af de forskellige genotyper i en 96 brønde format. Følg derefter denne procedure:
- Brug en steril 96 gren frogger at overføre celler fra optøede frosne lagre i 96 flerbrøndspladen (r) på YPG faste medier. Grow gær natten over ved 30 ° C.
- Ved hjælp af en steril 96 gren Frogger, overføre celler fra YPG faste medier på YPD faste medier eller selektivfaste medier (dvs. syntetiske minimalmedier mangler aminosyrerne, hvis cellerne indeholder plasmider, der kræver udvælgelse). Grow gær ved 30 ° C, indtil kolonier er dannet for hver stamme, typisk 1 dag på YPD og 2 dage, hvis selektive medier er nødvendig.
- Alikvot 1,2 ml YPD flydende medier eller selektive flydende medier i hver brønd i en 96 dybe 2 ml flerbrøndspladen. Overfør celler fra faste medier i flydende medier ved hjælp af en frogger, dække med et plastlåg holdt på plads med tape, og vokse natten over i 30 ° C-ryster, omrystning ved 220 rpm.
Bemærk: For at minimere forurening, dækplader ved hjælp af plastlåg fra en rektangulær petriskål. Hold låg på plads ved hjælp af et stykke tape, så luftcirkulationen er minimalt begrænset. - Centrifugér plader ved 1.800 xg i 5 minutter under anvendelse af en svingende spand centrifuge med adaptere til at rumme plader med 96 brønde. Hæld medier fra celler; tilsættes 500 pi YPA til hver brønd og resuspender pelleterede celler i YPA. Dække overmed plastlåg holdes på plads af tapen.
- Grow celler i 15 timer ved 30 ° C i en rysteinkubator, omrystning ved 220 rpm. Fortsæt til afsnit 2.
2. sporedannende Celler i en 96 Multiwell format
- Tilføj enten en 3 mm sterilt faststof glasperle eller en steril 5 mm x 2 mm magnetisk omrører i hver brønd i en plade med 96 med 1,3 ml brønde. (Se Repræsentative resultater nedenfor for en diskussion om, hvorvidt at bruge en perle eller en omrører.)
- Hvis alle celler, der skal screenes, er af samme genotype, gå til 2.2.1. Hvis celler, der skal screenes, er af forskellige genotyper, gå til 2.2.2.
- Tage celler fra trin 1.1.5 og alikvot 500 pi celler plus medier i hver brønd på 96 flerbrøndspladen. Dæk med plastlåg holdes på plads af tapen. Fortsæt til 2.3.
- Spin celler, der er i YPA fra 1.2.4 ved 1800 xg i 5 min, ved hjælp af en svingende spand centrifuge med adaptere til at rumme 96-brønds plader. Hæld aff medier fra celler. Der tilsættes 500 pi sporulering medier til hver brønd og resuspender pelleterede celler i sporulering medier. Dæk med plastlåg holdes på plads af tapen. Fortsæt til 2.3.
- Hvis du bruger en glasperle, placere prøver i en rystende inkubator ved 30 ° C og rystes ved 220 rpm for sporedannelse. Hvis anvendelse af en magnetisk omrører, place prøver på en omrøringsplade indersiden af en 30 ° C inkubator i sporedannelse.
Bemærk: Den nøjagtige røre hastighed for de magnetiske røre barer er ikke meget vigtigt, så længe alle søjler bevæger energisk og kulturen beluftes. - At overvåge fremadskriden gennem sporulering, trække prøver fra sporedannende kultur for visualisering, Tilføj 6 pi celler fra sporedannende kulturer til 24 pi sporedannelse medier i en 96 brønds dækglas plade (1: 5 fortynding). Lad celler til at nøjes med 5 min før at undersøge celler ved hjælp af et omvendt mikroskop.
Bemærk: I vildtype SK1- celler, vil kompakte modne sporer dannes med 36 timer efter overførsel til sporedannelse medier. Progression gennem sporedannelse kan overvåges ved mikroskopi hjælp fluorescerende markører, såsom en nuklear markør (dvs. HTB2-mCherry 18) for at undersøge den meiotiske deling eller en prospore membran markør (dvs. G20 19) undersøge spore morfogenese. Alternativt kan dannelsen af refraktile sporer ses under anvendelse Nomarski DIC mikroskopi starter ca. 12 timer efter overførsel til sporedannelse medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere denne protokol blev sporulering virkningsgrader opnået fra sporedannende celler i flerbrøndsplader (som beskrevet ovenfor) sammenlignet med celler sporulerede anvende større mængder i kolber (tabel 2). Anvendelsen af flerbrøndsplader nåede ikke den høje effektivitet ses, når sporedannende i kolber, hvor ~ 80% effektivitet kan rutinemæssigt set. Sporedannende i flerbrøndsplader med korrekt beluftning (tilvejebragt af glasperler eller stir søjler) kan opnå tilstrækkelige sporulering effektiviteter større end 50%, med de bedste resultater (66% effektivitet) ved anvendelse af en 5 mm x 2 mm omrører. Et repræsentativt sporulering af to forskellige stammer (vildtype og smk1Δ) Her vises (figur 1). Disse celler undersøges efter 36 timer i sporedannelse medier og visualiseres ved hjælp af en 96 godt glas bundplade.
84 / 54584fig1.jpg "/>
Figur 1:. Sporedannende celler fra en repræsentativ sporulering vildtype og smk1Δ celler 20 sporuleret i en 96 flerbrøndsplader. Celler blev visualiseret under anvendelse af et 63X objektiv på et omvendt mikroskop. Refraktile tetrader (pilespidser) kan ses i vildtype kultur, men ikke i kultur indeholdende smk1Δ celler. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Sporedannelse blev testet under anvendelse af enten en 5 mm eller 7 mm omrører, som hver især passer i brønden i en 96 1,3 ml flerbrøndspladen (tabel 2). Ved hjælp af en 7 mm omrører resulterede i dårlig sporulering effektivitet (28%) sammenlignet med højere effektivitet (66%) opnået ved anvendelse af 5 mm omrører. Den 7 mm omrører i en brønd tendens til at interagere med en omrører i enn tilstødende brønd (figur 1), hvilket forhindrer stængerne i at være i stand til korrekt at omrøre og tilvejebringe tilstrækkelig beluftning af kulturen.
| sporulerende celler (%) | SEM (%) | |
| kolbe i shaker | 82 | 1.8 |
| ingen perle i shaker | 17 | 2.4 |
| perle i shaker | 56 | 3 |
| ingen omrører på omrøringsplade | 10 | 2.2 |
| 5 mm omrører på omrøringsplade | 66 | 3.9 |
| 7 mm omrører på omrøringsplade | 28 | 6.7 |
| SEM = standardafvigelse af middelværdien |
Tabel 2:Sporedannelse effektiviteter under anvendelse af forskellige betingelser. Sporedannelse blev gennemført i 96 brønds flerbrøndsplader som beskrevet ovenfor, eller, hvis bemærkes, i 500 ml kolber indeholdende 50 ml sporedannelse medier. Otte forskellige brønde blev midlet for hver betingelse udføres i en flerbrøndsplade. Tre forskellige kolber blev sporuleret. Alle kulturer er tekniske replikater, startes fra samme koloni af mCherry-mærkede HTB2 men ellers vildtype diploid SK1 gærstamme (LH902 18). Disse celler blev dyrket i samme kolbe YPD og en enkelt kolbe af YPA, og derefter opdelt til podning 96-brønds plader indeholdende sporedannelse medier, som beskrevet ovenfor. Sporedannelse effektivitet blev analyseret ved tælling refraktile sporer 36 timer efter overførsel til sporedannelse medier ved anvendelse Nomarski DIC brightfield mikroskopi.
Figur 2: Stirbarer i 96 1.3 ml flerbrøndsplader. Sporedannelse kultur indeholdende enten (A) 5 mm x 2 mm stir stænger (rød) eller (B) 7 mm x 2 mm stir barer (blå) i en 96 1,3 ml flerbrøndsplade på en magnetisk omrører plade. Scale bar = 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en protokol for sporedannende SK1 gær i en 96 brønde format. Beluftning er nøglen til effektiv sporulering, der kræver brug af enten en omrører eller en glasperle i hver brønd. Når celler sporuleret i en 96 flerbrøndsplade i en rysteinkubator uden enten en vulst eller en omrører, gør cellerne ikke danne sporer effektivt. Kun en lille stigning i sporedannelse effektivitet ses når celler sporuleret uden enten en vulst eller en omrører i en rysteinkubator, sammenlignet med at være ved 30 ° C uden omrøring (tabel 1; 17% i shaker vs 10% anbragt på en omrører plade). Tilsvarende er anvendelsen af en 7 mm omrører resulterede i dårlig sporulering effektivitet (28%), sandsynligvis fordi de 7 mm rør stænger ikke luftes kulturen ordentligt på grund af interaktioner med stir barer i tilstødende brønde. Denne protokol beskriver betingelserne for sporedannelse ved anvendelse af synkront og effektivt sporedannende SK1 gærstamme 7,8 anvendes almindeligvis til at studere sporulation; sporedannelse effektivitetsgevinster, der kan opnås med andre gærstammer der bruger denne protokol bør undersøges inden en stor skærm ved hjælp af disse teknikker.
Selvom en 5 mm x 2 mm omrører resulterer i en lidt bedre sporulering sammenlignet med anvendelsen af en glasperle (66% med 5 mm x 2 mm omrører vs 56% med en glaskugle), omkostningerne skal købe nok røre søjler for hver brønd kan være uoverkommelige. De sporedannelse effektivitet opnået ved anvendelse af en glasperle tilvejebringer en billig løsning, der skaber nok beluftning i high-throughput screening i en 96 brønde format 16. Desværre har tilføjelsen af en omrører eller en glasperle ikke opfylde de meget høje sporulering effektivitet (typisk ~ 80% eller højere) ses, når sporedannende i kolber, og dermed subtile sporulering fænotyper kan være vanskeligt at detektere, når screening i en 96 brønd format.
I modsætning tidligere beskrevne sporulering metoder 9-13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Joseph P. Healey bevilling fra University of Massachusetts Boston (LSH) og R15 GM86805 fra NIH (LSH). SMP understøttes delvist af en Sanofi-Genzyme Fellowship ved University of Massachusetts Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
