Introduction
Sporulering i det spirende gjær har blitt studert for å gi innsikt i mange aspekter av biologi, herunder kontroll av kromosom segregering under meiose 1, mekanismer for rekombinasjon 2, kontroll av utviklingen av cellesignalisering 3, ernæringsmessige kontroll av utviklingen 4, den transkripsjonelle regulering av utvikling 5, og undersøkelse av sporedannelse 6. Sporedannelse omfatter en ny celledeling hendelse som medfører dannelse av nye membran oppbevaringsrom innenfor modercellen, fulgt av avsetning av et beskyttende sporevegg 6. Disse studiene som undersøker sporedannende celler ofte dra nytte av den raskt sporedannende gjærstamme SK1, som kan gjennomgå prosessen med sporulation i ca 24 timer på en relativt effektiv måte 7,8. Selv om optimalisering av sporulation vilkår for spirende gjær har blitt beskrevet 9-13, disse eksperiments kontrollert sporedannelsen på fast medium eller i større skala flytende kulturer der sporedannelsen utføres ved anvendelse av kultur rør eller kolber.
Her beskriver vi en fremgangsmåte for sporedannende gjær i en 96 flerbrønn plateformat. Vi finner at for denne metoden, er kritisk for synkron og effektiv sporulering lufting, og har utviklet teknikker for å sikre tilstrekkelig sporulering et lite volum for flere brønner format. Sporedannende i en 96 multiwell plate format gjør det mulig for cellene å bli vist ved hjelp av high-throughput teknikker og reagenser som er optimalisert for en multiwell plate format, slik screening for høye kopidempere ved hjelp av en flislagt bibliotek 14-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse til sporulation
Merk:. Mediene er beskrevet i denne protokollen er laget ved hjelp av standard oppskrifter og metoder 13,17 Tabell 1 viser formuleringen for en L av de ulike mediene som brukes i denne protokollen.
| Bacto Pepton | Gjærekstrakt | Bacto Agar | druesukker | kalium Acetat | glyserol | DDH 2 O | |
| YPG plater | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 ml | 970 ml |
| YPD plater | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1000 ml |
| YPD væske | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1000 ml |
| YPA væske | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1000 ml |
| sporulation media | - | - | - | - | 10 g | - | 1000 ml |
Tabell 1:. Medie formuleringer beløpene er gitt for en L av media. Nærmere om mediaingredienser kan bli funnet i Materials tabell.
- Hvis alle sporedannende celler vil bli det samme genotype, følg denne prosedyren:
- Tine gjærstamme som skal brukes på en YPG (YPGlycerol) plate. Grow gjær for 12-16 timer ved 30 ° C. Viktigere er SK1 celler også klar til å sporulate, så SK1 stammer bør ikke stå for lenge på ypg plater, eller de kan sporulate på tallerkenen.
Merk: En nylig tint stamme dyrket på YPG er å foretrekke, da anvendelse av glyserol som en karbonkilde krever oksidativ fosforylering, og således selekterer for celler som har funksjonelle mitokondrie DNA. SK1 celler har en tendens til å miste funksjonell mitokondrie DNA og blir petites. Funksjonell mitokondrie DNA er nødvendig for sporulering. - Streak gjær fra YPG platen på en YPD (YPDextrose) plate for enkeltkolonier. Grow gjær på YPD plate 24-28 timer ved 30 ° C.
- Etter ca 36-48 timer med vekst på YPD faste medier, starter en 25 ml YPD kultur ved hjelp av en enkelt kolonifra YPD plate. Grow denne kulturen til cellene om OD 600 = 4,0 til 7,0. Utfør dette trinnet ved 30 ° C over natten i en risteinkubator, rist ved 220 rpm.
- Fra YPD-kulturen, bruke en passende mengde av celler for å starte 1000 ml YPA (YPAcetate) kulturen som er OD 600 = 0,1 for hver 96-brønners plate behov i avsnitt 2. dyrke gjær i en 30 ° C rysteinkubator (risting ved 220 rpm) helt til kulturen OD 600 er mellom 1,3 til 1,5.
Merk: Inokuler 100 ml YPA kultur for hver 96 multiwell plate å bli vist i kapittel 2. For eksempel hvis screening fire 96 multibrønnplater, vil 400 ml YPA kultur være nødvendig. Fra og med 10% ekstra volum i YPA kultur er nødvendig for å beskytte mot fordamping volumtap. Vanligvis vil det ta mellom 12-16 timer for celler for å oppnå den passende OD 600; tiden kan variere avhengig av genotypen av gjærstammen. YPA er presporulation media. Pregrowthi acetat bidrar til å indusere ekspresjon av gener (for eksempel IME1) som trengs for effektiv og synkront sporulering 6. - Spin ved 1800 xg i en bordsentrifuge i 5 min til pellet celler dyrket i YPA. Vask cellene 1x med 0,5 volum av sterilt avionisert vann autoklaveres. Spin igjen, og kast vask. Resuspender celler i 1x volum sporulation medier. Fortsett til punkt 2.
- Tine gjærstamme som skal brukes på en YPG (YPGlycerol) plate. Grow gjær for 12-16 timer ved 30 ° C. Viktigere er SK1 celler også klar til å sporulate, så SK1 stammer bør ikke stå for lenge på ypg plater, eller de kan sporulate på tallerkenen.
- Hvis du bruker celler for sporulation som er av ulike genotyper, (dvs. transformert med forskjellige plasmider eller inneholder forskjellige mutasjoner, typisk innhentet og lagret som frosset aksjer), array-cellene i de ulike genotypene til en 96 multiwell format. Følg deretter denne fremgangsmåten:
- Bruk en steril 96 spiss Frogger å overføre celler fra tint frosne aksjer i 96 multiwell plate (e) på YPG faste medier. Grow gjær over natten ved 30 ° C.
- Ved hjelp av en steril 96 spiss Frogger, overføre celler fra YPG faste medier på YPD faste medier eller selektivfast medium (dvs. syntetisk minimalt medium som mangler aminosyrene, hvis cellene inneholder plasmider som krever valg). Dyrke gjær ved 30 ° C inntil kolonier blir dannet for hver stamme, typisk en dag på YPD og 2 dager hvis selektive medier er nødvendig.
- Alikvot 1,2 ml YPD flytende media eller selektive flytende media inn i hver brønn av en 96 dyp 2 ml flere brønner plate. Overfør cellene fra faste medier i flytende medier med en Frogger, dekk med plastlokk holdt på plass av båndet, og vokse over natten i 30 ° C shaker, rist ved 220 rpm.
Merk: For å minimere forurensning, dekkplater ved hjelp av plastlokk fra en rektangulær petriskål. Hold lokkene på plass ved hjelp av et stykke tape, slik at luftsirkulasjonen er minimalt begrenset. - Sentrifuger platene ved 1800 xg i 5 min, ved hjelp av en svingende spann sentrifuge med adaptere for å få plass til 96-brønners plater. Hell av media fra celler; tilsett 500 mL YPA til hver brønn og resuspender pelleterte celler i YPA. Dekkemed plastlokk holdes på plass ved hjelp av tape.
- Dyrke cellene i 15 timer ved 30 ° C i en risteinkubator, risting ved 220 rpm. Fortsett til punkt 2.
2. sporedannende celler i en 96 multibrønnformat
- Tilsett enten en 3 mm sterile faste glassperle eller en steril 5 mm x 2 mm magnetisk rørestav i hver brønn av en 96-brønners plate med 1,3 ml brønner. (Se Representant Resultater under for en diskusjon om å bruke en perle eller en rørepinne.)
- Dersom alle celler som skal skjermes er av den samme genotype, gå til 2.2.1. Hvis cellene til å bli vist er av forskjellige genotyper, gå til 2.2.2.
- Ta celler fra trinn 1.1.5 og delmengde 500 mL av celler pluss media i hver brønn av 96 multiwell plate. Dekk med plast lokk holdes på plass av tape. Fortsett til 2,3.
- Spin-celler som er i YPA fra 1.2.4 ved 1800 xg i 5 min, ved hjelp av en svingende spann sentrifuge med adaptere for å få plass til 96-brønners plater. hell avf media fra cellene. Legg 500 mL av sporulering media til hver brønn og resuspender pelleterte celler i sporulering media. Dekk med plast lokk holdes på plass av tape. Fortsett til 2,3.
- Hvis du bruker en glassperle, sted prøver i en risteinkubator ved 30 ° C og rist ved 220 rpm for sporulation. Hvis du bruker en magnetisk rørestav sted prøvene på en røreplate inne i en C inkubator for sporulation 30 °.
Merk: Den nøyaktige røre hastighet for de magnetiske oppstuss barer er ikke veldig viktig, så lenge alle barer beveger energisk og kulturen er luftet. - For å overvåke progresjon gjennom sporulering, ta ut prøver fra sporulerende kultur for visualisering, Tilsett 6 mL av celler fra sporulerende kulturer til 24 pl av sporulering media i en 96-brønners dekkplaten (1: 5 fortynning). La cellene til å betale for 5 min før undersøke celler ved hjelp av en invertert mikroskop.
Merk: I villtype SK1 celler, vil kompakte modne sporer dannes av tre6 timer etter overføring til sporulation medier. Progresjon gjennom sporulering kan overvåkes ved hjelp av mikroskopi fluorescerende markører, for eksempel en kjernefysisk markør (det vil si Htb2-mCherry 18) for å undersøke den meiotisk divisjon eller en prospore membran markør (det vil si, G20 19) for å undersøke spore morfogenese. Alternativt kan dannelsen av refraktile sporer sees ved hjelp av Nomarski DIC mikroskopi som starter omtrent 12 timer etter overføring til sporulering media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere denne protokollen, ble sporulering effektivitet oppnådd fra sporedannende celler i multibrønnplater (som beskrevet ovenfor) sammenlignet med celler sporulerte ved hjelp av større volumer i kolber (tabell 2). Bruk av multibrønnplater oppnådde ikke den høye effektiviteten sett når sporedannende i kolber, hvor ~ 80% virkningsgrad kan rutinemessig sett. Sporedannende i multibrønnplater med passende lufting (levert av glassperler eller rør bar) kan oppnå tilstrekkelige sporulering effektivitet større enn 50%, med de beste resultater (66% effektivitet) oppnådd ved bruk av en 5 mm x 2 mm rørestav. En representant sporulation av to forskjellige stammer (villtype og smk1Δ) får her (figur 1). Disse cellene blir undersøkt etter 36 timer i sporulation media og visualisert ved hjelp av en 96 godt glass bunnplate.
84 / 54584fig1.jpg "/>
Figur 1:. Sporedannende celler fra en representant sporulation villtype og smk1Δ celler 20 sporulerte i en 96 multibrønnplater. Celler ble visualisert ved hjelp av et 63X objektiv på et invertert mikroskop. Refraktile tetrader (pilhoder) kan ses i villtypekulturen, men ikke i kulturen inneholdende celler smk1Δ. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Sporedannelsen ble testet ved anvendelse av enten en 5 mm eller 7 mm rørestav, som hver passer inn i brønnen i en 96 1,3 ml flere brønner platen (tabell 2). Ved hjelp av en 7 mm rørestav resulterte i dårlig sporulering effektivitet (28%) sammenlignet med høyere effektivitet (66%) oppnås ved hjelp av 5 mm rørestav. Den 7 mm rørepinne i et godt tendens til å samhandle med en rørepinne i enn nærliggende brønn (figur 1), og hindre stengene fra å være i stand til på riktig måte røre og gi tilstrekkelig lufting av kulturen.
| sporedannende celler (%) | SEM (%) | |
| kolbe i shaker | 82 | 1.8 |
| ingen perle i shaker | 17 | 2.4 |
| perle i shaker | 56 | 3 |
| ingen oppsikt bar på stir plate | 10 | 2.2 |
| 5 mm røre bar på stir plate | 66 | 3.9 |
| 7 mm røre bar på stir plate | 28 | 6.7 |
| SEM = standard feil av gjennomsnittet |
Tabell 2:Sporulering effektivitet ved bruk av forskjellige forhold. Sporedannelsen ble utført i 96 brønners multibrønnplater som beskrevet ovenfor, eller, hvis angitt, i 500 ml kolber som inneholdt 50 ml av sporedannelsen media. Åtte forskjellige brønner ble midlet for hver tilstand utføres i en flerbrønn plate. Tre forskjellige kolber ble sporulerte. Alle kulturer er tekniske replikater, startet fra samme koloni av mCherry-merket Htb2 men ellers vill type diploid SK1 gjærstamme (LH902 18). Disse cellene ble dyrket i en enkel kolbe YPD og en enkelt kolbe YPA, og deretter oppdelt til å inokulere 96-brønners plater inneholdende media sporulering, som beskrevet ovenfor. Sporulation effektivitet ble analysert ved å telle refraktile spores 36 timer etter overføring til sporulation medier med Nomarski DIC lysfelt mikroskopi.
Figur 2: Rørbarer i 96 1,3 ml multibrønnplater. sporulation kultur som inneholder enten (A) 5 mm x 2 mm rør barer (rød) eller (B) 7 mm x 2 mm rør barer (blå) i en 96 1,3 ml multiwell plate på en magnetisk oppsikt tallerken. Scale bar = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en protokoll for sporedannende SK1 gjær i en 96 multiwell format. Lufting er viktig for effektiv sporulation, som krever bruk av enten en rørepinne eller et glass perle i hver brønn. Når cellene er sporulerte i en 96 flerbrønn plate i en risteinkubator uten enten en vulst eller en rørestav, gjør cellene ikke sporulere effektivt. Bare en liten økning i sporulering effektivitet blir sett når cellene sporulerte uten enten en vulst eller en rørestav i en risteinkubator, forhold til å være ved 30 ° C uten omrøring (tabell 1; 17% i ryste vs 10% plassert på en røre tallerken). På tilsvarende måte, ved bruk av en 7 mm rørestav resulterte i dårlig sporulering effektivitet (28%), sannsynligvis fordi de 7 mm rør barer ikke lufte dyrknings riktig på grunn av interaksjoner med rør stolper i tilstøtende brønner. Denne protokollen beskriver forholdene for sporulation hjelp av synkront og effektivt sporedannende SK1 gjærstamme 7,8 brukes ofte til å studere sporulation; sporulation effektivitet som kan oppnås med andre gjærstammer som bruker denne protokollen bør undersøkes før du gjennomfører en stor skjerm ved hjelp av disse teknikkene.
Selv om en 5 mm x 2 mm rørestav resulterer i en noe bedre sporedannelsen sammenlignet med bruk av en glassperle (66% til 5 mm x 2 mm rørestav vs 56% med et glassperle), kostnaden som kreves for å kjøpe nok røre stolper for hver brønn kan være uoverkommelige. De sporulation effektivitet oppnås ved hjelp av en glassperle gir en rimelig løsning som skaper nok lufting for high-throughput screening i en 96 multiwell format 16. Dessverre tillegg av en rørepinne eller et glass perle ikke oppnå de svært høye sporulation effektivitet (vanligvis ~ 80% eller høyere) sett når sporedannende i kolber, og dermed subtile sporulation fenotyper kan være vanskelig å oppdage når screening i en 96 godt format.
I motsetning til tidligere er beskrevet sporulation metoder 9-13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Joseph P. Healey stipend fra University of Massachusetts Boston (LSH) og R15 GM86805 fra NIH (LSH). SMP støttes delvis av en Sanofi-Genzyme Fellowship ved University of Massachusetts Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
