Introduction
Sporulering i knoppande jäst har studerats för att ge insikter i många aspekter av biologi, inklusive kontroll vid kromosomsegregation under meios en mekanismer för genetisk rekombination 2, kontroll av utvecklingen av cellsignalering 3, närings kontroll över utveckling 4, transkriptions reglering av utveckling 5, och granskningen av sporbildning 6. Sporbildning innehåller en helt ny celldelnings händelse som innebär bildandet av nya membran fack inom modercellen följt av avsättning av en skyddande spore väggen 6. Dessa studier som undersöker sporulerande celler drar ofta nytta av den snabbt sporbildande jäststammen SK1, som kan genomgå processen för sporulering i omkring 24 h i ett relativt effektivt sätt 7,8. Även optimering av sporulering villkoren för spirande jäst har beskrivits 9-13, dessa experiments undersökte sporulering på fasta medier eller i större skala flytande kulturer där sporulering utförs med hjälp av odlingsrör eller flaskor.
Här beskriver vi en metod för sporbildande jäst i en 96 flerkällsplatta format. Vi finner att för denna metod, är luftning kritisk för synkron och effektiv sporulering, och har tänkt ut tekniker för att säkerställa tillräcklig sporulering en liten volym flerkälls format. Sporbildande i en 96 flerkällsplatta format tillåter celler ses med hög genomströmning tekniker och reagens som är optimerade för en flerkällsplatta format, till exempel screening för höga kopieringsdämpare som använder ett kaklat bibliotek 14-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelser för Sporulering
Anm. Medierna beskrivs i detta protokoll görs med användning av standardrecept och metoder 13,17 Tabell 1 visar formuleringen för ett L av de olika medier som används i detta protokoll.
| Bacto Peptone | Jästextrakt | Bacto Agar | Glukos | kaliumacetat | Glycerol | DDH 2 O | |
| YPG-plattor | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 ml | 970 ml |
| YPD-plattor | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1.000 ml |
| flytande YPD | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1.000 ml |
| YPA vätska | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1.000 ml |
| sporulering media | - | - | - | - | 10 g | - | 1.000 ml |
Tabell 1:. Medie formuleringar belopp ges en liter media. Detaljerad information om mediaingredienser kan hittas i Material Tabell.
- Om alla sporbildande celler kommer att vara samma genotyp, gör så här:
- Tina jäststam som skall användas på en YPG (YPGlycerol) platta. Odla jäst för 12-16 h vid 30 ° C. Viktigt är SK1 celler också redo att sporer, så SK1 stammar bör inte lämnas alltför länge på YPG plattor, eller de kan sporer på plattan.
Notera: En färskt tinade stam odlas på YPG är att föredra, såsom utnyttjande av glycerol som en kolkälla kräver oxidativ fosforylering, och väljer sålunda för celler som har funktionell mitokondrie-DNA. SK1 celler har en tendens att förlora funktionell mitokondrie-DNA och blir petites. Funktionell mitokondrie-DNA behövs för sporulering. - Strimma jäst från YPG plattan på en YPD (YPDextrose) platta för enstaka kolonier. Växa jästen på YPD-platta 24-28 h vid 30 ° C.
- Efter ca 36-48 timmar av tillväxt på YPD fasta medier, startar en 25 ml YPD kultur med hjälp av en enda kolonifrån YPD-platta. Odla denna kultur tills cellerna är om OD 600 = 4,0 till 7,0. Utför detta steg vid 30 ° C över natten i en skakande inkubator skakning vid 220 varv per minut.
- Från YPD kultur, använda en lämplig mängd celler för att starta 1000 ml YPA (YPAcetate) kultur som är OD 600 = 0,1 för varje platta med 96 brunnar behov i kapitel 2. Odla jästen i en 30 ° C skakande inkubator (skakning vid 220 rpm) till dess att odlingen OD 600 är mellan 1,3 till 1,5.
Obs: Inokulera 100 ml YPA kultur för varje 96 flerkällsplatta som ska screenas i kapitel 2. Till exempel, om screening fyra 96 flerbrunnsplattor, kommer 400 ml YPA kultur behövas. Från och med 10% extra volym i YPA kulturen är nödvändig för att skydda mot avdunstningsvolymförlust. Typiskt kommer det att ta mellan 12 till 16 h för celler för att nå den lämpliga OD 600; den tid som kan variera beroende på genotypen av jäststammen. YPA är presporulation media. Pregrowthi acetat hjälper inducera uttryck av gener (såsom IME1) som behövs för en effektiv och synkron sporulering 6. - Centrifugering vid 1800 x g i en bordscentrifug under 5 min för att pelletera celler odlade i YPA. Tvätta cellerna 1x med 0,5 volym sterilt autoklaverat avjoniserat vatten. Snurra igen och kassera tvätta. Resuspendera cellerna i 1x volym sporulering medier. Fortsätt till avsnitt 2.
- Tina jäststam som skall användas på en YPG (YPGlycerol) platta. Odla jäst för 12-16 h vid 30 ° C. Viktigt är SK1 celler också redo att sporer, så SK1 stammar bör inte lämnas alltför länge på YPG plattor, eller de kan sporer på plattan.
- Om du använder celler för sporulering som har olika genotyper, (dvs transformerade med olika plasmider eller innehåller olika mutationer, vanligen erhållna och lagras som frysta lager), matrisceller i de olika genotyper i en 96 flerkälls format. Följ sedan denna procedur:
- Använd en steril 96 stift Frogger att överföra celler från tinade frusna lager i 96 flerkällsplatta (s) på YPG fasta medier. Odlar jäst över natten vid 30 ° C.
- Med hjälp av en steril 96 stift Frogger, överföra celler från YPG fasta medier på YPD fasta medier eller selektivfasta medier (dvs syntetiska minimala medier saknande aminosyrorna, om cellerna innehåller plasmider som kräver val). Växer jäst vid 30 ° C tills kolonier bildas för varje stam, typiskt en dag på YPD och 2 dagar om selektiv media är nödvändig.
- Alikvot 1,2 ml flytande YPD-medium eller selektiva flytande medier i varje brunn i en 96 djupa 2 ml flerkällsplatta. Överför celler från fasta material i flytande media med hjälp av en Frogger, täck med ett plastlock hålls på plats med tejp, och växa över natten i 30 ° C shaker och skaka vid 220 rpm.
Obs! För att minimera kontaminering, täckplåtar med hjälp av plastlock från en rektangulär petriskål. Håll lock på plats med hjälp av en bit tejp, så att luftcirkulationen är minimalt begränsad. - Centrifugera plattorna vid 1800 xg under 5 minuter, med användning av en svängande hink centrifug med adaptrar för att rymma 96-brunnsplattor. Häll av media från cellerna; tillsätt 500 | il YPA till varje brunn och återsuspendera pelleterade cellerna i YPA. Omslagmed plastlock hålls på plats med tejp.
- Odla celler i 15 h vid 30 ° C i en skakinkubator, skakning vid 220 rpm. Fortsätt till avsnitt 2.
2. sporulerande celler i en 96 Multiwell Format
- Tillsätt antingen ett 3 mm steril fasta glaspärla eller ett sterila 5 mm x 2 mm magnetisk omrörarstav i varje brunn i en 96-brunnsplatta med 1,3 ml brunnar. (Se Representativa resultat nedan för en diskussion om användning en kula eller en omrörare.)
- Om alla celler som skall screenas är av samma genotyp, gå till 2.2.1. Om celler som skall screenas är av olika genotyper, gå till 2.2.2.
- Ta celler från steg 1.1.5 och delprov 500 pl celler plus media i varje brunn i 96 flerkällsplatta. Täck med plastlock hålls på plats med tejp. Fortsätt till 2,3.
- Spin celler som är i YPA från 1.2.4 vid 1800 xg under 5 minuter, med användning av en svängande hink centrifug med adaptrar för att rymma 96-brunnsplattor. Häll avf media från celler. Tillsätt 500 pl av sporulering media till varje brunn och återsuspendera pelleterade cellerna i sporulering media. Täck med plastlock hålls på plats med tejp. Fortsätt till 2,3.
- Om du använder en glaspärla, placera prover i en skakinkubator vid 30 ° C och skaka vid 220 rpm under sporulering. Om du använder en magnetisk omrörarstav, placera prover på en omrörningsplatta inne i en 30 ° C inkubator för sporulering.
Obs: Den exakta rör hastighet för de magnetiska omrörare är inte mycket viktigt, så länge alla staplar går energiskt och kulturen luftas. - Att övervaka progression genom sporulering, dra prover från sporulerande kultur för visualisering, Tillsätt 6 pl celler från sporbildande kulturer till 24 pl sporulering media i en 96 väl täckplattan (1: 5 utspädning). Låt cellerna att nöja sig med fem minuter innan man undersöker celler med användning av ett inverterat mikroskop.
Obs: I vildtyp SK1 celler, kommer kompakta mogna sporer bildas genom tre6 timmar efter överföring till sporulering media. Progression genom sporulering kan övervakas genom mikroskopi med användning av fluorescerande markörer, såsom en nukleär markör (dvs. Htb2-mCherry 18) för att undersöka meiotisk delning eller en prospore membranmarkör (dvs G20 19) för att undersöka spore morfogenes. Alternativt kan bildningen av refraktila sporer ses med hjälp Nomarskis DIC mikroskopi börjar ca 12 timmar efter överföring till sporulering media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma detta protokoll, var sporulering effektivitetsvinster från sporbildande celler i flerbrunnsplattor (som beskrivits ovan) jämfört med celler sporulerade användning av större volymer i flaskor (tabell 2). Användningen av flerbrunnsplattor inte uppnå hög effektivitet ses när sporbildande i flaskor, där ~ 80% verkningsgrad kan rutinmässigt sett. Sporbildande i flerbrunnsplattor med rätt luftning (som tillhandahålls av glaspärlor eller omrörare) kan uppnå tillräckliga sporulering effektiviteter större än 50%, med de bästa resultaten (66% effektivitet) erhölls med användning av en 5 mm x 2 mm omrörarstav. En representativ sporulering av två olika stammar (vildtyp och smk1Δ) visas här (figur 1). Dessa celler undersöks efter 36 timmar i sporulering media och visualiseras med hjälp av en 96 brunnar glas bottenplatta.
84 / 54584fig1.jpg "/>
Figur 1:. Sporbildande celler från ett representativt sporulering vildtyp och smk1Δ celler 20 sporulerade i en 96 flerbrunnsplattor. Cellerna visualiseras med en 63x mål på ett inverterat mikroskop. Refraktila tetrader (pilspetsar) kan ses i vildtyp kultur, men inte i den odling innehållande smk1Δ celler. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Sporulering testades med användning av antingen en 5 mm eller 7 mm omröringsstav, av vilka var och passar in i brunnen av en 96 1,3 ml flerkällsplatta (tabell 2). Med användning av en 7 mm omrörarstav lett till dålig sporulering verkningsgrad (28%) jämfört med den högre effektivitet (66%) uppnås med användning av 5 mm omrörarstav. Den 7 mm omrörarstav i en väl tenderade att interagera med en omrörarstav i enn intilliggande brunn (Figur 1), vilket förhindrar stängerna från att kunna korrekt rör om och ge tillräcklig luftning av kulturen.
| sporulerande celler (%) | SEM (%) | |
| kolven i shaker | 82 | 1,8 |
| ingen vulst i shaker | 17 | 2,4 |
| pärla i shaker | 56 | 3 |
| ingen omrörarstav på omrörarplatta | 10 | 2,2 |
| 5 mm omrörarstav på omrörarplatta | 66 | 3,9 |
| 7 mm omrörarstav på omrörarplatta | 28 | 6,7 |
| SEM = standardfel av medelvärdet |
Tabell 2:Sporulering effektiviteter med användning av olika förhållanden. Sporulering genomfördes i 96 brunnars flerbrunnsplattor som beskrivet ovan, eller, om den finns, i 500 ml kolvar innehållande 50 ml av sporulering medier. Åtta olika brunnar var i genomsnitt för varje tillstånd utförs i en flerkällsplatta. Tre olika kolvar sporbildning. Alla kulturer är tekniska replikat, startade från samma kolonin mCherry-märkta Htb2 men annars vildtyp diploida SK1 jäststam (LH902 18). Dessa celler odlades i en enda kolv med YPD och en enda kolv med YPA, och sedan delas för att inokulera 96-brunnsplattor innehållande sporulering media, såsom beskrivits ovan. Sporulering effektivitet analyserades genom att räkna refraktila sporer 36 timmar efter överföring till sporulering media med Nomarskis DIC bright mikroskopi.
Figur 2: Rörbarer i 96 1,3 ml flerbrunnsplattor. Sporulering kultur innehållande antingen (A) 5 mm x 2 mm omrörare (röd) eller (B) 7 mm x 2 mm omrörare (blå) i en 96 1,3 ml flerkällsplatta på en magnetomrörarstav tallrik. Skala bar = 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för sporbildande SK1 jäst i en 96 multibrunn format. Luftning är nyckeln till effektiv sporulering, som kräver användning av antingen en omrörare eller en glaspärla i varje brunn. När cellerna sporbildning i en 96 flerkällsplatta i ett skakande inkubator utan antingen en kula eller en omrörare, gör cellerna inte sporer effektivt. Endast en liten ökning av sporbildning effektivitet ses när celler sporulerade utan antingen en kula eller en omrörare i en skakande inkubator, jämfört med att vara vid 30 ° C utan omröring (Tabell 1; 17% i shaker vs 10% placeras på en uppståndelse tallrik). På liknande sätt, användning av en 7 mm omrörarstav lett till dålig sporulering verkningsgrad (28%), sannolikt eftersom de 7 mm rör om barer inte lufta kulturen ordentligt på grund av interaktioner med omrörare i intilliggande brunnar. Detta protokoll beskriver villkoren för sporulering med hjälp av synkront och effektivt sporbildande SK1 jäststam 7,8 som vanligen används för att studera sporulation; sporulering effektivitetsvinster som kan uppnås med andra jäststammar som använder detta protokoll bör undersökas innan inledandet av en stor skärm med hjälp av dessa tekniker.
Även om en 5 mm x 2 mm omrörarstav resulterar i en något bättre sporulering jämfört med användningen av en glaspärla (66% med 5 mm x 2 mm omrörarstav vs 56% med en glaspärla), den kostnad som krävs för att köpa tillräckligt stir barer för varje brunn kan vara oöverkomliga. Sporuleringen effektivitetsvinster med hjälp av en glaspärla ger en billig lösning som skapar tillräckligt luftning för high-throughput screening i en 96 multibrunn format 16. Tyvärr har tillägget av en omrörare eller en glaspärla inte uppnå mycket höga sporulering effektivitet (vanligtvis ~ 80% eller mer) ses när sporbildande i flaskor, och därmed subtila sporulering fenotyper kan vara svåra att upptäcka vid screening i en 96 brunnar formatera.
Till skillnad från tidigare beskrivna sporulering metoder 9-13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Joseph P. Healey bidrag från University of Massachusetts Boston (LSH) och R15 GM86805 från NIH (LSH). SMP stöds delvis av en Sanofi-Genzyme Fellowship vid University of Massachusetts Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
