Introduction
在芽殖酵母孢子形成进行了研究减数分裂1，基因重组2的机制，开发由细胞信号3的控制下，开发4的营养控制，转录期间提供见解生物学的许多方面，包括染色体分离的控制发展5调控，以及孢子形成6考试。孢子形成包括涉及的新的膜隔室的母细胞，随后用保护孢子壁6的沉积中形成的新的细胞分裂事件。这些研究，考察形成孢子的细胞经常采取迅速孢子酵母菌株SK1，其可以经受孢子形成的过程中约24小时以相对有效的方式7,8的优点。虽然对芽殖酵母产孢条件的优化已经被描述9-13，这些实验S于固体培养基或在孢子形成是利用培养管或瓶中大规模液体培养观察孢子形成。
在这里，我们描述了在96多井板格式形成孢子酵母的方法。我们发现，对于这种方法，曝气是用于同步和有效的孢子形成关键的，并且已经设计技术，以确保有足够的孢子形成的小体积多孔形式。在96多井板格式孢子允许使用高通量技术和多孔板格式，这种筛选使用平铺库14-16高拷贝抑制优化试剂进行筛选细胞。
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Protocol
1.准备产孢
注：在本协议中所描述的媒体使用标准配方和方法制成的13,17 表1给出了1升在本协议中所使用的各种媒体的表述。
| 细菌蛋白胨 | 酵母抽提物 | 细菌用琼脂 | 葡萄糖 | 醋酸钾 | 甘油 | DDH 2 O的 | |
| 耀皮玻璃板块 | 20克 | 10克 | 20克 | - | - | 30毫升 | 970毫升 |
| YPD平板 | 20克 | 10克 | 20克 | 20克 | - | - | 千毫升 |
| YPD液体 | 20克 | 10克 | - | 20克 | - | - | 千毫升 |
| YPA液体 | 20克 | 10克 | - | - | 20克 | - | 千毫升 |
| 产孢媒体 | - | - | - | - | 10克 | - | 千毫升 |
表1：培养基配方用量给出了1升的介质。有关媒体的细节成份可以在材料表中找到。
- 如果所有的孢子细胞将是相同的基因型，步骤如下：
- 解冻的酵母菌株被使用到YPG（YPGlycerol）板。在30℃下生长的酵母为12-16小时。重要的是，SK1细胞也准备形成孢子，所以SK1菌株不应留在YPG平板太长，或者它们可形成孢子在平板上。
注：生长在YPG新鲜解冻的菌株是优选的，如甘油作为碳源的利用需要氧化磷酸化，并由此选择为具有官能线粒体DNA的细胞。 SK1细胞有失去功能的线粒体DNA，并成为PETITES的倾向。需要对孢子形成功能性线粒体DNA。 - 从YPG板到YPD（YPDextrose）板单菌落连胜酵母。在30℃生长在YPD板24-28小时酵母。
- 大约36-48小时在YPD固体培养基中生长后，使用单个菌落开始25毫升的YPD培养从YPD板。直到细胞约有600 OD = 4.0〜7.0增长这种文化。在振荡培养箱中过夜进行，在30℃这一步骤中，以220rpm振荡。
- 从YPD培养，使用细胞的适量启动千毫升YPA（YPAcetate）培养的即外径600 = 0.1的每个96孔板需要在第2节中30℃振荡培养箱中生长的酵母，在220（振荡转），直到文化OD 600为1.3〜1.5之间为。
注：接种100ml YPA文化的每个96多孔板第2节例如进行筛选，筛选如果96 4多孔板，将需要400毫升YPA文化。与YPA培养10％的额外体积开始是必要的，以防止蒸发体积损失。通常情况下，这将需要12-16小时之间，用于细胞达到相应的OD 600;的时间量可以根据酵母菌株的基因型变化。 YPA是presporulation媒体。 Pregrowth在醋酸有助于诱导的基因的表达（如IME1）所需的高效率和同步孢子形成6。 - 旋在台式离心机1800×g离心5分钟以沉淀在YPA生长的细胞。洗涤细胞1倍与0.5体积的无菌高压灭菌去离子水。再次旋转，并丢弃洗。悬浮细胞在1×体积孢子形成介质。继续第2节。
- 解冻的酵母菌株被使用到YPG（YPGlycerol）板。在30℃下生长的酵母为12-16小时。重要的是，SK1细胞也准备形成孢子，所以SK1菌株不应留在YPG平板太长，或者它们可形成孢子在平板上。
- 如果使用对不同基因型的细胞孢子形成（ 即 ，具有不同的质粒转化的或含有不同的突变，典型地获得并冷冻储存存储），阵列单元的不同基因型到96多孔格式。然后，按照此步骤：
- 使用无菌96尖头青蛙从解冻的冷冻库存96多孔板（S）转移到细胞耀皮玻璃固体介质。生长在30℃酵母过夜。
- 使用无菌96尖头青蛙，从耀皮玻璃固体介质转移到细胞YPD固体培养基或选择性固体培养基（ 即 ，合成的基本培养基缺乏氨基酸，如果细胞中含有需要选择的质粒）。直到菌落形成每个菌株，通常为1一天YPD和2天，如果选择培养基是必要的，在30℃生长酵母。
- 等分试样1.2毫升YPD液体培养基或选择性液体培养基中于96深2毫升多孔板的每个孔中。使用青蛙从固体介质为液体介质传输单元，覆盖由胶带固定就位的塑料盖，并在30℃下摇床生长过夜，以220rpm振荡。
注意：要尽量减少污染，使用塑料盖从矩形培养皿盖板。持用一块胶带代替盖，使空气循环最低限度地受到限制。 - 在1800 XG 5分钟离心板，使用带适配器吊桶式离心机，以适应96孔板。倒掉从细胞介质;加入500μlYPA至每个孔，并重新悬浮沉淀的细胞在YPA。盖与由胶带固定就位的塑料盖。
- 生长细胞15小时，在30℃下在振荡培养箱中，以220rpm振荡。继续第2节。
2.在96多孔形式孢子细胞
- 添加任一种3毫米无菌固体玻璃珠或灭菌的5毫米×2毫米磁性搅拌棒放入一个96孔板的每个孔与1.3毫升井。 （见下文代表性的结果是否使用珠子或搅拌棒的讨论。）
- 如果要筛选的所有细胞都是一样的基因型，去2.2.1。如果细胞中筛选出不同基因型的，到2.2.2。
- 采取从步骤1.1.5和等分500μl的细胞加培养基的细胞进入96多孔板的每个孔中。与磁带就位塑料盖盖。继续执行2.3。
- 自旋细胞是在YPA从1.2.4在1800×g离心5分钟，使用具有适配器吊桶式离心机，以容纳96孔板中。倒从细胞中˚F媒体。加入500微升孢子形成介质到每个孔中，并重新悬浮沉淀的细胞在孢子形成介质。与磁带就位塑料盖盖。继续执行2.3。
- 如果使用玻璃珠，在30℃的振荡培养箱地方样品和摇动以220rpm于孢子形成。如果使用磁力搅拌棒，将样品上的轰动板30℃培养箱孢子内。
注：用于磁性搅拌棒的确切搅拌速度不是很重要的，只要所有条大力移动和将培养物充气。 - 通过孢子形成监测进展，从生成孢子的培养撤回样品进行可视化，从生成孢子的培养物添加6微升细胞对孢子形成介质中的24微升在96孔盖玻片板（1：5稀释）。离开细胞使用倒置显微镜检查细胞之前沉降5分钟。
注意：在野生型细胞SK1，紧凑成熟的孢子将形成由3转移到产孢媒体后6小时。通过孢子形成的进展可以通过显微镜使用荧光标记物，诸如核标记物来监测（ 即 ，HTB2-mCherry 18）来检查减数分裂或prospore膜标记物（ 即 ，G20 19），以检查孢子形态。或者，折射孢子的形成可使用诺马斯基DIC的显微镜开始转移到孢子形成介质后约12小时可以看到。
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Representative Results
为了评估这个协议中，从在多孔板形成孢子的细胞（如上述）获得的孢子形成的效率进行了比较，在瓶（ 表2）使用较大体积的形成孢子的细胞。使用多孔板的没有达到在瓶中，在〜80％的效率可常规看出形成孢子时见到的高效率。在与适当的曝气（通过玻璃珠或搅拌棒提供的）多孔板形成孢子可以达到足够的孢子形成的效率大于50％，用一个5毫米×2mm的搅拌棒得到的最好的结果（66％效率）。两种不同株（野生型和smk1Δ）的代表性芽孢这里示出（ 图1）。这些细胞在经过媒体的孢子36小时进行检查，并用96孔玻璃底板可视化。
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图1：从代表产孢孢子细胞野生型和smk1Δ单元20生成孢子在96多孔板。细胞上使用倒置显微镜一个63X物镜可视化。折射四分体（箭头）所用的野生型培养物中观察，但不能在含有smk1Δ细胞的培养。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
孢子形成是使用一个5mm或7毫米搅拌棒，其中每一个适合961.3毫升多孔板（ 表2）的阱内进行测试。使用7mm的搅拌棒导致相比更高的效率（66％）差孢子形成效率（28％），使用5 mm页搅拌棒来实现。在一个良好的7毫米搅拌棒倾向于用在一个搅拌棒互动N个相邻井（ 图1），从而阻止杆从能够适当地搅拌，并提供培养的足够通风。
| 形成孢子的细胞（％） | SEM（％） | |
| 烧瓶摇床 | 82 | 1.8 |
| 在摇床无珠 | 17 | 2.4 |
| 珠在摇床 | 56 | 3 |
| 在搅拌板上没有搅拌棒 | 10 | 2.2 |
| 5毫米旺火上搅拌棒盘 | 66 | 3.9 |
| 7毫米旺火上搅拌棒盘 | 28 | 6.7 |
| SEM =平均值的标准误差 |
表2：使用不同条件孢子形成效率。孢子在96孔多孔板，如上所述，或者，如果所指出的，在含50ml孢子形成介质为500ml烧瓶进行。八个不同的孔的平均值为在多孔板中进行各条件。三种不同的瓶孢子。所有的文化都是技术复制，从mCherry标记HTB2但除此之外野生型二倍体SK1酵母菌株相同的殖民地开始（LH902 18）。这些细胞在YPD的单个烧瓶和YPA的单个烧瓶中生长，然后除以接种含有孢子形成介质的96孔板中，如上所述。产孢效率，使用诺马斯基DIC明显微镜转移到媒体孢子计数后孢子折光36小时检测。
图2： 搅拌均匀扶手的961.3毫升多孔板。孢子形成培养含有任一（A）中5毫米×2mm的搅拌棒（红色）或（B）7毫米×2mm的搅拌棒（蓝色）在961.3毫升多孔平板上磁力搅拌盘子。比例尺= 10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们提出了一个协议，用于在96多孔形式孢子SK1酵母。曝气是有效孢子形成，这需要使用任一搅拌棒或在每一个玻璃珠孔的关键。当细胞在96多孔板中形成孢子在没有任何一个珠或搅拌棒的振荡培养箱中，细胞不能有效地形成孢子。当细胞没有任何一个珠或在振荡培养箱搅拌棒相比，是在30℃下不搅拌（ 表1形成孢子仅在孢子形成效率的少量增加被看见;在摇对10％17％放置在搅拌盘子）。同样，使用7mm的搅拌棒的导致差孢子形成效率（28％），可能是因为7毫米搅拌棒没有正确通气培养由于与在相邻井搅拌棒的相互作用。该协议使用常用的同步和高效孢子SK1酵母菌株7,8研究SPO描述条件孢rulation;可以使用此协议的其他酵母菌株获得产孢效率应承担使用这些技术的大屏幕前进行检查。
虽然在一个稍好孢子形成一个5毫米×2mm的搅拌棒的结果相比，使用玻璃珠（66％用5mM×2mm的搅拌棒VS用玻璃珠56％），购买足够搅拌所需的费用对于每个孔条可以让人望而却步。使用玻璃珠得到的孢子形成的效率提供了创建用于在96多孔形式16的高通量筛选足够曝气一个低成本的解决方案。不幸的是，增加了一个搅拌棒或玻璃珠的没有达到在瓶中形成孢子时看到的非常高的产孢效率（通常〜80％或更高），因此细微孢子形成的表型可能难以在96筛选以及当检测到格式。
不同于先前描述的方法孢子9-13
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Acknowledgments
这项工作是由来自马萨诸塞州波士顿（LSH）和R15 GM86805从NIH大学（LSH）一约瑟夫·P·希利资助。 SMP是部分地由赛诺菲 - 健赞奖学金波士顿马萨诸塞州大学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
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