Introduction
Спороношение в почкующихся дрожжей было изучено , чтобы дать представление о многих аспектах биологии, в том числе контроль сегрегации хромосом во время мейоза 1, механизмы генетической рекомбинации 2, контроль развития клеткой сигнализации 3, питательная контроль развития 4, транскрипционный регулирование развития 5, а также рассмотрение спорообразования 6. Спорообразование включает новое событие деление клеток , предусматривающий создание новых мембранных отсеков внутри материнской клетки с последующим нанесением защитного споровой стенки 6. Эти исследования , которые исследуют спорообразующих клеток часто используют быстро спорообразующих штамма дрожжей SK1, который может пройти процесс спорообразования примерно 24 ч в относительно эффективным способом 7,8. Хотя оптимизация условий спорообразования для почкующихся дрожжей были описаны 9-13, это экспериментs исследовали споруляции на твердой среде или в более крупных жидких культурах, где споруляция осуществляется с использованием культуры трубок или колб.
Здесь мы опишем метод спорообразующих дрожжей в многоямного формате пластины 96. Мы считаем, что для этого метода, аэрация имеет решающее значение для синхронного и эффективного споруляции, и разработали методы, чтобы обеспечить достаточное количество споруляцию малого объема многоямный формат. Спорообразующих в формате 96 многоямный пластины позволяет клеткам быть подвергнуты скринингу с использованием методов с высокой пропускной способностью и реагенты , оптимизированные для многоямного формата пластины, такой скрининг для высоких супрессоров копирования с использованием черепичную библиотеки 14-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка к споруляцией
Примечание:. Средства массовой информации , описанные в этом протоколе выполнены с использованием стандартных рецептов и методов 13,17 Таблица 1 дает формулировку 1 л различных носителей , используемых в данном протоколе.
| Бакто пептон | Экстракт дрожжей | Бактоагар | Декстроза | ацетат калия | глицерин | DDH 2 O | |
| YPG пластины | 20 г | 10 г | 20 г | - | - | 30 мл | 970 мл |
| YPD пластины | 20 г | 10 г | 20 г | 20 г | - | - | 1000 мл |
| YPD жидкость | 20 г | 10 г | - | 20 г | - | - | 1000 мл |
| YPA жидкость | 20 г | 10 г | - | - | 20 г | - | 1000 мл |
| споруляцией СМИ | - | - | - | - | 10 г | - | 1000 мл |
Таблица 1:. СМИ составы Суммы указаны за 1 л СМИ. Особенности о средствах массовой информацииингредиенты можно найти в таблице материалов.
- Если все спорообразующих клетки будут же генотипа, выполните следующие действия:
- Оттепель штамм дрожжей, которые будут использоваться на (в) YPGlycerol пластины YPG. Grow дрожжи в течение 12-16 ч при 30 ° С. Важно отметить, что клетки SK1 также готовы образуют споры, так SK1 штаммы не должны оставаться слишком долго на YPG пластин, или же они могут образуют споры на пластине.
Примечание: Свеже размораживают штамм выращивали на YPG является предпочтительным, поскольку использование глицерина в качестве источника углерода требует окислительного фосфорилирования, и, таким образом, выбирает для клеток, которые имеют функциональную митохондриальную ДНК. SK1 клетки имеют тенденцию терять функциональную митохондриальную ДНК и стать Petites. Функциональная митохондриальной ДНК необходима для споруляции. - Streak дрожжи из YPG пластины на А (YPDextrose) пластины YPD для отдельных колоний. Grow дрожжей на YPD пластины 24-28 ч при 30 ° С.
- Примерно через 36-48 ч роста на YPD твердых средах, начать 25 мл YPD культуру, используя одну колониюот YPD пластины. Grow эту культуру , пока клетки около OD 600 = 4.0 до 7.0. Выполните этот шаг при 30 ° C в течение ночи в шейкере инкубаторе, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
- Из культуры YPD, используют соответствующее количество клеток , чтобы начать 1000 мл YPA (YPAcetate) культуры , что составляет ОД 600 = 0,1 для каждой потребности 96 - луночный планшет в разделе 2. Grow дрожжи в качалке инкубаторе 30 ° C (встряхиванием при 220 оборотов в минуту) до культуры OD 600 составляет от 1,3 до 1,5.
Примечание: инокуляции 100 мл YPA культуры для каждого 96 многоямного пластины быть подвергнуты скринингу в разделе 2. Например, если скрининг четыре 96 луночные планшеты, потребуется 400 мл YPA культуры. Начиная с 10% дополнительного объема в культуре YPA необходимо защитить от испарительного потери объема. Как правило, это займет от 12-16 ч для клеток , чтобы достичь соответствующего OD 600; количество времени может варьироваться в зависимости от генотипа штамма дрожжей. YPA является presporulation СМИ. Pregrowthв ацетат помогает индуцируют экспрессию генов (например, IME1) , необходимые для эффективного и синхронного споруляцией 6. - Спин на 1,800 XG в центрифуге таблицу в течение 5 мин, чтобы осадить клетки, выращенные в YPA. Мыть клетки 1x 0,5 объема стерильной автоклавного деионизированной воды. Спин снова, и выбросьте мыть. Ресуспендируют клеток в 1x объем споруляции СМИ. Продолжить в разделе 2.
- Оттепель штамм дрожжей, которые будут использоваться на (в) YPGlycerol пластины YPG. Grow дрожжи в течение 12-16 ч при 30 ° С. Важно отметить, что клетки SK1 также готовы образуют споры, так SK1 штаммы не должны оставаться слишком долго на YPG пластин, или же они могут образуют споры на пластине.
- При использовании клеток для спорообразования , которые имеют разных генотипов (т.е. трансформированные с различными плазмидами или содержащие различные мутации, как правило , полученные и сохраненные в виде замороженных запасов), клетки массива различных генотипов в 96 многоямного формате. Затем выполните следующую процедуру:
- Используйте стерильный 96 зубца Frogger для переноса клеток из размороженных замороженных запасов в 96 многоямного пластины (ы) на YPG твердых средах. Grow дрожжей в течение ночи при 30 ° C.
- Используя стерильный 96 зубца Frogger, перенесите клетки от YPG твердых сред на YPD твердых средах или селективныйтвердые среды (т.е. синтетические минимальные средства массовой отсутствуют аминокислоты, если клетки содержат плазмид , которые требуют выбора). Grow дрожжей при температуре 30 ° С до образования колоний для каждого штамма, как правило, 1 день на YPD и 2 дня, если селективную среду необходимо.
- Аликвоты 1,2 мл YPD жидких сред или селективных жидких средах в каждую лунку 96 глубоких 2 мл многоямного пластины. Передача клетки из твердых носитель в жидких средах с использованием Frogger, крышка с пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты, и расти в течение ночи в 30 ° C шейкере, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму загрязнение, Накладки с использованием пластиковых крышек из прямоугольного чашку Петри. Держите крышки на месте с помощью куска ленты, так что циркуляция воздуха минимально ограничено. - Центрифуга планшеты при 1800 мкг в течение 5 мин, используя Бакет центрифугу с адаптерами для размещения 96-луночные планшеты. Слить носитель из клеток; добавить 500 мкл YPA в каждую лунку и ресуспендируют осажденные клетки в YPA. Обложкас пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты.
- Рост клеток в течение 15 часов при 30 ° C в инкубаторном шейкере, встряхивая при 220 оборотах в минуту. Продолжить в разделе 2.
2. спорообразующих клетки в 96-луночные Format
- Добавить либо одну 3 мм стерильной твердой стеклянной бусинки или стерильном 5 мм х 2 мм магнитной мешалке в каждую лунку 96-луночного планшета с 1,3 мл лунки. (См Представитель Результаты ниже для обсуждения вопроса о том , чтобы использовать шарик или мешалку.)
- Если все клетки должны быть экранированные одного и того же генотипа, перейдите к 2.2.1. Если клетки должны быть экранированные имеют различные генотипы, перейдите к 2.2.2.
- Возьмем клетки от этапа 1.1.5 и аликвоты 500 мкл клеток плюс средства массовой информации в каждую лунку 96-многоямного пластины. Крышка с пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты. Перейдите к разделу 2.3.
- Спин клетки, которые находятся в YPA из 1.2.4 при 1,800 мкг в течение 5 мин, используя Бакет центрифугу с адаптерами для размещения 96-луночных планшетах. застыванияе СМИ из клеток. Добавьте 500 мкл спорообразования сред в каждую лунку и ресуспендируют осажденные клетки в спорообразования средах. Крышка с пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты. Перейдите к разделу 2.3.
- При использовании стеклянного шарика, поместите образцы в шейкере инкубаторе при температуре 30 ° C и трясти при 220 оборотах в минуту для споруляции. При использовании магнитной мешалке, место образцы на мешалке внутри 30 ° C инкубатор для споруляции.
Примечание: Точная скорость размешать для магнитной мешалки баров не очень важно, до тех пор, как все бары двигаются энергично и культура аэрацию. - Для того, чтобы следить за развитием через споруляцией, вывести образцы из спорообразующих культуры для визуализации, добавить 6 мкл клеток от спорообразующих культур до 24 мкл спорообразования сред в 96 хорошо покровного пластины (разведение 1: 5). Оставьте клетки урегулировать в течение 5 мин перед исследованием клеток с использованием инвертированного микроскопа.
Примечание: В sk1 клетках дикого типа, компактные созревшие споры образуют на 36 часов после передачи в спорообразования СМИ. Прогрессирование через споруляцией можно контролировать с помощью микроскопии с использованием флуоресцентных маркеров, таких как ядерный маркер (т.е. Htb2-mCherry 18) для изучения деления мейоза или prospore мембранный маркер (то есть, 19 G20) , чтобы исследовать спорами морфогенез. В качестве альтернативы, образование рефрактильных спор можно увидеть с помощью Nomarski DIC микроскопии начиная примерно 12 ч после переноса в спорообразования средах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки этого протокола, эффективность споруляции , полученные из спорообразующих клеток в луночные планшеты (как описано выше) по сравнению с клетками спорулированных с использованием больших объемов в колбы (таблица 2). Использование луночные планшеты не достичь высокой эффективности, которая видна при спорообразующих в колбах, где эффективность ~ 80% может регулярно видеть. Спорообразующих в луночные планшеты с надлежащей аэрации (при условии, стеклянными бусами или размешивать баров) могут достичь достаточной повышению эффективности споруляцией более 50%, с лучшими результатами (эффективность 66%), полученный с помощью 5 мм х 2 мм мешалку с. Представитель спороношение двух различных штаммов (дикого типа и smk1Δ) показан здесь (рисунок 1). Эти клетки исследовали через 36 ч в спорообразования средах и визуализировали с использованием нижнюю пластину 96 и стекла.
84 / 54584fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Спорообразующих клеток из репрезентативной споруляцией дикого типа и smk1Δ клетки 20 спорообразования в 96 луночные планшеты. Клетки были визуализированы с использованием объектива 63X на инвертированный микроскоп. Преломляющие тетрады (стрелки) можно увидеть в дикого типа культуры, но не в культуре , содержащей клетки smk1Δ. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Споруляция был протестирован с использованием или 5 мм или 7 мм мешалке, каждая из которых соответствует в лунку 96 1,3 мл многоямный пластины (таблица 2). Используя мешалку 7 мм приводит к низкой эффективности спорообразования (28%) по сравнению с более высокой эффективностью (66%), полученный при использовании мешалку 5 мм. 7 мм мешальник в скважине, как правило, взаимодействуют с мешалкой в Ап р дом хорошо (Рисунок 1), предотвращая бруски от того, чтобы надлежащим образом перемешать и обеспечить адекватную аэрации культуры.
| спорулирующими клеток (%) | СЭМ (%) | |
| Колба в шейкере | 82 | 1.8 |
| нет шарика в шейкере | 17 | 2.4 |
| шарик в качалке | 56 | 3 |
| нет мешальник на мешалке | 10 | 2.2 |
| 5 мм мешальник на мешалке | 66 | 3,9 |
| 7 мм мешальник на мешалке | 28 | 6.7 |
| SEM = стандартная ошибка среднего значения |
Таблица 2:Эффективность споруляционная с использованием различных условий. Споруляция проводили в 96 - луночных луночные планшеты , как описано выше, или, если отмечено, в 500 мл колбах , содержащих 50 мл спорообразования сред. Восемь различных скважин были усреднены для каждого условия, проведенной в многоямного пластине. Три различных Колбы спорообразования. Все культуры являются техническими повторности, начали с того же колонии mCherry-меченой Htb2 , но в противном случае дикого типа диплоидный SK1 штамма дрожжей (LH902 18). Эти клетки выращивали в одной колбе из YPD и одной колба YPA, а затем разделить на инокуляции 96-луночные планшеты, содержащие споруляции носитель, как описано выше. Эффективность Спороношение оценивали путем подсчета преломляющих спорами 36 ч после переноса в спорообразования средах с использованием Nomarski DIC микроскопии светлого.
Рисунок 2: Перемешатьбары в 96 1,3 мл луночные планшеты. Спороношение культуры , содержащей либо (А) 5 мм х 2 мм размешивать бары (красные) или 7 мм х 2 мм размешивать бары (синие) в 96 1,3 мл многоямного пластины на магнитной мешалки (B) пластина. Шкала бар = 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы приводим протокол для спорообразующих SK1 дрожжей в 96 многоямного формате. Аэрация является ключевым фактором для эффективной споруляции, что требует использования либо мешалкой или стеклянного шарика в каждую лунку. Когда клетки спорообразования в 96 многоямного пластины в шейкере инкубаторе без либо шарике или мешалкой, клетки не образуют споры эффективно. Лишь небольшое увеличение эффективности спорообразования наблюдается , когда клетки спорообразования без либо шарике или мешалкой в качалке инкубаторе, по сравнению с будучи при 30 ° С без перемешивания (таблица 1, в шейкере против 10% 17% помещают на размешать пластина). Точно так же, использование мешалке 7 мм приводит к низкой эффективности спорообразования (28%), вероятно, потому, что на 7 мм размешать стержни не аэрацию культуры должным образом из-за взаимодействия с размешивать решеткой в соседних скважинах. Этот протокол описывает условия для споруляции с помощью синхронно и эффективно спорообразующих SK1 штамм дрожжей 7,8 , используемый обычно для изучения SPOrulation; Эффективность споруляции, которые могут быть получены с другими штаммов дрожжей с использованием этого протокола следует изучить, прежде чем приступать большой экран с помощью этих методов.
Хотя мешалке результаты х 2 мм 5 мм в слегка лучше спорами в сравнении с использованием стеклянного шарика (66% с 5 мм х 2 мм бар перемешивающим против 56% со стеклянной бусинки), стоимость необходимого для покупки достаточно размешать бары для каждой скважины может быть непомерно высокой. Эффективности споруляции , полученные с помощью стеклянного шарика обеспечивает недорогое решение , которое создает достаточную аэрацию для высокопроизводительного скрининга в 96 - многоямного формате 16. К сожалению, добавление мешалкой или стеклянного шарика, не достигли очень высокой эффективности споруляционная (обычно ~ 80% или более), которая видна при спорообразующих в колбах, и, таким образом, тонкие споруляции фенотипы могут быть трудно обнаружить при скрининге в 96-луночный формат.
В отличие от ранее описанных методов спорообразования 9-13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Джозеф П. Хили из Университета штата Массачусетс Бостон (LSH) и R15 GM86805 из NIH (LSH). SMP поддерживается частично посредством Sanofi-Genzyme стипендий в Университете штата Массачусетс в Бостоне.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
