Introduction
Tomurcuklanan maya sporlanma mayoz 1, genetik rekombinasyon 2 mekanizmaları, 3 sinyal hücre tarafından gelişim kontrolü, geliştirme 4 besin kontrolü, transkripsiyonel sırasında kromozom ayrımı kontrolü de dahil olmak üzere biyoloji birçok açıdan, içgörü sağlamak için çalışılmıştır gelişim 5 düzenlenmesi ve spor oluşumu 6 incelenmesi. Spor Oluşumu koruyucu spor duvar 6 birikimi, ardından ana hücreden içinde yeni zar bölümlerine oluşturulmasını içeren yeni bir hücre bölünmesi olayını içerir. Sporlanan hücrelerini inceleyen Bu çalışmalar genellikle nispeten verimli bir şekilde 7,8 yaklaşık 24 saat içinde sporülasyonun sürecinden geçmeleri için hızla sporlanan maya suşu SK1, yararlanmak. Maya tomurcuklanan sporülasyon koşullarının optimizasyonu 9-13, bu deney, tarif edilmiş olmasına rağmens katı ortam üzerinde ya da sporlaşma kültür tüpleri veya şişeleri kullanılarak gerçekleştirilir büyük ölçekli sıvı kültürlerde sporlanmasını incelenmiştir.
Burada, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, maya sporlanan için bir yöntemi tarif eder. Bu yöntem için, havalandırma senkron ve verimli sporülasyonun için kritik olduğunu bulmak ve küçük hacimli multiwell biçimi yeterli sporulasyonunu sağlamak için teknikler geliştirdiler. Hücreler, yüksek verimli teknikleri ve döşemeli kütüphane 14-16 kullanılarak yüksek kopya bastırma için çok oyuklu bir plaka biçiminde, bu tarama için optimize edilmiş reaktifler kullanılarak taranabilir için 96 çukurlu bir levha formatında sporlanan sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sporulationun için hazırlanıyor
Not:. Bu protokol açıklanan medya standart reçeteleri ve yöntemleri kullanılarak yapılan olan 13,17 Tablo 1 Bu protokolde kullanılan çeşitli medya 1 L formülasyonu verir.
| Bacto Pepton | Maya Özü | Bacto Agar | üzüm şekeri | Potasyum Asetat | gliserin | GKD 2 O | |
| YPG plakalar | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 mi | 970 mi |
| YPD plakaları | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1000 mi |
| YPD sıvı | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1000 mi |
| YPA sıvı | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1000 mi |
| sporülasyon ortam | - | - | - | - | 10 g | - | 1000 mi |
Tablo 1:. Ortam formülasyonlar edilmiştir ortam 1 L için verilmiştir. medya konusunda Özelliklerimaddeler Malzeme Tablo bulunabilir.
- Tüm sporlanan Hücreler aynı genotip olacaksa, bu yordamı uygulayın:
- Çözülme maya suşu, bir YPG (YPGlycerol) plaka kullanılır. 30 ° C'de 12-16 saat boyunca maya büyümek. Önemlisi, SK1 hücreleri de o kadar SK1 suşları YPG plakalar üzerinde çok uzun bırakılmamalıdır, sporlanmalanna gurur duyuyoruz, ya da plaka üzerinde sporlanmalanna olabilir.
Not: YPG üzerinde büyümüş bir taze çözülmüş soyu, bir karbon kaynağı olarak gliserol kullanımı gibi oksidatif fosforilasyon gerektirir tercih edilir ve bu durumda işlevsel mitokondriyal DNA sahip hücreler için seçim yapmaktadır edilir. SK1 hücreler fonksiyonel mitokondriyal DNA kaybetmek ve petites olma eğilimi var. Fonksiyonel mitokondriyal DNA, sporlanma için gereklidir. - tek koloniler için YPD bir (YPDextrose) plaka üzerine YPG plakasından Streak maya. 30 ° C'de YPD plaka 24-28 saat üzerinde maya büyür.
- YPD katı ortam üzerinde büyüme yaklaşık 36-48 saat sonra, tek bir koloni ile 25 ml'lik bir YPD kültürünü başlatmakYPD plaka dan. Hücreler 7.0 = 4.0 OD 600 hakkında kadar bu kültürü büyütün. 220 rpm'de çalkalanarak, bir çalkalama inkübatöründe gece boyunca 30 ° C 'de bu adımı gerçekleştirir.
- YPD kültüründen (220 çalkalanarak 30 ° C'de ve çalkalama inkübatöründe maya büyümek 2. Bölüm, her 96 yuvalı plaka ihtiyacı için OD 600 = 0.1 olduğunu YPA (YPAcetate) kültür 1000 ml başlangıç hücre, uygun bir miktarda kullanımı OD 600 1,5-1,3 arasında kültür kadar rpm).
Not: Dört 96 çukurlu levhalar tarama, her 96 çukurlu levha YPA kültürü 100 ml inoküle Örneğin, Bölüm 2'de elenecek, YPA kültürü 400 ml gereklidir. YPA kültür içinde% 10 ekstra hacim başlayarak buharlaştırıcı birim kaybına karşı korumak için gereklidir. Hücreler uygun OD 600 ulaşması için Tipik olarak, 12-16 saat arasında sürer; süre maya suşu genotipine bağlı olarak değişebilir. YPA presporulation ortamıdır. Pregrowthasetat içinde gen ekspresyonunu (örneğin IME1 gibi) etkili ve eş zamanlı sporlanma 6 için gerekli neden olur. - 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj 1.800 x g'de Spin YPA yetiştirilen hücreler pelet. Yıkama Hücreler, steril otoklavlanmış deiyonize su, 0.5 hacim 1x. Tekrar Spin ve yıkama atın. 1x hacim sporlanma medyada yeniden süspanse hücreleri. Bölüm 2 devam ediyor.
- Çözülme maya suşu, bir YPG (YPGlycerol) plaka kullanılır. 30 ° C'de 12-16 saat boyunca maya büyümek. Önemlisi, SK1 hücreleri de o kadar SK1 suşları YPG plakalar üzerinde çok uzun bırakılmamalıdır, sporlanmalanna gurur duyuyoruz, ya da plaka üzerinde sporlanmalanna olabilir.
- Farklı genotipleri, vardır sporlanma için hücreleri kullanarak (farklı plazmidler ile transforme, yani veya farklı tipik elde dondurulmuş stoklar olarak saklanır mutasyonları içeren) 96 çukurlu bir biçime farklı genotip, dizi hücrelerini edin. Sonra, bu yordamı izleyin:
- YPG katı ortam üzerinde 96 oyuklu bir plaka (lar) içinde çözülmüş, dondurulmuş stoklar hücreleri aktarmak için bir steril 96 çatal Frogger kullanın. 30 ° C de bir gece boyunca, maya büyümek.
- steril 96 diş Frogger kullanarak, YPD katı ortam veya seçici üzerine YPG katı ortam hücreleri aktarmakKatı ortam (hücre seçimini gerektirir plazmidler içeriyorsa, yani sentetik minimal medya, amino asitler eksik). Seçici ortam gerekirse koloniler 2 gün YPD tipik haliyle 1 gün, her bir suş için oluşturulur ve kadar 30 ° C 'de maya büyütün.
- Kısım 96, derin 2 mi çukurlu plakanın her oyuğuna YPD sıvı ortam veya seçici sıvı ortam 1.2 mi. Bir Frogger kullanılarak sıvı ortam içine bir katı ortam transfer hücreleri, bant ile yerinde tutulan plastik bir kapak ile kapatın ve 220 rpm'de çalkalanarak, 30 ° C'de çalkalayıcı içinde gece boyunca büyür.
Not: kontaminasyonu en aza indirmek için, dikdörtgen bir petri tabak plastik kapaklar kullanarak kapak plakaları. Bu hava sirkülasyonu minimal sınırlıdır, bu yüzden bir parça bant kullanarak yerine kapaklarını tutun. - adaptörleri ile sallanan bir kova santrifüj kullanılarak 5 dakika boyunca 1.800 xg'de santrifüj plakalar, 96 gözlü plakalar karşılamak için. hücrelerden medya dökün; YPA pelet hücreleri her 500 ul Ypa de ekleme ve yeniden süspanse edin. kapakbant ile yerinde tutulur plastik kapak ile.
- 220 rpm'de çalkalanarak, bir çalkalama inkübatöründe 30 ° C'de 15 saat boyunca hücreler büyür. Bölüm 2 devam ediyor.
96 çukurlu Format 2. sporlanan Hücreler
- Bir 3 mm steril katı cam boncuk ve 1.3 mi çukurlu bir 96 oyuklu plakanın her oyuğuna steril 5 mm x 2 mm boyutlarında manyetik bir karıştırma çubuğu, ya ekleyin. (Bir boncuk veya bir karıştırma çubuğu kullanmak konusunda bir tartışma için aşağıdaki Temsilcisi Sonuçları gör.)
- elenecek tüm hücreler aynı genotip ise, 2.2.1 gidin. elenecek hücreleri farklı genotip ise, 2.2.2 gidin.
- 96 çukurlu bir levhanın her çukuruna içine adım 1.1.5 ve kısım hücre ve ortam 500 ul hücreleri al. bant ile yerinde tutulur plastik kapakla örtün. 2.3 geçin.
- 96 kuyucuğu karşılamak için adaptörleri ile sallanan bir kova santrifüj kullanılarak 1.2.4 den 5 dakika boyunca 1.800 xg'de YPA olan Spin hücreleri. dökünhücrelerinden f medya. sporlanma medya pelet hücreleri her sporülasyon medya 500 ul iyi ekleyin ve tekrar süspansiyon. bant ile yerinde tutulur plastik kapakla örtün. 2.3 geçin.
- Cam boncuk kullanılarak, bir yerde, 30 ° C'de çalkalayıcı bir inkübatör içinde, örnekler ve sporlaşma 220 rpm'de çalkalanır. sporlanma için 30 ° C inkübatör içinde bir karıştırıcı plaka üzerinde bir manyetik karıştırma çubuğu, Örnekleri kullanarak.
Not: tüm barlar enerjik hareket ediyor ve kültür havalandırılır olarak manyetik karıştırma çubukları için tam karıştırma hızı sürece çok önemli değildir. - , Sporulationun ilerlemeyi izlemek görselleştirme sporlanan kültüründen örnekleri çekilme, 96 iyi lamel plakada sporülasyon medya 24 ul sporlanan kültürlerinden hücrelerin 6 ul ekleyin için (1: 5 seyreltme). ters bir mikroskop kullanılarak hücrelerin incelenmesi önce 5 dakika boyunca yerleşmek için hücreleri bırakın.
Not: vahşi tip SK1 hücrelerinde, kompakt olgun sporlar 3 ile oluşturacaksporlanma medyaya transfer edildikten sonra 6 saat. Sporlanma ilerleme, örneğin nükleer işaretleyici olarak flüoresan işaretçileri kullanılarak mikroskop ile izlenebilir (yani, Htb2 mCherry 18), öz değişmesine ait bölünme veya prospore membran işaretleyici incelemek için (örneğin, G-20 19) spor morfojenezi incelemek. Seçenek olarak ise, refraktil sporların oluşumunu sporülasyon ortama transferinden sonra yaklaşık 12 saat başlayan Nomarski DIC mikroskopi kullanılarak görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol değerlendirmek için, (yukarıda anlatıldığı gibi) çukurlu levhalarda yer alan hücreler sporlanan elde sporülasyon verimleri şişelerinde (Tablo 2) 'de daha büyük hacimler ile sporule hücreleri karşılaştırılmıştır. multiwell plakaların kullanımı ~% 80 verimlilik rutin görülebilir matara, sporlanan zaman görülen yüksek verim elde etmedi. (Cam boncuk veya bir karıştırma çubukları tarafından sağlanır), uygun havalandırma ile çukurlu plakalarda sporlanan En iyi sonuçlar (% 66 verim) 5 mm x 2 mm bir karıştırma çubuğu kullanılarak elde edilen, yeterli sporulasyon verimleri% 50'den fazla elde edilebilir. İki farklı suşları (vahşi tip ve smk1Δ) bir temsilcisi sporulasyon burada (Şekil 1) gösterilir. Bu hücreler, sporülasyon ortamında 36 saat sonra incelenir ve bir 96 gözlü cam alt plaka kullanılarak görünür hale getirilir.
84 / 54584fig1.jpg "/>
Şekil 1: a. Örnek sporlanma hücreleri sporlanan Yabani tip ve smk1Δ hücreler 20, 96 çukurlu plakalarda sporule. Hücreler, bir ters mikroskop 63X objektif kullanılarak görselleştirilmiştir. Refraktil tetradların (ok başları) ancak smk1Δ hücreleri ihtiva eden kültür, vahşi tip kültür görülebilir. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sporülasyon 5 mm ya da 96 1.3 mi çok oyuklu bir plaka (Tablo 2) oyuk dahilinde, her biri 7 mm karıştırma çubuğu, kullanılarak test edilmiştir. 7 mm'lik bir karıştırma çubuğu kullanarak yüksek verim (% 66) ile karşılaştırıldığında zayıf sporlanma verimliliği (% 28) ile sonuçlanmıştır 5 mm karıştırma çubuğu kullanılarak elde. bir kuyu içinde 7 mm'lik bir karıştırma çubuğu bir karıştırma çubuğuna sahip olan etkileşim eğiliminden bitişik kuyu (Şekil 1), düzgün karıştırın ve kültür yeterli havalandırma sağlamak mümkün olmaktan çubukları önlenmesi.
| sporlanan hücreleri (%) | SEM (%) | |
| çalkalayıcıda Şişe | 82 | 1.8 |
| çalkalayıcı hiçbir kordon | 17 | 2.4 |
| çalkalayıcıda boncuk | 56 | 3 |
| heyecan plaka üzerinde hiçbir karıştırma çubuğu | 10 | 2.2 |
| 5 mm karıştırma plaka üzerinde bar karıştırın | 66 | 3.9 |
| 7 mm karıştırma plaka üzerinde bar karıştırın | 28 | 6.7 |
| SEM ortalamanın standart hatasını = |
Tablo 2:Belirtildiği takdirde sporlanma ortam 50 ml içeren 500 ml'lik şişelere, yukarıda tarif edildiği gibi veya sporülasyon verimleri, farklı koşullar kullanılarak. Sporülasyon 96 gözlü yuvalı plakalarda gerçekleştirilmiştir. Sekiz farklı kuyu, çok oyuklu bir plaka içerisinde gerçekleştirilebilir, her durum için ortalaması alındı. Üç farklı şişeler sporule edildi. Tüm kültürler teknik çoğaltır vardır, (LH902 18) mCherry etiketli Htb2 ama başka türlü vahşi tip diploid SK1 maya suşu aynı kolonisinden başladı. Yukarıda tarif edildiği gibi bu hücreler, sporlaşma ortam ihtiva eden 96 oyuklu plakaların aşılanması için ayrılır, sonra YPD tek bir şişeye ve YPA tek bir şişede büyütüldü ve edilmiştir. Sporlanma verimliliği Nomarski DIC aydınlık mikroskopi kullanılarak sporülasyon ortama transferinden sonra refraktil sporlar 36 saat sayımı ile analiz edilmiştir.
Şekil 2: Stirihtiva eden 96 1.3 mi çukurlu plakalarda çubuk. Sporlanma kültürü, ya (A), 5 mm x 2 mm'lik bir karıştırma çubukları (kırmızı) veya (B) bir manyetik karıştırma ile, 96 1.3 mi çukurlu plaka 7 mm x 2 mm bir karıştırma çubukları (mavi) plaka. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada 96 multiwell formatta SK1 maya sporlanan için bir protokol mevcut. Havalandırma Bir karıştırma çubuğu ya da her iyi bir cam boncuk ya kullanımını gerektirir verimli sporlanma için anahtardır. hücreler, bir tane veya bir karıştırma çubuğu ya da olmayan bir çalkalama inkübatöründe 96 çukurlu bir plaka içinde sporule zaman, hücreleri verimli sporlanmalanna yoktur. Hücreler bir boncuk ya da (çalkalama olmaksızın 30 ° C de Tablo 1 olmasına kıyasla bir çalkalama inkübatöründe Bir karıştırıcı çubuğu, ya olmayan sporule zaman sporülasyon verimliliği sadece küçük bir artış görülmektedir;% 10 vs çalkalayıcıda% 17 bir karıştırma yerleştirilir plaka). Benzer şekilde, 7 mm'lik bir karıştırma çubuğu kullanımı 7 mm çubukları nedeniyle bitişik kuyularda karıştırıcı çubukları ile etkileşimler doğru şekilde kültür havalandırmak değil karışması olasılığı nedeniyle, düşük sporülasyon verim (% 28) ile sonuçlanmıştır. Bu protokol spo incelemek için yaygın olarak kullanılan eşzamanlı ve verimli sporlanan SK1 maya suşu 7,8 kullanarak sporlanma koşullarını açıklarrulation; Bu protokolü kullanarak diğer maya suşları ile elde edilebilir sporülasyon verimleri bu teknikleri kullanarak büyük bir ekrana girişmeden önce muayene edilmelidir.
Cam boncuk yeterli karıştırın satın almak için gerekli maliyet (5 mm x 2 mm'lik bir karıştırma çubuğu, bir cam boncuk 56 vs% 66%) kullanımı ile karşılaştırıldığında biraz daha iyi bir sporlanma bir 5 mm x 2 mm'lik bir karıştırma çubuğu sonucunu doğurmasına rağmen her kuyunun için barlar engelleyici olabilir. Cam boncuk kullanılarak elde sporülasyon verimleri 96 çukurlu bir biçimde 16 yüksek verimli tarama için yeterli havalandırma oluşturan bir düşük maliyetli bir çözüm sağlar. Ne yazık ki, bir karıştırma çubuğu veya cam boncuk ilave şişelerinde sporlanan zaman görülen çok yüksek sporulasyon verimliliği (genellikle ~% 80 veya daha fazla) elde etmedi ve böylece ince sporulizasyon fenotipleri de bir 96'da tarama algılamak için zor olabilir biçim.
Daha önce tarif edilen sporülasyon yöntemleri 9-13 farklı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH Massachusetts Boston (LSH) ve R15 GM86805 Üniversitesi (LSH) bir Joseph P. Healey hibe ile desteklenmiştir. SMP Massachusetts Boston Üniversitesi'nde Sanofi-Genzyme Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
