Protocol
Alle muizen worden gefokt en onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden onderhouden en alle muis protocollen worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Bereiding van Buffers en Reagentia
- Bereid volledige Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (100 IU / ml) / streptomycine (100 ug / ml), 55 pM 2-mercaptoethanol ).
- Bereid 20x gebalanceerde zoutoplossing (BSS) Stock 1 en Stock 2, afzonderlijk.
- Bereid 20x BSS voorraad 1 (111 mM dextrose, 8,8 mM kaliumfosfaat, 26,7 mmol dibasisch in 1 liter steriel water) en voeg 40 ml 0,5% Fenol Red 20x BSS voorraad 1 vóór de definitieve aanpassing van het volume. Steriel filter met 0,2 urn filter vóór opslag bij 4 ° C.
- Bereid 20x BSS voorraad 2 (25,8 mmol calciumchloridedihydraat, 107 mM kaliumchloride, 2,73 M natrium chloride, 19,6 mM magnesiumchloride hexahydraat, 16,6 mM magnesiumsulfaat in 1 liter steriel water). Steriel filter met 0,2 urn filter vóór opslag bij 4 ° C.
- Om 1x BSS voor te bereiden op experimenteel gebruik, verdunnen 50 ml BSS voorraad 1 en 50 ml BSS voorraad 2, afzonderlijk, in 400 ml steriel water elk. Combineer verdunde oplossingen op pH 7 en voeg 20 ml FBS (2%). Top tot 1 L met behulp van steriel water en steriel filter met behulp van 0,2 um filter.
LET OP: BSS voorraad oplossingen moeten afzonderlijk worden opgesteld omdat de vermenging van geconcentreerde BSS voorraden direct kan leiden tot neerslag.
- Rode bloedcellen (RBC) Lysis Buffer
- RBC lysisbuffer bereiden, mengen 9 delen stock ammoniumchloride (155 mM ammoniumchloride in steriel water) tot 1 deel stock Tris-base (130 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan in steriel water, pH 7,65) vóór gebruik.
OPMERKING: WINKEL steriele voorraadoplossingen ammoniumchloride Tris-base en bij 4 ° C. Bereid lysis bUffer verse efficiënte lysis van RBC te waarborgen.
- RBC lysisbuffer bereiden, mengen 9 delen stock ammoniumchloride (155 mM ammoniumchloride in steriel water) tot 1 deel stock Tris-base (130 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan in steriel water, pH 7,65) vóór gebruik.
2. Genereren van lymfocyt Schorsing van Milt en lymfeknopen
NB: Het is belangrijk om alle reagentia en de apparatuur die nodig is voor het experiment voordat muis euthanasie voor te bereiden en enkele cel suspensies van lymfocyten genereren zo snel mogelijk een hoge levensvatbaarheid van de cellen te handhaven.
- Euthanaseren experimentele muis door cervicale dislocatie of CO 2 stikken.
LET OP: Vanaf deze stap verder, moeten alle experimentele procedures aseptisch worden uitgevoerd. - Dompel de hele muis in 70% ethanol alvorens incisies. Verwijder de milt en lymfeknopen aseptisch 8 en plaats ze in afzonderlijke 15 ml buisjes met 5 ml ijskoude RPMI / FBS (RPMI met 2% FBS) of BSS / FBS (uit stap 1.2.3).
LET OP: Aangezien BSS voorkomt efficiënt RBC lysis, gebruiken RPMI voor de bereiding van de milt cel schorsing en over te schakelen naar BSS after RBC lysis. - Een enkele celsuspensie van de milt of lymfeknopen genereren, plaatst het orgaan (en) tussen twee stukken steriele 100 urn mesh zeef cel in een petrischaaltje met 2 ml ijskoude RPMI / FBS of BSS / FBS. Met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit, mash het orgel (s) totdat het is in zeer fijne delen gescheurd.
- Breng de celsuspensie om een 15 ml buis en was de cel zeef gaas met ijskoude RPMI / FBS of BSS / FBS. Verzamel de resterende celsuspensie toevoegen aan dezelfde 15 ml buis en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
LET OP: resuspendeer de gepelleteerde cellen door flicking de buis met de vingers voor het toevoegen van RBC lysis buffer of medium in de daaropvolgende stappen. - Bereid kamertemperatuur (KT) RBC lysis buffer tijdens het centrifugeren van de celsuspensie (zie stap 1.3.). Na het pelleteren van de cellen en het verwijderen van het supernatant, resuspendeer de cellen met 1 ml RBC lysis buffer voor elke 10 8 cellen. Incuverminder de lysis reactie bij kamertemperatuur gedurende 3-4 min.
- Stop RBC lysis met 14 ml ijskoude BSS / FBS en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
3. Zuivering van B en T-cellen
- Zuivering van B cellen
- Tel de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer maximaal 10 8 miltcellen in 300 gl BSS / FBS en voeg 50 ul anti-CD43 magnetische microkralen 9,10. Om de dode cellen te verwijderen, voeg 30 ul Annexine V magnetische bolletjes. Incubeer de celsuspensie in een 4 ° C koelkast gedurende 30 minuten.
- Zuivering van T-cellen
- Tel de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer maximaal 10 8 cellen in niet-T-cel depletie antilichaam cocktail (gebiotinyleerde antilichamen tegen CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, TER119 en CD4 of CD8 afhankelijk van de beoogde celpopulatie gezuiverd), verdund 1: 200 in 200 gl BSS / FBS 4,5. Incubeer de celsuspensie in een4 ° C koelkast gedurende 15 minuten.
- Na incubatie, voeg 10 ml BSS / FBS aan de cellen te wassen en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 165 ul BSS / FBS met 30 ul streptavidine microkralen en 15 ui Annexine V magnetische korrels. Incubeer de celsuspensie in een 4 ° C koelkast gedurende 30 minuten.
Opmerking: Om nog labelen met magnetische microkralen waarborgen Incubeer de cellen met microkralen voor 15 min en meng de celsuspensie voorzichtig door op de 15 ml buis en incubeer nog 15 min bij stap 3.1.1. of 3.2.2.
- Voorbereiding van de scheidingskolom voor mobiele Zuivering
- Bereid een ongebruikte scheidingskolom tijdens microbeads labeling van de cellen (stap 3.1.1. En 3.2.2.). Voorverwarmen BSS (zonder FBS) tot kamertemperatuur en gebruik 2 ml te wassen en equilibreren de kolom aseptisch. Na equilibratie met BSS, moet de kolom gewassen niet uitdrogen.
LET OP: We gebruiken de LS column in plaats van de aanbevolen LD kolom toe te schrijven aan de herbruikbaarheid (zie stap 3.4.). - Na labeling met de magnetische korrels, voeg 14 ml BSS / FBS aan de cellen te wassen en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1-3 ml RT BSS.
- Bevestig een steriele 21 G naald in het uiteinde van de kolom om de stroomsnelheid te verminderen tijdens het proces van zuivering. Laad de celsuspensie op de geëquilibreerde kolom en verzamel de stroming door met het gezuiverde doelcellen.
OPMERKING: Vermijd het introduceren van bellen in de kolom tijdens het laden. - Was de kolom eenmaal met 1 ml BSS / FBS en laat de stroom door de met gezuiverde doelcellen. Reload de kolom met de stroom door nogmaals. Verzamel de stroom door naar de tweede in eenzelfde 15 ml buis.
- Was de kolom 3 maal met 1 ml BSS / FBS en laat de stroom door de met gezuiverde doelcellen. Daarna, voeg 5 ml BSS / FBS aan The kolom en met een plunjer, spoel de magnetisch gemerkte cellen uit de kolom in een nieuwe 15 ml buis.
- Controleer de zuiverheid van het door middel van flow cytometrie verzameld onder gebruikmaking van antilichamen die binden aan antigenen van gezuiverde B- of T-cellen 4,5 huidcellen.
- Bereid een ongebruikte scheidingskolom tijdens microbeads labeling van de cellen (stap 3.1.1. En 3.2.2.). Voorverwarmen BSS (zonder FBS) tot kamertemperatuur en gebruik 2 ml te wassen en equilibreren de kolom aseptisch. Na equilibratie met BSS, moet de kolom gewassen niet uitdrogen.
- Hergebruik van de scheidingskolom
OPMERKING: De LS kolom kan worden hergebruikt voor 4 keer zonder dat zuiveringsrendement.- Was de kolom 3 maal met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 3 maal met 5 ml gedestilleerd water van bovenaf met de plunjer.
- Was de kolom met 5 ml 70% ethanol en droog de kolom uitgebreid met behulp van een kraan lucht om de opbouw van roest in de kolom te voorkomen.
- Om een gebruikt LS kolom voor een afzonderlijk experiment zuivering bereiden, de kolom was van onderaf met 5 ml 70% ethanol met behulp van de injectiespuit adapter. Vervolgens was de kolom van onderaf tweemaal met 5 ml steriel PBS, gevolgd door 5 ml PBS keer vanaf de top van de kolom. Voeg 2RT ml BSS aan de kolom equilibreren en vervolgens overgaan tot het laden van de kolom met gelabelde cellen.
4. CFSE Labeling en Stimulatie
OPMERKING: Gezuiverde cellen kunnen worden onderworpen aan een verscheidenheid van in vitro en in vivo functionele bepalingen. We gebruiken hier gezuiverde T-cellen de T-cel stimulatie vermogen van APCs 5 bepalen.
- Voorverwarmen merkoplossing (0,1% FBS in PBS) tot 37 ° C voorafgaand aan CFSE laden.
OPMERKING: Met een laag percentage FBS in PBS vermindert celdood bij CFSE laden en minimaliseert celverlies tijdens het centrifugeren. Echter, te veel FBS bemoeien met CFSE laden. - Was cellen tweemaal gezuiverd met etiketteeroplossing, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 2 x 10 7 cellen / ml in voorverwarmde labeling oplossing in een 15 ml buis.
- Bereid 10 uM CFSE-oplossing (1: 500 verdunning van 5 mM CFSE voorraadoplossing) in voorverwarmde labelingoplossing. CFSE oplossing moetworden vers bereid telkens optimale labeling bereiken.
- Cellen met CFSE laden kan 1 deel celsuspensie tot 1 deel 10 uM CFSE oplossing in een 15 ml buis en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Een eindconcentratie van 5 pM CFSE gebruikt labelen 1 x 10 7 cellen / ml.
- Inverteer de buis elke 2 minuten om een homogeen mengsel van cellen tijdens CFSE laden waarborgen.
- Om de reactie te stoppen, voeg enkele volumes ijskoude RPMI compleet medium en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na succesvolle CFSE lichaam, wordt de celpellet weergegeven geelachtig.
- Wassen CFSE beladen cellen één keer met ijskoude RPMI compleet medium en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C voor gebruik in vitro kweken of in vivo stimulatie.
5. In vitro stimulatie
- Bereid een 2x voorraad oplossing van stimuli (2x stimuli stockoplossing) onmiddellijk voor het gebruik, zodat 100 gl 2x stimuli voorraadoplossing kan tot 100 gl cellen worden toegevoegd aan een eindvolume van 200 ui per putje in een 96-wells plaat.
- Indien een plaat waarop stimuli (IgM of CD40 op B-cellen en CD3 en CD28 op T-cellen) nodig verdunnen stimuli in PBS en voorbekleding de kweekplaat bij 4 ° C overnacht. Als alternatief kan de kweek plaat worden bekleed bij 37 ° C gedurende 1 uur op de dag van het experiment. Was de gecoate plaat tweemaal met PBS (Sta niet toe dat de plaat uit te drogen op elk moment).
| Voor de B-cellen | |
| stimuli | eindconcentratie |
| F (ab ') 2 geiten anti-muis IgM | 0,6-2,4 ug / ml |
| Anti-muis CD40 mAb | 0,5-2 ug / ml |
| recombinantmuizen IL-4 | 25 U / ml |
| lipopolysaccharide | 0,1-10 ug / ml |
| (LPS) van E. coli serotype 055: B5 | |
| Voor T-cellen | |
| stimuli | eindconcentratie |
| Anti-CD3 (plaat gecoat) | 2-10 ug / ml |
| (50 gl / putje voor coating) | |
| Anti-CD28 (plaat gecoat) | 2 ug / ml |
| Recombinant IL-2 | 40 U / ml |
| PDBu (forbolester) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (Calcium ionofoor) | 250 ng / ml |
Tabel 1: Concentraties van stimuli gebruikt om lymfocyten in vitro in kweek te stimuleren.
- Voor CFSE-gelabelde B-cellen, resuspendeer tot 3 x 10 6 cellen / ml in compleet RPMI-medium en kweek in triplo met 3 x 10 5 cellen / putje in 96-well platbodem platen gedurende 72 uur.
- Voor CFSE-gelabelde T-cellen, opnieuw op te schorten tot 0,5-3 x 10 6 cellen / ml in compleet RPMI-medium en cultuur in drievoud met 0,5-3 x 10 5 cellen / putje in 96-well ronde bodem platen voor 48 of 72 uur .
6. In vivo stimulatie
- Voor in vivo stimulatie, adoptief overdracht 4 x 10 6 CFSE-gelabelde T-cellen per muis (intraveneus (iv) in 200 gl PBS) in elk MHC-aangepaste ontvanger muis.
LET OP: In dit protocol, kan CFSE-gelabelde T-cellen adoptief worden overgebracht met behulp van staartader of retro-orbitale injectie als deze cellen zal de thuisbasis van organen zoals de milt en de lymfeklieren lymfoïde. - Daag de ontvangende muizen één dag meer met het antigeen.
NOTITIE:In dit voorbeeld gebruiken we ovalbumine (OVA-eiwit, 50 ug / muis) als antigeen omdat OVA-specifieke T-celreceptor (TCR) -transgenic T-cellen werden adoptief overgebracht in ontvangende muizen. Bereid OVA eiwit in steriele PBS en injecteer 100 ul van OVA-eiwit / PBS of PBS controle, via subcutane injectie (si), in elke ontvanger muis 5. - Oogsten en het genereren van suspensies van afzonderlijke cellen van lymfoïde organen (lymfeklieren en milt) van ontvangende muizen 3 dagen na immunisatie met OVA eiwit of PBS. Afzonderlijke lymfeknopen in proximale lymfeklieren (PLN), die axillaire, brachiale en oppervlakkige cervicale lymfeknopen) en distale lymfeknopen (DLN) omvat, die mesenterische, knieholte, lies, lumbale en caudale lymfeknopen omvat. Vlek cellen met de juiste antilichamen FACS controleren op T-celproliferatie.
Opmerking: In dit CFSE cell tracking experiment CFSE-gelabelde T-cellen uit PBS-geïnjecteerde controlemuizen stellen een basislijn fluorescentie voor niet-dividing cellen. Celdelingen van prolifererende, worden antigeen gestimuleerd, CFSE-gelabelde cellen gevisualiseerd door het meten van de fluorescentie pieken 12,13. De PBS controle, het aantal celdelingen van prolifererende, CFSE-gelabelde T-cellen kan worden bepaald 12,13. - Analyseer de CFSE-gelabelde celproliferatie gegevens door vergelijking van het aantal celdelingen of pieken tussen monsters (figuren 1 en 2).
Opmerking: Zo CFSE-gelabelde, OVA-specifieke T-cellen adoptief overgebracht in ontvangende muizen die OVA antigeen actieve proliferatie ondergaan in vergelijking met de PBS-geïnjecteerde controlemuizen 5,12. Verder zij erop gewezen op wijzen dat er veel manieren om CFSE celproliferatie te analyseren, zoals aangetoond door Hawkins en collega 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnetische cel zuivering van lymfocyten kunnen gebruikers een doelcelpopulatie zuiveren in een relatief korte tijd. Met onze uitputting protocol konden we het percentage van CD8 T-cellen (OT-I in recombinatie-activerende genen-1 (RAG-1) deficiënte muizen) stijgen van 72,8% (voor zuivering) tot 94,2% (na zuivering; Figuur 1A) 4,5. Deze gezuiverde lymfocyten kunnen vervolgens worden gebruikt voor downstream functionele testen om lymfocytproliferatie en signaaltransductie 4,5 bepalen. Zo kunnen we de in vivo T-cel stimulatie aantal APCs bestuderen door overdracht CFSE-gelabelde antigen-specifieke T-cellen in wildtype (WT) en mutant (MT) muizen geïmmuniseerd met geschikte antigeen 5.
In onze representatief experiment, overgedragen we gezuiverd, CFSE gemerkte, ovalbumine (OVA) specifieke OT-I CD8 Tcells in controle (WT) en mutant (MT) geïmmuniseerde muizen en muizen die één dag meer met OVA-eiwit. Drie dagen na immunisatie, we geoogst lymfeklieren (proximale en distale) en milt en de T-cellen geanalyseerd door flowcytometrie. CD45 allelvormen kan worden gebruikt voor het verdelen, CFSE-gelabelde donor OT-I CD8-cellen beter te scheiden van ongemerkte, ontvanger CD8 T-cellen. In dit voorbeeld donor en ontvanger cellen van CD45.1 en CD45.2 muizen, respectievelijk (Figuur 1B). De CFSE niveau van overleven, ongestimuleerde OT-I T-cellen op dit tijdstip worden gebruikt om de piek van niet-prolifererende cellen (figuur 1C, stippellijn) gedefinieerd. Bij stimulatie, zal de intensiteit van CFSE niveaus OT-I T-cellen halveren met elke sector. T-celproliferatie kan daarbij worden bepaald door telling van het aantal CFSE pieken 6,12. In onze representatieve resultaten, hebben we geen verschillen in de cross-presentatie capaciteiten van WT en MT APC's (zieFiguur 1C, ononderbroken lijnen), aangezien de T-cellen prolifereren op gelijkwaardige wijze bij muizen.
In een afzonderlijk experiment hebben we een [3H] -thymidine opname assay de proliferatie van geactiveerde cellen controle en MT cellen te bestuderen. Gezuiverde WT en MT-cellen werden gestimuleerd met verschillende stimuli voor 48 uur gepulseerd met [3 H] -thymidine gedurende de laatste 8 uur. Prolifererende cellen in de S-fase van de celcyclus zal het radioactief gemerkte nucleotide bevatten, [3 H] -thymidine, in nieuw gesynthetiseerde desoxyribonucleïnezuur (DNA), dus middels vloeistofscintillatietelling, celproliferatie kunnen worden gemeten door [3H] -thymidine opname. Het aantal tellingen per minuut (cpm) rechtstreeks correleert met de hoeveelheid [3 H] -thymidine opname in prolifererende T-cellen. In onze representatieve resultaten, het verminderde aantal cpm verkregen MT-cellen na stimulering in vergelijking met counts van WT T-cellen geeft een gecompromitteerde prolifereren van MT-cellen (figuur 1D).
B-cellen prolifereren kunnen bepalen werden gezuiverde milt B-cellen met de uitputting beschreven strategie. Na zuivering, konden we het percentage B220 B-cellen (WT-muizen) stijgen van 63,9% (voor zuivering) tot 98,4% (na zuivering Figuur 2A) 4. Soortgelijke gezuiverde T-cellen, kunnen gezuiverde milt B-cellen worden gebruikt voor downstream functionele testen om lymfocytproliferatie en signaaltransductie 4 beoordelen. Vervolgens we gemerkte gezuiverde WT milt B-cellen met CFSE en gestimuleerd deze cellen in vitro gebruik van platen bekleed met anti-CD40 aangevuld met het cytokine IL-4. Drie dagen na stimulatie, analyseerden we levensvatbare, geactiveerde B-cellen door flowcytometrie. De CFSE niveau van overleven, worden gestimuleerde B-cellen op dit tijdstip vroegerdefiniëren de piek voor niet-delende cellen (Figuur 2B, stippellijn). Soortgelijke T-cellen, zal de intensiteit van CFSE niveaus in B-cellen halveren met elke divisie 6,12.
Figuur 1: CFSE profielen van adoptief overgedragen gezuiverd OT-I T-cellen na immunisatie (A) CD4 en CD8 kleuring van cellen geïsoleerd uit OT-I;. RAG-1-deficiënte muizen vóór (bovenste paneel) en na (onderste paneel) niet-T-cel depletie. (B) Representatieve FACS plots van T-cellen van de milt (Sp), proximale lymfeklieren (PLN) en distale lymfeknopen (DLN). Donor OT-I CD8 T-cellen worden CD45.1 positief. (C) Representatieve CFSE profielen overgedragen, CFSE-gelabelde OT-I donor-T-cellen uit de milt (Sp), proximale lymfeklieren (PLN) en distale lymfeknopen (DLN) van WT (gearceerde lijnen) enMT (getrokken lijnen) ontvangende muizen 3 dagen na immunisatie met OVA-eiwit en LPS. Stippellijn geeft OT-I T-cellen van WT ontvanger muizen zonder immunisatie (PBS geïnjecteerd). (D) Cell proliferatie van geactiveerde controle of MT-cellen zoals gemeten door [3H] -thymidine opname assay. De resultaten worden in tellingen per minuut (cpm). Gezuiverde controle (open staaf) of MT (gesloten staaf) T-cellen werden gedurende 48 uur in alleen medium (medium) of in aanwezigheid van plaatgebonden anti-CD3 of anti-CD3 plus anti-CD28 met of zonder recombinant IL 2. Polyklonale cel activatie werd veroorzaakt door PMA (forbolester) en A23 (calcium ionofoor). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: CFSE profiel vanB-cellen na in vitro stimulatie. (A) B220 en CD3-kleuring van miltcellen geïsoleerd uit WT-muizen vóór (bovenste paneel) en na (onderste paneel) niet-B cel depletie. (B) Representatieve CFSE profiel van CFSE-gelabelde WT (gearceerde curve) milt B-cellen na 3 dagen in vitro stimulatie met platen bekleed met anti-CD40 en IL4. Stippellijn geeft CFSE-gelabelde WT B-cellen zonder stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol tonen we een werkwijze voor het zuiveren van lymfocyten uit lymfoïde organen. Cel zuivering gebruikmakend van magnetische bead sortering is een snelle en eenvoudige methode die levensvatbare, sterk gezuiverd doelwitcellen oplevert.
Kritische stappen in het protocol
Levensvatbaarheid van de cellen en de opbrengst cel
Het handhaven van de levensvatbaarheid van hematopoietische afkomst cellen in vitro is van cruciaal belang om te zorgen voor een succesvolle en reproduceerbare experimenten. Chemische en biologische reagentia, sub-optimale experimentele omstandigheden of oneigenlijk voorwaarden van uitgesneden organen opslagruimte kunnen allemaal van invloed levensvatbaarheid van de cellen. Na excisie van muizen lymfoïde organen moeten worden opgeslagen op ijs en enkele celsuspensies bereid zo spoedig mogelijk. Snelle centrifugeren van celsuspensies moet ook worden vermeden. Bovendien moet celpellets worden losgemaakt door de knop buizen met vingers na verwijdering van de supernatant. Het is nietaanbevolen om opnieuw te schorten pellets direct met grote hoeveelheden medium door pipetteren.
Ongeveer 2-4 x 10 7 milt B-cellen en 2 x 10 7 T-cellen van alle grote lymfeknopen kunnen worden geïsoleerd van 8-10 weken oude WT muis. Verminderde aantallen gezuiverde B- en T-cellen (onder de verwachte waarde) geeft sub-optimale omstandigheden, zoals eerder vermeld.
cel zuiverheid
De gemiddelde zuiverheid van geïsoleerde cellen met dit protocol in het traject van 90 tot 95%, dat voldoende zuiver was voor daaropvolgende in vitro of in vivo experimenten (Figuur 1A). Het verdient aanbeveling de scheidingskolom overmatige aantallen cellen niet te overbelasten tijdens het scheidingsproces omdat daarmee cel zuiverheid beschadigen vanwege beperkte bindingscapaciteit van de kolom.
Kwaliteit van FBS
Dekwaliteit van FBS bovenop hun kweekmedium is kritisch voor de in vitro overleving van lymfocyten. FBS uit verschillende bronnen en partijen kunnen variëren in hun vermogen om te ondersteunen in vitro lymfocyt responsen. Daarom is het belangrijk om verschillende soorten FBS testen die hoge specifieke respons met lage achtergrond geeft vinden. Een aanzienlijk aantal flessen moet dan worden gereserveerd als een aandeel.
Wijzigingen en problemen oplossen
CFSE labeling voorwaarden
Hoewel CFSE labeling werkt in platte RPMI hebben wij gevonden dat het gebruik van een laag percentage FBS in PBS vermindert celdood tijdens het laden, zonder de efficiëntie van labeling. Bovendien zal de aanwezigheid van FBS minimaliseert celverlies tijdens het centrifugeren.
Een belangrijk aspect van CFSE labeling is zelfs labeling van de cellen te waarborgen om de afzonderlijke piek visualiserens die de celdeling vertegenwoordigen. Overbelasting van CFSE kan resulteren in verhoogde celdood in vitro of slechte terugwinning van gelabelde cellen in vivo. Anderzijds kan onvoldoende CFSE labeling of heterogeniteit in de doelcel suspensie tijdens de werkwijze voor het merken resulteren in slechte resolutie CFSE pieken 12. Daarom is het belangrijk om de CFSE labeling te optimaliseren. De hoeveelheid CFSE voor etikettering dienen zo laag mogelijk om potentiële toxische effecten van overbelasting verminderen blijven, maar nog voldoende etikettering goed gescheiden pieken bij stimulatie binnen de experimentele tijd detecteren bereiken. Bovendien slecht gescheiden pieken voorkomen, moet celklonten van eencellige suspensies vóór CFSE laden worden verwijderd.
Cel klonten en celverlies
Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de cellen worden volledig opnieuw geschorst alvorens tot de volgende stap, omdat de eeuwige removal van de cel klonten tijdens het experiment vermindert drastisch cel aantallen. Celklonten worden gewoonlijk geassocieerd met een verminderde cellevensvatbaarheid of inadequate resuspensie van de celpellet.
CFSE en emissie spectra overlap
CFSE-gelabelde cellen kunnen verder worden gedefinieerd fluorofoor geconjugeerde antilichamen na één dag in kweek, maar deze CFSE-gelabelde cellen nog steeds helder fluorescent na een dag in kweek. Gebruikmakend van combinaties van antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen helder met minimale hoeveelheden emissiespectra overlappen met CFSE, zoals phycoerythrine (PE) en fyco-cyanine 7 (PeCy7), een optimale kleuringen. Echter, de vergoeding te verminderen emissiespectra overlap is nog steeds nodig. Bovendien, vanwege de hoge intensiteit van CFSE signaal (FL-1 kanaal) dat gemorst in de FL-2 kanaal de FL-2 kanaal te compenseren verminderd met het hoge percentage FL-2 waarde aan een opt bereikeniMAL CFSE profiel. Men kan verwijzen naar een door Quah et al., Welke oplossingen voor problemen CFSE labeling en analyse van de resultaten 12 bepaalt papier.
Alternatieven voor CFSE
Het emissiespectrum van CFSE beperkt het gebruik van combinaties van CFSE met fluoresceïne derivaten zoals groen fluorescent eiwit (GFP) en fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerde antilichamen. Er zijn echter ook andere commercieel beschikbare mobiele kleurstoffen met een even hoge fluorescentie-intensiteit en een lage toxiciteit cel in violet (CTV, excitatie / emissie: 405/450 nm), geel (CTY, 555/580 nm), veel rood (CTFR, 630 / 661 nm of CPD670, 647/670 nm) en rode (PKH26, 551/567 nm). Met behulp van mobiele labeling kleurstoffen met verschillende emissiespectra biedt flexibiliteit in het experimenteel ontwerp. Anderzijds kunnen niet alle bovenbeschreven cel labeling kleurstoffen afzonderlijke celdeling pieken genereren. Een vergelijkende studie uitgevoerd met behulpverschillende cel labeling kleurstoffen geconcludeerd dat CTV is een beter alternatief voor CFSE omdat CTV maakt de detectie van een groter aantal duidelijke celdeling pieken 13.
beperkingen
De belangrijkste beperking van magnetische celsortering is dat het alleen voor eenvoudige celsortering. In ons voorbeeld, konden we CD43 gebruiken om alle niet-B-cellen uit de milt afbreken; echter, zouden we niet in staat zijn om folliculair B-cellen te scheiden van marginale zone B-cellen. Deze subpopulaties kunnen alleen worden gedefinieerd meerdere oppervlaktemerkers. Hoewel het mogelijk is om positief te selecteren cellen gebruikmakend van magnetische celsortering op basis van meerdere oppervlaktemerkers, is afhankelijk van speciaal geprepareerd, in de handel verkrijgbare reagens dat de afgifte van microkralen van doelcellen na de eerste ronde van sortering alvorens de tweede markering mogelijk. Aldus zou de gebruiker volledig afhankelijk van de commercieel verkrijgbare kits. In dat geval FACS iis veel voordeliger scheiden geraffineerde celpopulaties.
Betekenis van de Techniek
Antilichamen gebaseerde celsortering benaderingen, zoals magnetische celsortering en FACS, zijn de meest betrouwbare celsorteertechnieken tot dusver 15. Andere werkwijzen van celscheiding bestaan, zoals dichtheid gebaseerde en hechting gebaseerde technieken echter lymfocyten slecht hechtende cellen en hun subpopulaties in dichtheid meer vergelijkbaar, waardoor de therapietrouw en dichtheid gebaseerde technieken ofwel niet van toepassing of erg inefficiënt 15 .
Zoals vermeld in de inleiding, snel, eenvoudig hoge levensvatbaarheid van de cellen, onafhankelijk van een geavanceerde apparatuur zijn de winnende kenmerken van magnetische celsortering via FACS. Vooral negatieve depletie met behulp van magnetische celsortering labels en uitput ongewenste cellen onder toepassing van een magnetische scheidingskolom, terwijl isoleren doelcellen met minimale WIJZIGIns aan het celoppervlak en het handhaven van de naïeve toestand.
toekomstige toepassingen
De sterk verrijkte, levensvatbare en naïeve lymfocyten gezuiverd met behulp van deze magnetische gebaseerde zuiveringstechniek kan worden onderworpen aan verschillende functionele assays lymfocyt gedrag en signalering mechanismen in vitro en in vivo. In dit protocol, we gedemonstreerd met twee verschillende celproliferatiebepalingen - [3 H] -thymidine incorporatie assay en CFSE celproliferatie assay - de celproliferatieve capaciteit van geactiveerde lymfocyten onderzoeken.
De keuze tussen [3 H] -thymidine opname assay en CFSE celproliferatie assay hangt grotendeels af monstergrootte en experimentele omstandigheden. Gebruik makend van de [3 H] -thymidine incorporatie assay experimenten met grote aantallen individuen genereert high-throughput celproliferatie data. Om optimaal [<sup> 3 H] -thymidine opname en reproduceerbaarheid, [3 H] -thymidine worden toegevoegd aan de kweek, wanneer de meerderheid van de cellen actief delende. Optimalisatie van de labeling protocol is vereist voor verschillende celtypes en stimuli. Verder komt door de radioactieve aard van [3 H] -thymidine, kan deze opname assay alleen worden uitgevoerd in vitro, in tegenstelling CFSE labeling van cellen die in vitro (figuur 2B) kan worden geactiveerd of adoptief overgebracht in ontvangende muizen (Figuur 1B en 1C).
De CFSE celproliferatie assay, anderzijds, biedt meer informatie over celproliferatie dan [3 H] -thymidine. Aangezien de intensiteit van CFSE in CFSE gemerkte cellen halveert bij elke celdeling kan men het aantal celdelingen en het percentage cellen in elke sector door het tellen van het aantal en de grootte van de pieken te bepalen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Het onderzoek wordt ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 en Tier2-MOE2013-T2-2-038). Het manuscript werd bewerkt door Amy Sullivan van Obrizus Communications.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
