Summary
Эта рукопись описывает подробный протокол для фенотипической и количественного анализа резидентных макрофагов из почек крыс с помощью проточной цитометрии. Полученные клетки могут запятнанные быть также использованы для других приложений, в том числе клеток, сортировкой анализа экспрессии генов или функциональных исследований, тем самым увеличивая информацию, полученную в экспериментальной модели.
Protocol
Этот протокол был одобрен местными институциональными уходу и использованию животных комитетов после Директивы 2010/63 / ЕС Европейского парламента и Национального руководящего принципа 53/2013.
1. Приготовление реагентов и растворов
- Подготовьте все реагенты и растворы в стерильных условиях и использовать под колпаком с ламинарным потоком. Хранить растворы при 4 ° С.
- Готовят окрашивающего буфера (2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в PBS 1X Дульбекко).
- Подготовка раствора коллагеназы путем добавления 0,5 мг коллагеназы в каждый мл физиологического раствора.
- Подготовка анестезии раствор кетамина / ксилазина (2: 1 об / об).
2. Почечная перфузия и экстракция
- Обезболить крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина (75 мг / 12 мг / кг массы тела). Тщательно зажать небольшой складки кожи, чтобы убедиться, что животное достаточно наркозом. Затем покрывают глаза ветеринара мазь для предотвращения сухости под наркозом. Примечание: 4-MONго-самцам крыс Wistar используются в данном анализе.
- После того, как крыса полностью под наркозом, поместите его на операционном столе в положении лежа на спине.
- Применяют 70% этанола в брюшной полости.
- Сделайте центральный разрез через кожу живота и брюшины, от лобка к грудной клетке, чтобы выставить плевральной и брюшной полости.
- Вводят физиологический раствор (0,9%) в брюшную аорту заливать почки с помощью перфузионной системы, пока вся кровь не будет удалена из почек. Вырезать аорты на уровне живота, чтобы помочь выпустить кровь.
- Удалить обе почки от крыс путем разрезания от почечной рубчика (почечной вены, артерии и мочеточника). Для decapsulate почки, прижимать край почки с помощью пальцев, тщательно отделяя капсулы 11.
- Поместите почку в сбалансированный солевой раствор Хэнкса.
3. Почки Пищеварение и клеточной суспензии
- Вырезать половина почки с ножницами на мелкие кусочки и положитьчастей в 1,5 мл пробирку.
Примечание: Все следующие концентрации рассчитаны для 1 образца (почки 1/2 крысы). - Добавляют 1 мл раствора коллагеназы и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Смешайте переворачиванием каждые 5 минут, чтобы убедиться, что раствор коллагеназы получает доступ к всей ткани.
- Собирают решение и передать его через сито (40 мкм) с помощью плунжера, и вновь суспендируют его в 10 мл окрашивающего буфера.
- Центрифуга при 400 х г в течение 15 мин.
- Повторное приостановить осадок в 1 мл ACK (аммоний-хлоридно-калий) Lysing буфера. Через 1 мин 30 с при комнатной температуре, добавляют 10 мл окрашивающего буфера для остановки реакции.
- Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин.
- Повторно приостанавливать осадок в адекватном объеме окрашивающего буфера (1 мл) и фильтруют суспензию клеток с использованием сетчатого фильтра (30 мкм).
- Подсчитайте число клеток с использованием трипанового синего на гемоцитометра и добавить 2 миллиона клеток в 1,5 мл пробирку для STAоцен- ками.
4. Сотовый анализ Окрашивание и проточной цитометрии
- Центрифуга клетки при 100 мкг в течение 5 мин.
- Повторное приостановить осадок в 100 мкл крысиной сыворотки (разведенным 1: 100) в течение 10 мин при 4 ° C, чтобы блокировать Fc-рецепторы.
- Промыть путем добавления 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге 100 мкг в течение 5 мин.
- Смешать антител к клеточной поверхности окрашивания в 100 мкл окрашивающего буфера для каждого условия: CD45, АРС-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) и раствор для обнаружения живых клеток (3: 1000).
- Повторное приостановить осадок клеток в смеси антител в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
- Промыть путем добавления 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин. Повторите этот шаг.
- Добавьте 600 мкл раствора / пермеабилизирующего Fixation в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
- Промыть 2 раза с 1 мл пермеабилизирующего / промывочного буфера и центрифугируют при 170 х г в течение 5 мин.
- Добавить антитела CD68 FITC (35: 1000) для intracellular окрашивание в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / промывочного раствора для каждого условия.
- Повторное приостановить осадок в CD68-антитело раствора и инкубировать 50 мин при 4 ° С в темноте.
- Промыть 1 мл пермеабилизирующего / промывочного буфера и центрифуге при 170 мкг в течение 5 мин.
- Повторное приостановить осадок в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / Wash, добавьте CD86PE антитела (35: 1000) и инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
- Вымойте добавлением 1 мл пермеабилизирующего / Wash буфера и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин.
- Повторное приостановить осадок в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / Wash и передать его в проточной цитометрии трубки.
- Анализ проб с помощью проточной цитометрии. Определение CD45 окрашивание в живых клетках закрытого типа в боковой рассеянный свет / вперед рассеянного света (/ FSC SSC) окна. На втором этапе, анализировать CD86 и CD163 выражение в CD68 + клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы проанализировали макрофагами гетерогенность в воспалительной экспериментальной модели повреждения почек, связанных с повышенным присутствием инфильтрации макрофагами в почках. В этой модели, повреждение почек индуцировали введением альдостерона (1 мг -1 кг -1 день) плюс соль (NaCl 1%) в питьевой воде в течение 3 -х недель у крыс линии Вистар, как сообщалось ранее 12.
График наших экспериментов показан на рисунке 1. Во- первых, клетки почек были выделены с использованием механических методов и дальнейшего ферментативного расщепления коллагеназой (рисунок 1А). После этого Эритроциты лизируют и почечные макрофаги были обнаружены с помощью проточной цитометрии. Клетки инкубировали с антителами к CD45, CD86 и CD163 для обнаружения мембран и CD68 для внутриклеточного окрашивания (рис 1б). Наконец, фенотип макрофагальной рopulations анализируют в соответствии со схемой , показанной на рисунке 1C.
Почечная макрофаг содержание анализировали путем выбора клетки с двойным положительности для CD45 и CD68 (Рисунок 2А). Используя протокол , описанный выше, увеличение CD45 + / CD68 + макрофагами наблюдалась в альдостерона крыс , получавших по сравнению с контрольной группой (0,57 ± 0,16 против 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + макрофаги в общих клеток почек) ( На рисунке 2 приведены в таблице вставки). Жизнеспособность CD45 + / CD68 + макрофагами, как определено с помощью проточной цитометрии с окрашиванием красителем фиолетовым, была обычно более чем на 95% (данные не показаны) .Thereafter, выражение CD86 (М1 маркер) и CD163 (М2 маркер) оценивали в числе CD45 + / CD68 + клетки. Администрация альдостерона увеличилось содержание CD45 + / CD68 + / CD86 + M1макрофаги (2,87 ± 2,3 против 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + макрофаги в общей CD45 + / CD68 + клеток) (рисунок 2). Тем не менее, низкое количество CD45 + / CD68 + / CD163 + М2 макрофаги наблюдались в обоих альдостерона обработанных и контрольных групп. Для анализа было ли выражение низкой CD163 связано с протеолитическим пролитой в ходе экспериментального протокола, мы повторяли эту процедуру, в том числе коллагеназы, в макрофагах , выделенных из брюшины крысы, как описано выше 13. Как сообщалось на фигуре 2В, CD45 + / CD68 + перитонеальные макрофаги были положительными как для CD86 и CD163, проверки полезность отобранных антител и подтверждение эффективности нашего протокола для характеристики макрофагов М1 / М2 в почках крыс.
Для подтверждения этих результатов,воспалительная реакция, связанная с поражением почек в указанных экспериментальных моделях была изучена методом иммуногистохимии и ПЦР в реальном времени. Как сообщалось на рисунке 3, увеличение CD68 + макрофаги наблюдались в альдостерон + Рассол крыс, по сравнению с контролем. Затем макрофаги маркеры фенотип определяли для характеристики почек M1 / M2 распределение макрофагами. Повышенная экспрессия мРНК иСОА и IFN-γ (M1 маркеры) наблюдалось после того, как альдостерона + солевой обработки, в то время как Arg1 или экспрессия мРНК IL-10 (M2 маркеры макрофаги) не изменилась после введения альдостерона. Вместе эти результаты подтверждают , что альдостерон + введение соли опосредует воспалительный M1 макрофагами фенотип в естественных условиях.
Рисунок 1: Протокол почечные клетки изоляции и обнаружения макрофагов с помощью проточной цитометрии. (А) и макрофага обнаружения с помощью проточной цитометрии (B). Представитель схема различных макрофагами фенотипов в соответствии с различным распределением для CD45, CD68, CD86 и CD163 маркеров (C). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: M1 и M2 макрофагальной Маркеры в Почки от альдостерона у крыс , обработанных методом проточной цитометрии Представительные дот-участки CD45 окрашивания в живых клетках закрытого типа в боковой рассеянный свет / вперед рассеянного света окна (A (SSC / FSC), слева. ) из суспензий почек в контроле и альдостерона + соль обработанных животных. Коробка внутри участков точечными идентифицирует живые клеткивыражая CD45. Клетки , включенные в эту коробку , были проанализированы для определения CD86 и экспрессии CD163 в CD68 + клеток (A, справа). Dot участок для перитонеальных макрофагов в качестве положительного контроля для обнаружения CD45, CD68, CD86 и CD163, применяя ту же стратегию, используемую ранее. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Воспалительный ответ после того, как альдостерона + Солт администрации. (А) Типичные изображения CD68 окрашивания и (Б) количественный анализ уровней мРНК , измеренных с помощью ОТ -ПЦР для маркеров M1 (ИНОС и INFγ) и маркеров M2 (arg1 и IL-10) в контроле и альдостерона + соль обработанных крыс. Данные экспрессе изд как среднее ± SEM. * Р <0,05 по сравнению с контроля. Шкала бар:. 100 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Макрофаги являются гетерогенными клетки, которые играют важную роль в различных воспалительных заболеваний, в том числе почечных расстройств. Существует растущий интерес к характеристике макрофаги подмножеств при заболеваниях почек , так как каждый макрофаг субпопуляции способствует различным способом к развитию почечной травмы, как сообщается в гломерулонефрита, диабетической нефропатии и рака почки 14-16. На ранних стадиях острого повреждения почек, наблюдается преобладание M1 макрофагов, способствуя тубулярный некроз и воспаление. Однако на более поздних стадиях более высокое содержание макрофагов М2 наблюдается разрешить воспаление и принимать участие в ремоделировании ткани. При хроническом заболевании почек, как М1 и М2 макрофаги сосуществуют одновременно, хотя M1 может быть преобладающим, тем самым увеличивая и увековечивая воспалительное повреждение почек. Поэтому важно, чтобы увеличить наши знания о патофизиологической роли макрофагов подтипов при заболеваниях почек, Иммуногистохимическое исследования не могут определить процент макрофагов подмножеств в прочном образом 17. Таким образом, необходимо разработать новые методы, чтобы количественно определить различные фенотипы макрофагами и понять роль этих клеток на почечную воспалительной реакции.
Эта рукопись описывает протокол для определения количества и фенотипа почечных макрофаги подмножеств с помощью проточной цитометрии у крыс. В нашем исследовании крыс подвергали воспалительной модели повреждений почек путем введения альдостерона. В этой модели, мы наблюдали увеличение CD45 + и С68 + инфильтрацию макрофагов , как определено с помощью проточной цитометрии и подтверждены с помощью иммуногистохимии. Кроме того, обогащение M1 макрофагов (CD68 + / CD86 +), но не М2 макрофагами, наблюдались у альдостерона обработанных мышей. Эти результаты были дополнительно подтверждены путем определения экспрессии мРНК M1 (иСОА и IFN-gamma) и M2 macrophмаркеры возраста (ARG1 или IL-10). Анализ проточной цитометрией сообщили о низком уровне смертности клеток во время протокола изоляции. Есть несколько факторов , которые могут повлиять на жизнеспособность клеток и поверхностных маркеров обнаружения, такие как уровень диссоциации ткани, а также продолжительность и тип пищеварения ткани (ферментативных, механика и т.д.). Чрезмерное пищеварение увеличивает смертность клеток и активацию макрофагов и уменьшает экспрессию маркера поверхности, в то время как противоположный эффект может быть результатом низкой диссоциации почек. Тем не менее, когда наш протокол был проведен в макрофагах, выделенных из брюшины крысы, наблюдалось расширение присутствия CD86 и CD163 в этих клетках.
Наш протокол был оптимизирован для определения макрофагальной гетерогенность в почках у крыс с альдостерона-опосредованной гипертензии, и, следовательно, могут быть экстраполированы на другие воспалительные модели заболевания почек. Тем не менее, эта процедура может быть приспособлена для каждого условия эксперимента, так как воспаление модифицируетцелостность тканей, влияя таким образом на скорость переваривания ткани с помощью коллагеназы.
Важно отметить , что для определения общего содержания макрофаг, клетки фиксировали и проницаемыми , чтобы позволить внутриклеточного мечения CD68 антителом 18. Протокол фиксации включали использование формальдегида, которые могут оказывать неблагоприятное воздействие флуорохромы, конъюгированного с первичными антителами, особенно фикоэритрин. Чтобы устранить эту проблему, инкубация с CD86-PE антитела проводили после добавления раствора Фиксирование / пермеабилизирующего и дальнейшей CD68-окрашивания. С другой стороны, важно отметить, что формальдегид может также столкнуться с другими анализами, которые могут быть выполнены после того, как макрофаги выделения, такими как экспрессия мРНК анализов. Тем не менее, существуют коммерческие наборы, доступные для выделения мРНК из формальдегида Фиксированные клетки.
Таким образом, этот протокол описан способ фенотипической характеристики почечных макрофагов в quantitatiве способом с использованием проточной цитометрии. В целом, протокол, описанный здесь, проста в использовании, воспроизводимым и полезно различать разные популяции макрофагов из почек крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S.
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
