Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
التشعبات من الخلايا العصبية الدوبامين يتلقى وينقل مدخلات متشابك، دعم العمل إمكانية العودة إكثار وإطلاق الناقلات العصبية. إن فهم هذه الوظائف الأساسية تسليط الضوء على نقل المعلومات في هذه الخلايا العصبية. توفر شجيري تسجيلات التصحيح المشبك إمكانية لفحص مباشر على الخواص الكهربائية من التشعبات والقنوات الأيونية الجهد بوابات الأساسية. ومع ذلك، هذه الهياكل الدقيقة ليست بسهولة الوصول إلى ماصات التصحيح بسبب قطرها صغير. ويصف هذا التقرير إجراء خطوة بخطوة لجمع التسجيلات مستقرة وموثوق بها من التشعبات من الخلايا العصبية الدوبامين في شرائح حادة. يتم الجمع بين القياسات الكهربية مع اللاحق التعافي من مورفولوجيا الخلايا. التجارب الناجحة تعتمد على تحسين إعداد شرائح والحلول والماصات، والتكيف الملائم للبصريات واستقرار ماصة في اتصال مع هيكل المسجلة. مبادئ القياسية سوموتطبق آتيك تسجيل التصحيح، المشبك إلى التشعبات ولكن مع نهج ألطف من ماصة. هذه التقنيات تنوعا يمكن تنفيذها لمعالجة مختلف المسائل المتعلقة خصائص منفعل من التشعبات.
تتلقى الخلايا العصبية المعلومات متشابك الغالب على التشعبات. مثير وإشارات متشابك المثبطة نشر من موقعهم من جيل إلى الموقع التكامل حيث أثار امكانات العمل (الجزائرية) كما إشارة خرج. في طريقهم، وتتأثر إمكانات متشابك من قبل كل من هيكل من التشعبات والتفاعل بين خصائص الغشاء السلبية والإيجابية. الجمع بين هذه المعايير اختلافا كبيرا يتسع الطاقة الحسابية من الخلايا العصبية 1،2. ومع ذلك، فإن قطره صغير من التشعبات يعيق لكن دراسة خواصها الكهربائية. التطوير المستمر لتقنية التصحيح، المشبك 3، والبصريات 4 وصقل طرق تحضير شريحة 5 خلال العقود الماضية مكنت التسجيلات من رقيقة جدا (0،7-3 ميكرون Ø) التشعبات 6،7. وكانت هذه الأساليب، و، لا تزال تستخدم إلى حد كبير لفحص استثارة التشعبات في مجموعة سالخلايا العصبية و 8. التسجيلات شجيري المباشرة ضرورية لتحديد التوزيع 9-19 والاختلافات في الخصائص الفنية 20-22 من القنوات الأيونية في مقصورات العصبية متميزة. هذه البيانات هي تكملة ضرورية لتوزيعات القناة الايونية الكشف مع المناعية مجتمعة للضوء والإلكترون المجهري 23،24. وقد تم تنفيذ تسجيلات somatodendritic المزدوجة لاستكشاف انتشار إمكانات العمل 9،13-15،21،22،25-27 ونشر إمكانات متشابك 13،16،18 على نطاق somatodendritic من الخلايا العصبية، الحصول على نماذج كابل السلبي مفصلة 28- 30 والتحقيق في القرار الزماني التكامل الخلايا العصبية 31.
المادة السوداء (SN) هي منطقة تقع في الدماغ المتوسط تشارك في عدة وظائف مثل السيطرة على الحركة، والترميز الثواب والسلوكيات المعتادة. انخفاض الدوبامين يرجع إلى الخاصويرتبط فقدان الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في SN مع الاضطرابات الحركية لوحظ في المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون 32. وتتكون الدائرة سودائي اثنين من أنواع الخلايا الرئيسية: الدوبامين وGABAergic الخلايا العصبية. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا العصبية لها العديد من الميزات الخاصة التي تميزها عن غيرها من الخلايا العصبية. محور عصبي نسبة كبيرة من الخلايا العصبية DA وبعض الخلايا العصبية GABA تنبع من موقع شجيري مشيرا إلى أن جذع شجيري هي غير متجانسة (محور عصبي الحمل والتشعبات، تفتقر إلى محور عصبي) 25،26،33. وبالتالي فإن التشكل من هذه الخلايا العصبية يتناقض مع منظمة نموذجية من الخلايا العصبية التي نقل المعلومات يتبع قانون الاستقطاب الديناميكي المنبعثة من كاجال: بدءا من التشعبات، إلى سوما وأخيرا إلى أكسون 34. ومن المعروف أن الخلايا العصبية DA أيضا لإطلاق الدوبامين من التشعبات 35، وتوليد النشاط انفجار 36 و اللدونة 37 NMDA مستقبلات. وdissecنشوئها من هذه الظواهر هو بعيد المنال دون التسجيلات مباشرة من موقع حيث يتم البدء فيها. للحصول على نظرة ثاقبة للعلاقة بين الموقع الدقيق والخصائص الفنية للقنوات ايون ودورها في استثارة والمعلومات شجيري نقل في الخلايا العصبية سودائي والتسجيلات شجيري المباشرة هي الأسلوب المفضل.
ويصف هذا التقرير إجراءات تفصيلية والتي يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات التصحيح المشبك واحد أو اثنين من التشعبات من الخلايا العصبية سودائي واللاحق biocytin وضع العلامات المقابلة. المبادئ الأساسية لترميم جسدية وغشاء شجيري متشابهة جدا. عمليا إلا أن التسجيلات من المواقع شجيري تتطلب الأمثل محددة بالمقارنة مع تسجيلات الجسدية. التسجيلات الجذعية الناجحة تعتمد على نوعية الشرائح، والتكيف الأمثل للبصريات، نهج طيف من ماصة التصحيح والاستقرار في التسجيلات.
ويصف هذا التقرير بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ المزدوجة somatodendritic تسجيلات خلية كاملة والتسجيلات شجيري المحلية. ومن المفيد لتحديد تأثير القنوات الأيونية (أي أنا ح) على مدار الساعة من إمكانات بعد المشبكي ورسم خرائط توزيع القناة الايونية (أنا ح) على نطاق somatodendritic من الخلايا العصبية DA سودائي، على التوالي. يتم الجمع بين الناتج القياسات الكهربية للنشر الكيمياء النسيجية خاصة لاسترداد مورفولوجيا الخلايا. كان يعمل الإجراء للتحقيق في الخلايا العصبية DA الموجودة في المادة السوداء، ولكن يمكن تعميمها على الخلايا العصبية المجاورة سودائي GABA، منطقة الجوفية السقيفية الخلايا العصبية DA أو غيرها من الخلايا العصبية الدماغ المتوسط. كما يمكن اتباع جميع الخطوات اللازمة لفحص القنوات الأيونية أخرى أعرب في التشعبات من الخلايا العصبية سودائي دون تعديلات هامة. اللاحق التصور هو أهمية خاصة لالخلايا العصبية مع محور عصبي الحملالتشعبات، مثل الخلايا العصبية سودائي 25،26، الحصين interneurons oriens-شكوة 21 أو بعض الخلايا العصبية CA1 الهرمي 67. ومن المثير للاهتمام، ويبدو أن الخلايا العصبية تقاسم هذه الميزة لتكون أكثر شيوعا مما يعتقد عموما 67. ويكشف التحليل الصرفي أيضا الموضع الدقيق للأقطاب ومحور عصبي. قد يكون الأمثل للكشف عن هذا الأخير من قبل وضع العلامات على البروتينات وأعرب في هذا الجزء محور عصبي الأولي (قنوات الصوديوم الجهد بوابات أو Ankyrin G) باستخدام المناعية 68،69.
موثوقية البيانات التي تم جمعها مع التسجيلات الجذعية ووضع العلامات العصبية اللاحقة يعتمد دائما على نوعية شريحة. لذا أقصى الجهود يجب أن تطبق للحفاظ على سلامة الخلايا داخل الأنسجة. ويتحقق ذلك مع التعامل مع لطيف من الحيوانات السليمة، وأدوات ذات جودة عالية والكواشف، الأوكسجين الكافي لدرجات حرارة الأنسجة والجليد الباردة خلال فترة إعداد شرائح. تعتمد ظروف التسجيل مستقرة على اختيار الخلايا العصبية السليمة. في وضع خلية كاملة، يجب سلسلة المقاومة في بادئ الأمر عند أدنى مستوى ممكن وحافظت ثابتة في كافة مراحل التجربة. استقرار التسجيلات يعتمد كذلك على المتلاعبين ذات جودة عالية خالية من الانجراف والاهتزازات. يمكن تخفيض هذه الاضطرابات عن طريق تحسين الاستقرار ماصة: التحقق من اتصال حامل ماصة وheadstage، الذي يسيطر على تلك الكابلات micromanipulator هي الركود، وتجنب التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة أو حركة المسرح وفحص آلية مناور. للحصول على تسجيلات مزدوجة، أدرج ميثيل 13،15،21 في حل داخل الخلايا، ولكن غلوكونات 9،14،25 يمكن بدلا من ذلك أن تستخدم. ومع ذلك، فإن أنيون الرئيسي قد يغير غشاء المحتملة 70،71 وبعض التيارات التي تعتمد على الجهد 72. يمكن استكمال حل داخل الخلايا مع ATP، GTP وفسفوكرياتين للحفاظ على physioloوظائف gical من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، إضافة صبغة الفلورسنت في حل ماصة (على سبيل المثال، اليكسا 594 أو Sulforhodamine 101 41) لتصور التشعبات خلال تسجيل الجسدية يمكن أن تكون مفيدة على سبيل المثال لوضع تطبيق الضغط (الشكل 7 في المرجع 41) أو تحفيز كهربائي ماصة. الحل ماصة للتسجيلات الخلية المرفقة يحتوي على تركيز K + عالية ولا نا + لتسجيل كبيرة أنا ح. الجدير بالذكر أن نسبة تركيز الصوديوم + / K + يؤثر على السعة الحالية 10، واحتمال انعكاس لل11 الحالي والمحاصرة من أنا ح 73. بدلا من ذلك، ح يمكنني أيضا أن يسجل استخدام خارج الرافضة 10. في هذا التكوين تسجيل ومع ذلك، قد يكون أقلقت الوسط بين الخلايا في القرب من القنوات. ونتيجة لذلك، فإن الاختلافات في تفعيل تعتمد على الجهد I <لوحظ الفرعية> ح عندما حصلت التيارات مقارنة باستخدام بقع الخلية المرفقة وخارج الرافضة 10. واجه تورم الخلايا العصبية في بعض الأحيان أثناء تسجيل التصحيح، المشبك، وغالبا ما ينشأ من أسباب واضحة مثل تدني نوعية المياه، وعدم التوازن القوي في الأسمولية أو درجة الحموضة بين حلول 39 أو أخطاء في داخل وخارج الخلية في تكوين الحلول. جودة التسجيلات الكهربية لديها حالات مباشر على نوعية مورفولوجيا الخلايا العصبية استردادها. وتستخدم عالية المقاومة الماصات الجسدية للتسجيلات المزدوجة (6-10 MΩ، كما هو الحال في المراجع 6،11) وللتسجيلات الجسدية واحدة بعد التسجيلات الخلية المرفقة للحد من التخفيف من الوسط بين الخلايا 14. ولذا فإن خلية كاملة تسجيل الجسدية بعد تسجيل الخلية المرفقة تظل قصيرة (<10 دقيقة). بقع خارج التدريجي من كل من جسدي وشجيري الماصات ضرورية لإقفال السليم للجغشاء الذراع وانتعاش لاحق من مورفولوجيا الخلايا. بالإضافة إلى بنية الخلية، يمكن تحديد محتوى الكيميائية العصبية للخلايا العصبية سجلت 59،74. على سبيل المثال، فإن الخلايا بروتين تيروزين هيدروكسيلاز يمكن immunolabeled لتحديد قاطع للخلايا العصبية DA 13.
وتتركز أساسا الخلايا العصبية DA في SN بارس المكتنزة، ذات كثافة أقل بكثير موجودة في SN بارس الشبكي، حيث اختلط أنها تحتوي على عدد أكبر من الخلايا العصبية GABA 75. في حين أن خلايا الجسم من الخلايا العصبية DA غالبا ما تكون أكبر من أن الخلايا العصبية GABA، وتحديد البصرية من هذه الخلايا مع IR-videomicroscopy غير مؤكد وعرقلت جزئيا التعتيم على المكتنزة بارس. وللتغلب على هذه القيود، وانتقاء ما قبل الخلايا العصبية DA يمكن أن يتيسر من خلال استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن علامة فلوري في مجموعة سكانية محددة من الخلايا العصبية (TH 65 أو DAT لالخلايا العصبية DA، GADلالخلايا العصبية GABA) والإضاءة epifluorescence. بدلا من ذلك، قد يتم تضمين صبغة الفلورسنت في حل من القطب الجسدية لتسهيل التصور من التشعبات. يتم إحضارها عن قرار زيادة الخلية الفلورسنت التي كتبها نيبكو الغزل القرص مبائر 14،22،30 أو اثنين الفوتون المجهري 7 مجتمعة لIR-DGC 6. ترتبط العديد من المزايا لنادي دبي للجواهر بالمقارنة مع مدينة دبي للإنترنت. أولا، كما لا يطلب رشة عمل مدينة دبي للإنترنت، وصورة IR-DGC يمكن مضافين مع 49،52،53،76 صورة مضان. ثانيا، نادي دبي للجواهر يمكن الجمع بين ضوئي وعلم البصريات الوراثي 77.
والعيب من إعداد شريحة هو الحفاظ على سلامة الخلايا العصبية. الخلايا العصبية DA تمتد التشعبات في الطائرات المكانية الثلاثة 78،79 وبالتالي اقتطاع مقصورة شجيري لا يمكن تجنبها تماما في شرائح 80. اختيار اتجاه شرائح (الاكليلية، أفقي أو الفقرةالسهمي) هو المفاضلة. يجب النظر في أصل تعصيب والتصميم التجريبي لتحديد الاتجاه الصحيح للشرائح.
الترقيع شجيري المباشر هو أسلوب يستخدم لرسم خريطة للتوزيع القنوات الأيونية وظيفية في مقصورات مختلفة من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية تتيح لتحديد التغير في الخصائص الفنية للقنوات 20. واستكمالا للموقع وكثافة من القنوات الأيونية يمكن التأكد باستخدام المناعية في مستويات الضوء والمجهر الالكتروني 17،23. كما يوفر هذا النهج إمكانية تحديد كثافة قناة في الهياكل عيار الصغيرة التي لا يمكن الوصول إليها لماصات التصحيح. ولكن هذه القنوات قد يكون في حالة وظيفية متميزة 24 أو حتى غير نشطة مقارنة مع تلك المسجلة باستخدام تقنيات التصحيح، المشبك. ولذلك فإن الضرورية للحصول على صورة كاملة للموقع وخصائص كل من تقنياتالقنوات الأيونية في منطقة خلوية معينة (17). مع تطور الأصباغ الحساسة الجهد، وقد استخدم التصوير الجهد لدراسة انتشار نقاط وصول وEPSPs في الخلايا العصبية في مواقع متعددة 81. كبديل لالمزدوجة التسجيلات التصحيح، المشبك، ويمكن هذا النهج حتى يتم تنفيذ لالتشعبات رقيقة التي لا يمكن الوصول إلى ماصات التصحيح ولكن يتطلب معايرة دقيقة للإشارة والمتوسط.
بينما الخلايا العصبية DA في SN ومنطقة الجوفية السقيفية يتم التحقيق فيها على نطاق واسع عبر تسجيلات الجسدية في سياق الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، والخصائص الفنية للالتشعبات لا تزال مجهولة إلى حد كبير في كل الظروف. الترقيع من التشعبات تم تنفيذه لالخلايا العصبية الدوبامين سودائي من قبل العديد من الجماعات مع نجاح 13،25،26 ويبقى الأسلوب المفضل لتشريح خصائص منفعل من هذه الهياكل التحت خلوية غرامة 8. توفر تسجيلات شجيري مزيد من opportuNITY للتدقيق كفاءة ومرونة انتقال متشابك واللدونة من استثارة شجيري 82،83.
The authors have nothing to disclose.
أشكر الدكتور فنسنت Seutin على دعمه المستمر، كريستيل Gillissen ولوران Massotte للحصول على مساعدة فنية ممتازة، الدكاترة جان Defourny وساندرا Ormenese للالنصائح مع المجهر متحد البؤر، الدكتور جاك خصص لهبة الثاني مكبر للصوت Axopatch 200B، وGIGA-التصوير منصة لتبادل المجهر متحد البؤر والبرمجيات Imaris والدكتور ستيفن فريمان لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من FRS البلجيكية – FNRS (U.N002.13 وT.N0015.13) ونشر بدعم من مؤسسة جامعة البلجيكي (Publié AVEC LE المناظرات دي لا مؤسسة الجامعي دو بلجيك).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |