Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Dendriten von dopaminergen Neuronen empfangen und vermitteln synaptischen Eingang, Unterstützung Aktionspotential Rückausbreitung und die Freisetzung von Neurotransmittern. Schuppen Licht in diesen Neuronen auf der Informationsübertragung wird diese grundlegenden Funktionen zu verstehen. Dendritische patch-clamp-Aufnahmen bieten die Möglichkeit, direkt auf die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und das darunter liegende spannungsgesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen. Jedoch sind diese feinen Strukturen nicht leicht zugänglich Patch-Pipetten wegen ihres kleinen Durchmessers. Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Verfahren stabile und zuverlässige Aufzeichnungen von den Dendriten von dopaminergen Neuronen in akuten Scheiben zu sammeln. Elektrophysiologische Messungen werden mit Post – hoc – Erholung der Zellmorphologie kombiniert. Erfolgreiche Experimente stützen sich auf eine verbesserte Herstellung von Scheiben, Lösungen und Pipetten, adäquate Einstellung der Optik und Stabilität der Pipette in Kontakt mit der aufgezeichneten Struktur. Standard-Prinzipien somatic Patch-Clamp-Aufzeichnung werden an Dendriten angewendet, sondern mit einem sanfteren Ansatz der Pipette. Diese vielseitigen Techniken können verschiedene Fragen zu den erregbaren Eigenschaften von Dendriten zu adressieren umgesetzt werden.
Neurone erhalten synaptischen Informationen überwiegend auf ihre Dendriten. Erregenden und hemmenden synaptischen Signale von ihrer Website von Generation zur Integrationsstelle verbreiten, in dem Aktionspotentiale (APs) als Ausgangssignal hervorgerufen werden. Auf ihrem Weg werden synaptische Potentiale beeinflusst sowohl die Struktur der Dendriten und die Wechselwirkung zwischen passiven und aktiven Membraneigenschaften. Die Kombination dieser sehr variablen Parameter erweitert die Rechenleistung von Neuronen 1,2. Jedoch verhindert der geringe Durchmesser von Dendriten jedoch die Untersuchung ihrer elektrischen Eigenschaften. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der Patch-Clamp – Technik 3 ist die Optik 4 und Verbesserung von Verfahren zur Schicht Vorbereitung 5 in den letzten Jahrzehnten haben es ermöglicht , Aufnahmen aus sehr dünn (0,7-3 & mgr; m Ø) Dendriten 6,7. Diese Verfahren wurden und werden immer noch verwendet weitgehend die Erregbarkeit von Dendriten in einer Vielzahl zu untersuchen of Neuronen 8. Direkt dendritischen Aufnahmen sind wesentlich die Verteilung 9-19 und Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften 20-22 von Ionenkanälen in verschiedenen neuronalen Abteilen zu bestimmen. Diese Daten sind die notwendige Ergänzung der Ionenkanalverteilungen mit Immunhistochemie nachgewiesen kombiniert , um Licht- und Elektronenmikroskopie 23,24. Dual – somatodendritische Aufnahmen wurden implementiert , um die Ausbreitung von Aktionspotentialen 9,13-15,21,22,25-27 und Verbreitung der synaptischen Potentiale 13,16,18 entlang der somatodendritische Domäne von Neuronen zu erforschen, erhalten detaillierte passive Kabelmodelle 28- 30 und die zeitliche Auflösung der neuronalen Integration 31 untersuchen.
Die Substantia nigra (SN) ist eine Region, in der Mittelhirns in mehreren Funktionen beteiligt sich beispielsweise die Steuerung der Bewegung, die Codierung von Belohnung und gewohnheitsmäßige Verhalten. Die Abnahme von Dopamin aufgrund der spezifischenVerlust dopaminerger (DA) Neuronen in der SN mit den motorischen Störungen in Patienten , die an Parkinson-Krankheit leiden , beobachtet 32 verbunden. Die nigral Schaltung besteht aus zwei Hauptzelltypen: dopaminergen und GABA-erge Neuronen. Interessanterweise haben diese Neuronen mehrere spezifische Eigenschaften, die sie von anderen Neuronen unterscheiden. Das Axon eines großen Anteils von DA – Neuronen und einigen GABA – Neuronen stammt aus einer dendritischen Ort anzeigt , dass die dendritischen Dorn heterogen ist (Axon-Lager und Axon-fehlt Dendriten) 25,26,33. Die Morphologie dieser Neuronen im Gegensatz daher mit der typischen Organisation von Neuronen in dem die Informationsübertragung das Gesetz der dynamische Polarisation emittiert von Cajal folgt: ausgehend von Dendriten zu soma und schließlich 34 bis Axon. DA – Neuronen sind auch Aktivität zu lösen Dopamin aus ihren Dendriten 35, erzeugen Platzen bekannt 36 und NMDA-Rezeptor Plastizität 37. Die dissection dieser Phänomene ist schwer zu fassen, ohne direkte Aufnahmen von der Stelle, wo sie initiiert werden. Um Einblicke in die Beziehung zwischen den genauen Ort und funktionellen Eigenschaften von Ionenkanälen und ihre Rolle bei der dendritischen Erregbarkeit und Informationstransfer in nigral Neuronen, direkte dendritischen Aufnahmen sind die Methode der Wahl.
Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Verfahren , die verwendet werden können Single- und Dual – Patch-Clamp – Aufnahmen von Dendriten nigraler Neuronen und dem entsprechenden Post – hoc – biocytin Kennzeichnung zu erhalten. Die Grundprinzipien für das Patchen der somatischen und die dendritischen Membran sind sehr ähnlich. Praktisch jedoch Aufnahmen von dendritischen Sites erfordern eine gezielte Optimierung im Vergleich zu somatischen Aufnahmen. Erfolgreiche dendritischen Aufnahmen verlassen sich auf die Qualität der Scheiben, eine optimale Anpassung der Optik, sanfte Annäherung der Patch-Pipette und die Stabilität der Aufnahmen.
Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Dual somatodendritische Ganzzellableitungen und lokale dendritischen Aufnahmen zu implementieren. Es ist nützlich für den Einfluss von Ionenkanälen zu bestimmen (dh I h) auf dem zeitlichen Verlauf der postsynaptischen Potentiale und Abbilden der Verteilung des Ionenkanals (I h) entlang der somatodendritischen Domäne von nigralen DA – Neuronen, respectively. Die resultierenden elektrophysiologischen Messungen kombiniert werden, um hoc histochemistry Post Zellmorphologie zu erholen. Das Verfahren wurde eingesetzt DA Neuronen zu untersuchen, in der Substantia nigra, kann aber für benachbarte nigral GABA-Neuronen verallgemeinert werden, Bereich ventralen tegmental DA Neuronen oder andere midbrain Neuronen. Alle Schritte können auch gefolgt werden , um andere Ionenkanäle untersuchen in Dendriten von nigral Neuronen ohne wesentliche Änderungen zum Ausdruck gebracht. Post – Hoc – Visualisierung ist besonders relevant für Neuronen mit Axon-LagerDendriten, wie nigral Neuronen 25,26, Hippokampus – oriens-alveus Inter 21 oder einigen CA1 Pyramidenneuronen 67. Interessanterweise scheinen Neuronen diese Funktion teilen häufiger zu sein als allgemein 67 gedacht. Morphologische Analyse zeigt auch die genaue Lage der Elektroden und axon. Die Detektion des letzteren können im Axon Anfangssegment (spannungsabhängige Na + -Kanäle oder Ankyrin G) mittels Immunhistochemie 68,69 ausgedrückt durch die Markierung von Proteinen optimiert werden.
Die Zuverlässigkeit der Daten mit dendritischen Aufnahmen und anschließender neuronalen Kennzeichnung gesammelt, hängt immer von der Scheibenqualität. Maximale Anstrengung muss daher angewandt werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des Gewebes zu erhalten. Dies wird mit schonenden Umgang mit gesunden Tieren, hochwertige Werkzeuge und Reagenzien, ausreichend Sauerstoffversorgung der Gewebe und eiskalten Temperaturen während der gesamten Herstellung von Scheiben erreicht. Stabile Aufzeichnungsbedingungen beruhen auf der Auswahl von gesunden Neuronen. In der whole-cell-Modus sollten Serienwiderstand anfänglich so niedrig wie möglich sein und gewartet werden während des gesamten Experiments konstant. Die Stabilität der Aufnahmen ist weiterhin abhängig von hochwertigen Manipulatoren ohne Drift und Vibrationen. Diese Störungen können durch die Optimierung der Pipette Stabilität reduziert werden: die Verbindung zum Pipettenhalter prüfen und zu heads, Controlling, dass Mikromanipulator Kabel sind schlaff, zu vermeiden plötzliche Änderungen der Temperatur oder Tischbewegung und die Überprüfung der Mechanismus des Manipulators. Für Doppelaufnahmen Methylsulfat- 13,15,21 wurde in der intrazellulären Lösung enthalten, aber Gluconat 9,14,25 können alternativ verwendet werden. Jedoch kann die Haupt Anion das Membranpotential 70,71 und einige spannungsabhängige Ströme 72 verändern. Intrazellulärer Lösung kann mit ATP, GTP und Phosphokreatin zur Erhaltung der Physiolo ergänzt werdengische Funktionen von Neuronen. Zusätzlich einen Fluoreszenzfarbstoff in der Pipettenlösung Zugabe (zB Alexa 594 oder Sulforhodamin 101 41) , um die Dendriten während einer somatischen Aufzeichnung zu visualisieren kann nützlich sein , zum Beispiel eine Druckanwendung zu platzieren (Abbildung 7 in Ref. 41) oder eine elektrische Stimulations Pipette. Die Pipettenlösung für Cell-Attached – Aufnahmen enthält einen hohen K + -Konzentration und keine Na + große I h zu erfassen. Bemerkenswert der Na + / K + Konzentrationsverhältnis beeinflusst die Stromamplitude 10, das Umkehrpotential des Stroms 11 und die Gating von I h 73. Alternativ kann ich h auch außerhalb Outs 10 aufgezeichnet werden. In dieser Aufzeichnungskonfiguration jedoch das intrazelluläre Milieu, in der Nähe der Kanäle gestört werden kann. Folglich Unterschiede in der spannungsabhängige Aktivierung von I <sub> h beobachtet wird beim Vergleich von Strömen mit Cell-Attached – Patches erhalten und außerhalb Outs 10. Anschwellen von Neuronen wird gelegentlich bei der Patch-Clamp – Aufzeichnung auftreten, und stellt sich oft aus verschiedenen Ursachen, wie die geringe Qualität des Wassers, starkes Ungleichgewicht in der Osmolarität oder pH – Wert zwischen dem intra- und extrazellulären Lösungen 39 oder Fehler in der Zusammensetzung der Lösungen. Die Qualität der elektrophysiologischen Ableitungen hat eine direkte Auswirkung auf die Qualität der Morphologie der verwerteten Neuronen. (- 10 MOhm, wie in Refs 6,11. 6) und für einzelne somatische Aufnahmen nach Cell-Attached – Aufnahmen 14 der Verdünnung des intrazellulären Milieu zu minimieren Hohe Beständigkeit somatischen Pipetten werden für Dual – Aufnahmen verwendet. Die Ganzzell-somatischen Aufzeichnung nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung wird deshalb kurz gehalten (<10 min). Outside-out-Patches von sowohl der somatischen und dendritischen Pipetten sind für die ordnungsgemäße Schließen der cell Membran und die anschließende Erholung der Zellmorphologie. Zusätzlich zu der Struktur der Zelle kann der neurochemischen Inhalt für die aufgezeichneten Neuronen 59,74 bestimmt werden. So kann beispielsweise die intrazelluläre Protein – Tyrosin – Hydroxylase immunmarkierten zur eindeutigen Identifizierung von DA – Neuronen 13 werden.
DA – Neuronen werden hauptsächlich in der SN pars compacta eingeengt, mit einer viel niedrigeren Dichte in der SN pars reticulata, wo sie sich mit einer höheren Anzahl von GABA – Neuronen 75 miteinander vermischt werden. Während die Zellkörper von DA-Neuronen ist oft größer als der GABA-Neuronen, ist die visuelle Identifizierung dieser Zellen mit IR-Videomikroskopie unsicher und teilweise durch die Opazität der pars compacta behindert. Um diese Einschränkungen, die Vorauswahl von DA – Neuronen umgehen kann durch die Verwendung von transgenen Mäusen , erleichtert werden , um einen Fluoreszenzmarker in einer bestimmten Population von Neuronen (TH 65 oder DAT für DA – Neuronen exprimiert, GADfür GABA-Neuronen) und Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung. Alternativ dazu kann ein Fluoreszenzfarbstoff in der Lösung der somatischen Elektrode eingeschlossen werden, um die Visualisierung von Dendriten zu erleichtern. Verbesserte Auflösung der Fluoreszenzzelle wird durch Nipkow Kreiselscheibenapplikators konfokalen 14,22,30 oder Zwei-Photonen – Mikroskopie 7 kombiniert , um IR-DGC 6 gebracht. Mehrere Vorteile werden DGC im Vergleich zu DIC bezogen. Zunächst wird , wie DIC Prismen nicht erforderlich sind, kann die IR-DGC Bildes mit einem Fluoreszenzbild 49,52,53,76 überlagert werden. Zweitens kann DGC mit Photostimulation kombiniert und Optogenetik 77.
Ein Nachteil der Scheibe Vorbereitung ist die Erhaltung der Integrität von Neuronen. DA – Neuronen erweitern ihre Dendriten in den drei Raumebenen 78,79 und damit Verkürzung des dendritischen Fach nicht vollständig in den Scheiben 80 können vermieden werden. Die Wahl der Orientierung der Scheiben (coronal, horizontal oder parasagittal) ist ein Trade-off. Der Ursprung der Innervation und dem experimentellen Design muss berücksichtigt werden, um die richtige Ausrichtung der Scheiben zu wählen.
Direkt dendritischen Patching ist die Technik verwendet, um die Verteilung der funktionellen Ionenkanäle in den verschiedenen Kompartimenten von Zellen abzubilden. Darüber hinaus bietet diese Technik die Variabilität in funktionellen Eigenschaften der Kanäle 20 zu bestimmen. Als Ergänzung kann die Position und Dichte von Ionenkanälen ermittelt werden mittels Immunhistochemie an den Licht- und Elektronenmikroskopie Ebenen 17,23. Dieser Ansatz bietet auch die Möglichkeit, die Kanaldichte in kleinkalibrigen Strukturen zu bestimmen, die Patch-Pipetten unzugänglich sind. Jedoch könnten diese Kanäle in einer bestimmten Funktionszustand 24 oder sogar inaktiv im Vergleich zu denen, Patch-Clamp – Techniken aufgenommen werden. Beide Techniken sind daher notwendig, um ein vollständiges Bild von der Lage zu erhalten und die Eigenschaften vonIonenkanäle in einem bestimmten zellularen Bereich 17. Mit der Entwicklung von spannungsempfindlichen Farbstoffen, Spannung Abbildungs verwendet wurde an mehreren Stellen 81 , um die Ausbreitung von APs und EPSPs in Neuronen zu untersuchen. Als Alternative zu Dual-Patch-Clamp-Aufnahmen, kann dieser Ansatz auch für dünne Dendriten implementiert werden, die auf Patch-Pipetten nicht zugänglich sind, aber eine genaue Kalibrierung des Signals und Mitteln erforderlich machen.
Während DA-Neuronen im ventral tegmentalen SN und Bereich über somatische Aufnahmen im physiologischen und pathophysiologischen Kontext umfassend untersucht werden, bleibt die funktionellen Eigenschaften ihrer Dendriten in beiden Bedingungen weitgehend unbekannt. Patchen von Dendriten wurde für nigral Dopamin – Neuronen von mehreren Gruppen mit Erfolg 13,25,26 und bleibt die Methode der Wahl zu sezieren erregbar Eigenschaften dieser feinen subzellulärer Strukturen 8 umgesetzt. Dendritische Aufnahmen bieten eine weitere Mögschaft , die Effizienz und die Plastizität der synaptischen Übertragung und die Plastizität der dendritischen Erregbarkeit 82,83 zu prüfen.
The authors have nothing to disclose.
Ich danke Dr. Vincent Seutin für seine ständige Unterstützung, Telle Gillissen und Laurent Massotte für hervorragende technische Unterstützung, Drs Jean Defourny und Sandra Ormenese für Ratschläge mit dem konfokalen Mikroskop, Dr. Jacques Destiné für das Geschenk des zweiten Axopatch 200B-Verstärker, der GIGA-Imaging Plattform für für kritische Lesen des Manuskripts des konfokalen Mikroskop und Imaris Software und Dr. Stephen Freeman zu teilen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem belgischen FRS unterstützt – FNRS (U.N002.13 und T.N0015.13) und mit Unterstützung der belgischen Universitätsstiftung (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) veröffentlicht.
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |