Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की dendrites प्राप्त करते हैं और synaptic इनपुट, समर्थन संभावित कार्रवाई के पीछे से प्रचार और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज व्यक्त करते हैं। इन मौलिक कार्यों को समझने इन न्यूरॉन्स में जानकारी हस्तांतरण पर प्रकाश डाला जाएगा। वृक्ष के समान पैच दबाना रिकॉर्डिंग संभावना सीधे dendrites और अंतर्निहित वोल्टेज gated आयन चैनल के बिजली के गुणों की जांच करने के लिए प्रदान करते हैं। हालांकि, ये ठीक संरचनाओं उनके छोटे व्यास की वजह से पैच pipettes के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं। इस रिपोर्ट में एक कदम दर कदम प्रक्रिया तीव्र स्लाइस में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की dendrites से स्थिर और विश्वसनीय रिकॉर्डिंग को इकट्ठा करने का वर्णन है। Electrophysiological माप सेल आकृति विज्ञान की पोस्ट अस्थायी वसूली के साथ संयुक्त कर रहे हैं। सफल प्रयोगों स्लाइस, समाधान और pipettes, प्रकाशिकी और दर्ज संरचना के साथ संपर्क में पिपेट की स्थिरता की पर्याप्त समायोजन की बेहतर तैयारी पर भरोसा करते हैं। सोम के मानक सिद्धांतोंatic पैच दबाना रिकॉर्डिंग डेन्ड्राइट के लिए, लेकिन पिपेट का एक gentler दृष्टिकोण के साथ लागू कर रहे हैं। इन बहुमुखी तकनीक dendrites के उत्तेजनीय गुण के विषय में विभिन्न सवालों को संबोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है।
न्यूरॉन्स उनके dendrites पर मुख्य रूप से synaptic जानकारी प्राप्त करते हैं। उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic संकेतों पीढ़ी की अपनी साइट से एकीकरण साइट है जहाँ कार्रवाई की क्षमता (ए पी एस) उत्पादन में संकेत के रूप में पैदा कर रहे हैं में फैल गया। अपने रास्ते पर, synaptic क्षमता दोनों dendrites की संरचना और निष्क्रिय और सक्रिय झिल्ली गुण के बीच बातचीत से प्रभावित हैं। इन अत्यधिक चर मापदंडों के संयोजन न्यूरॉन्स 1,2 के कम्प्यूटेशनल शक्ति चौड़ी। हालांकि, डेन्ड्राइट के छोटे व्यास हालांकि hinders उनके बिजली के गुणों का अध्ययन। (- 3 माइक्रोन Ø 0.7) dendrites 6.7 पैच दबाना तकनीक 3 के सतत विकास, प्रकाशिकी 4 और 5 टुकड़ा तैयारी के लिए तरीकों की शोधन पिछले दशकों के दौरान बहुत पतली से रिकॉर्डिंग के लिए सक्षम है। इन तरीकों में थे, और, अभी भी काफी हद तक एक किस्म ओ में डेन्ड्राइट के excitability जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंएफ न्यूरॉन्स 8। प्रत्यक्ष वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग वितरण 9-19 और कार्यात्मक गुण अलग न्यूरोनल डिब्बों में आयन चैनल का 20-22 में मतभेद निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं। इन आंकड़ों आयन चैनल प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 23,24 करने के लिए संयुक्त immunohistochemistry के साथ पाया वितरण के लिए आवश्यक पूरक हैं। दोहरी somatodendritic रिकॉर्डिंग कार्रवाई क्षमता 9,13-15,21,22,25-27 और synaptic क्षमता 13,16,18 न्यूरॉन्स की somatodendritic डोमेन साथ के प्रसार के प्रचार-प्रसार का पता लगाने में विस्तृत निष्क्रिय केबल मॉडल प्राप्त करने के लिए लागू किया गया है 28- 30 और न्यूरोनल एकीकरण 31 का अस्थायी समाधान की जाँच।
द्रव्य नाइग्रा (एस एन) इस तरह के आंदोलन का नियंत्रण, इनाम और अभ्यस्त व्यवहार की कोडिंग के रूप में कई कार्यों में शामिल मध्यमस्तिष्क में स्थित एक क्षेत्र है। डोपामाइन की कमी के कारण विशिष्टएसएन में डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स की हानि मोटर गड़बड़ी पार्किंसंस रोग 32 से पीड़ित रोगियों में मनाया के साथ जुड़ा हुआ है। डोपामिनर्जिक और GABAergic न्यूरॉन्स: nigral सर्किट के दो मुख्य प्रकार की कोशिकाओं से बना है। दिलचस्प बात ये है कि उन्हें न्यूरॉन्स अन्य न्यूरॉन्स से अलग कई विशिष्ट सुविधाओं है। डीए न्यूरॉन्स और कुछ गाबा न्यूरॉन्स का एक बड़ा हिस्सा के अक्षतंतु यह दर्शाता है कि वृक्ष के समान कुंज विषम (अक्षतंतु असर और अक्षतंतु कमी dendrites) 25,26,33 है एक वृक्ष के समान साइट से निकलती है। सोमा के लिए, डेन्ड्राइट से शुरू और अंत में 34 एक्जॉन: इन न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान न्यूरॉन्स के विशिष्ट संगठन में जो जानकारी हस्तांतरण Cajal द्वारा उत्सर्जित गतिशील ध्रुवीकरण का कानून इस प्रकार के साथ इसलिए विरोधाभासों। डीए न्यूरॉन्स भी उनके dendrites 35 से डोपामाइन को रिहा करने, फोड़ गतिविधि 36 और NMDA रिसेप्टर प्लास्टिसिटी 37 उत्पन्न जाना जाता है। dissecइन घटनाओं के tion साइट है जहाँ वे शुरू कर रहे हैं से प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग के बिना मायावी है। सटीक स्थान और आयन चैनल के कार्यात्मक गुण और nigral न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान excitability और जानकारी के हस्तांतरण में उनकी भूमिका के बीच संबंधों में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, सीधे वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग पसंद का तरीका है।
इस रिपोर्ट में एक विस्तृत प्रक्रिया है कि nigral न्यूरॉन्स की dendrites और इसी पोस्ट अस्थायी biocytin लेबलिंग से एकल और दोहरी पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। दैहिक और वृक्ष के समान झिल्ली पट्टी के लिए बुनियादी सिद्धांतों बहुत समान हैं। व्यावहारिक रूप से हालांकि, वृक्ष के समान साइटों से रिकॉर्डिंग दैहिक रिकॉर्डिंग की तुलना में विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता है। सफल वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग स्लाइस, प्रकाशिकी के इष्टतम समायोजन, पैच पिपेट और रिकॉर्डिंग की स्थिरता के कोमल दृष्टिकोण की गुणवत्ता पर भरोसा करते हैं।
इस रिपोर्ट में दोहरी somatodendritic पूरे सेल रिकॉर्डिंग और स्थानीय वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग को लागू करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन है। यह क्रमश: पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षमता के समय पाठ्यक्रम पर आयन चैनल (यानी, मैं ज) के प्रभाव का निर्धारण करने और nigral डीए न्यूरॉन्स की somatodendritic डोमेन साथ आयन चैनल (मैं ज) के वितरण के मानचित्रण, के लिए उपयोगी है। परिणामस्वरूप electrophysiological माप तदर्थ ऊतकरसायनविज्ञान पोस्ट करने के लिए सेल आकृति विज्ञान को ठीक करने के लिए संयुक्त रहे हैं। प्रक्रिया डीए द्रव्य नाइग्रा में स्थित न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए नियुक्त किया गया था, लेकिन पड़ोसी nigral गाबा न्यूरॉन्स, उदर tegmental क्षेत्र दा न्यूरॉन्स या अन्य मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। सभी कदम भी महत्वपूर्ण संशोधनों के बिना nigral न्यूरॉन्स की dendrites में व्यक्त अन्य आयन चैनल की जांच करने के बाद किया जा सकता। पोस्ट अस्थायी दृश्य अक्षतंतु असर के साथ न्यूरॉन्स के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैऐसे nigral न्यूरॉन्स 25,26, हिप्पोकैम्पस Oriens-alveus इन्तेर्नयूरोंस 21 या कुछ सीए 1 पिरामिड न्यूरॉन्स 67 के रूप में dendrites। दिलचस्प है, इस सुविधा को बांटने न्यूरॉन्स अधिक आम की तुलना में आम तौर पर सोचा 67 होने लगते हैं। रूपात्मक विश्लेषण भी इलेक्ट्रोड और अक्षतंतु की सटीक स्थिति का पता चलता है। उत्तरार्द्ध का पता लगाने के अक्षतंतु प्रारंभिक खंड (वोल्टेज gated ना + चैनल या Ankyrin जी) immunohistochemistry 68,69 का उपयोग करने में व्यक्त प्रोटीन की लेबलिंग से अनुकूलित किया जा सकता है।
वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग और बाद में न्यूरोनल लेबलिंग के साथ एकत्र आंकड़ों की विश्वसनीयता सदा ही टुकड़ा गुणवत्ता पर निर्भर करता है। अधिकतम प्रयास इसलिए जरूरत ऊतक के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए लागू किया जाएगा। यह स्लाइस की तैयारी के दौरान स्वस्थ पशुओं, उच्च गुणवत्ता वाले उपकरणों और अभिकर्मकों, ऊतक और बर्फ के ठंडे तापमान के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन की कोमल से निपटने के साथ हासिल की है। स्थिर रिकॉर्डिंग की स्थिति स्वस्थ न्यूरॉन्स के चयन पर भरोसा करते हैं। पूरे सेल मोड में, श्रृंखला प्रतिरोध शुरू में संभव के रूप में के रूप में कम हो सकता है और प्रयोग के दौरान स्थिर बनाए रखा जाना चाहिए। रिकॉर्डिंग की स्थिरता के बहाव और कंपन से रहित उच्च गुणवत्ता manipulators पर आगे निर्भर है। पिपेट धारक के लिए कनेक्शन की जाँच और headstage करने, नियंत्रित कि micromanipulator केबलों सुस्त हैं, तापमान या चरण के आंदोलन में अचानक परिवर्तन से बचने और जोड़तोड़ की व्यवस्था की जाँच: ये perturbations पिपेट स्थिरता के अनुकूलन के द्वारा कम किया जा सकता है। दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए, methylsulfate 13,15,21 intracellular समाधान में शामिल किया गया है, लेकिन gluconate 9,14,25 वैकल्पिक रूप से नियोजित किया जा सकता है। हालांकि, मुख्य आयनों झिल्ली क्षमता 70,71 और कुछ वोल्टेज पर निर्भर धाराओं 72 को बदल सकता है। Intracellular समाधान एटीपी, जीटीपी और physiolo संरक्षित करने के लिए phosphocreatine के साथ पूरक हो सकता हैन्यूरॉन्स की gical कार्य करता है। इसके अतिरिक्त, पिपेट समाधान में एक फ्लोरोसेंट रंजक जोड़ने (जैसे, एलेक्सा 594 या 101 Sulforhodamine 41) dendrites एक दैहिक रिकॉर्डिंग के दौरान कल्पना करने के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए एक दबाव आवेदन करने के लिए जगह के लिए (Ref में चित्रा 7। 41) या एक बिजली के उत्तेजक पिपेट। सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए पिपेट समाधान बड़े मैं ज रिकॉर्ड करने के लिए एक उच्च + K एकाग्रता और कोई ना + शामिल हैं। उल्लेखनीय ना + / + K एकाग्रता अनुपात वर्तमान आयाम 10, मौजूदा 11 के पलटने की क्षमता है और मैं ज 73 के gating प्रभावित करती है। वैकल्पिक रूप से, मैं ज भी बाहर बहिष्कार 10 का उपयोग कर दर्ज की जा सकती है। इस रिकॉर्डिंग विन्यास में हालांकि, चैनलों की निकटता में intracellular परिवेश परेशान किया जा सकता है। नतीजतन, मैं का वोल्टेज पर निर्भर सक्रियण में मतभेद <उप> ज मनाया जाता है जब तुलना की धाराओं सेल संलग्न पैच और बाहर बहिष्कार 10 का उपयोग कर प्राप्त की। न्यूरॉन्स की सूजन कभी कभी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान सामना करना पड़ा है, और अक्सर इस तरह के कम समाधान की संरचना में परासारिता में पानी की गुणवत्ता, मजबूत असंतुलन या अंतर और बाह्य समाधान 39 या त्रुटियों के बीच पीएच के रूप में अलग कारणों से उत्पन्न होती है। electrophysiological रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता बरामद न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान की गुणवत्ता पर सीधा घटना है। Intracellular परिवेश 14 के कमजोर पड़ने कम करने के लिए सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के बाद – (10 MΩ Refs में 6,11 के रूप में। 6) और एकल दैहिक रिकॉर्डिंग के लिए उच्च प्रतिरोध दैहिक pipettes दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है। इसलिए पूरे सेल दैहिक रिकॉर्डिंग सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के बाद कम (<10 मिनट) रखा है। दोनों दैहिक और वृक्ष के समान pipettes से बाहर-बाहर पैच ग के समुचित बंद करने के लिए आवश्यक हैंपक्ष झिल्ली और सेल आकृति विज्ञान के बाद वसूली। सेल की संरचना के अलावा, नयूरोचेमिकल सामग्री दर्ज न्यूरॉन्स 59,74 के लिए निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, intracellular प्रोटीन tyrosine hydroxylase दा न्यूरॉन्स 13 की स्पष्ट पहचान के लिए immunolabeled जा सकता है।
डीए न्यूरॉन्स मुख्य रूप से एसएन में केंद्रित कर रहे कॉम्पेक्टा Pars, एक बहुत कम एसएन में मौजूद घनत्व के साथ रेटिकुलाटा, जहां वे गाबा न्यूरॉन्स 75 के एक उच्च संख्या के साथ intermixed pars। जबकि महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स की सेल शरीर अक्सर गाबा न्यूरॉन्स की तुलना में बड़ा है, आईआर videomicroscopy के साथ इन कोशिकाओं के दृश्य पहचान अनिश्चित और आंशिक रूप से पार्स कॉम्पेक्टा की अस्पष्टता द्वारा रुकावट है। इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए, डीए न्यूरॉन्स की पूर्व चयन न्यूरॉन्स (गु 65 या डैट दा न्यूरॉन्स के लिए, जीएडी की एक विशेष आबादी में एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग से मदद की जा सकती हैगाबा न्यूरॉन्स) और epifluorescence रोशनी के लिए। वैकल्पिक रूप से, एक फ्लोरोसेंट रंजक डेन्ड्राइट के दृश्य की सुविधा के लिए दैहिक इलेक्ट्रोड के समाधान में शामिल किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट सेल की वृद्धि के प्रस्ताव Nipkow कताई डिस्क confocal 14,22,30 या दो photon माइक्रोस्कोपी 7 आईआर क्लब 6 के लिए संयुक्त द्वारा लाया जाता है। कई फायदे डीआईसी की तुलना में क्लब से संबंधित हैं। सबसे पहले, के रूप में डीआईसी प्रिज्म की आवश्यकता नहीं है, आईआर क्लब छवि एक प्रतिदीप्ति छवि 49,52,53,76 से मढ़ा जा सकता है। दूसरा, क्लब photostimulation के साथ और 77 optogenetics जोड़ा जा सकता है।
टुकड़ा तैयारी का एक नुकसान यह न्यूरॉन्स की अखंडता का संरक्षण है। डीए न्यूरॉन्स तीन स्थानिक विमानों 78,79 में उनकी डेन्ड्राइट का विस्तार है और इसलिए वृक्ष के समान डिब्बे की ट्रंकेशन पूरी तरह से स्लाइस 80 में टाला नहीं जा सकता। स्लाइस के उन्मुखीकरण के चुनाव (राज्याभिषेक, क्षैतिज या पैराबाण) एक व्यापार बंद है। तंत्रिका वितरण और प्रयोगात्मक डिजाइन की उत्पत्ति के स्लाइस की सही उन्मुखीकरण चयन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए।
प्रत्यक्ष वृक्ष के समान पट्टी कोशिकाओं के विभिन्न डिब्बों में कार्यात्मक आयन चैनल का वितरण नक्शा करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया है। इसके अलावा, इस तकनीक चैनलों 20 के कार्यात्मक संपत्तियों में परिवर्तनशीलता निर्धारित करने के लिए प्रदान करता है। एक पूरक के रूप स्थान और आयन चैनल का घनत्व प्रकाश और इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी का स्तर 17,23 पर immunohistochemistry का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। यह दृष्टिकोण भी छोटे कैलिबर संरचनाओं जो पैच pipettes के लिए दुर्गम हैं में चैनल घनत्व निर्धारित करने के लिए संभावना प्रदान करता है। हालांकि इन चैनलों पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर दर्ज की गई उन लोगों की तुलना में एक विशिष्ट कार्यात्मक राज्य 24 या यहां तक कि निष्क्रिय में हो सकता है। दोनों तकनीकों इसलिए स्थान और के गुणों की एक पूरी तस्वीर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैंएक विशिष्ट सेलुलर क्षेत्र 17 में आयन चैनल। वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों के विकास के साथ, वोल्टेज इमेजिंग कई स्थानों पर 81 ए पी एस और न्यूरॉन्स में EPSPs के प्रचार-प्रसार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। दोहरी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक विकल्प के रूप में, इस दृष्टिकोण भी पतली डेन्ड्राइट कि पैच pipettes के लिए सुलभ नहीं हैं, लेकिन संकेत और औसत की सटीक अंशांकन की जरूरत के लिए लागू किया जा सकता है।
एसएन और उदर tegmental क्षेत्र में डीए न्यूरॉन्स व्यापक रूप से शारीरिक और pathophysiological संदर्भ में दैहिक रिकॉर्डिंग के माध्यम से जांच कर रहे हैं, वहीं उनकी डेन्ड्राइट के कार्यात्मक गुण दोनों की स्थिति में काफी हद तक अनजान बनी हुई है। डेन्ड्राइट से पट्टी सफलता 13,25,26 के साथ कई समूहों द्वारा nigral डोपामाइन न्यूरॉन्स के लिए लागू किया गया है और पसंद की विधि ये ठीक subcellular संरचनाओं 8 की उत्तेजनीय गुण टुकड़े करना रहता है। वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग एक और अवसर प्रदान करते हैंसामुदायिक दक्षता और synaptic प्रसारण के plasticity और वृक्ष के समान excitability 82,83 के plasticity की जांच करने के लिए।
The authors have nothing to disclose.
मैं confocal खुर्दबीन, दूसरी Axopatch 200B एम्पलीफायर के उपहार के लिए डॉ जैक्स नियत, GIGA-इमेजिंग के साथ सलाह के लिए अपने निरंतर समर्थन के लिए डॉ विन्सेंट Seutin, Christelle Gillissen और उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए लौरेंत Massotte, डीआरएस जीन Defourny और सैंड्रा Ormenese धन्यवाद गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए confocal खुर्दबीन और Imaris सॉफ्टवेयर और डॉ स्टीफन फ्रीमैन साझा करने के लिए मंच। इस काम बेल्जियम एफआरएस से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था – FNRS (U.N002.13 और T.N0015.13) और बेल्जियम के विश्वविद्यालय फाउंडेशन का समर्थन (Publié avec le Concours डी ला Fondation Universitaire de Belgique) के साथ प्रकाशित किया।
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |