Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起は、受信およびシナプス入力、支援活動電位逆伝搬し、神経伝達物質の放出を伝えます。これらの基本的な機能を理解することは、これらのニューロン内の情報伝達に光を当てるます。樹状パッチクランプ記録は、直接樹状突起とその下の電位依存性イオンチャネルの電気的特性を検査する可能性を提供します。しかし、これらの微細構造は、その小径のパッチピペットへ簡単にアクセスすることはできません。このレポートでは、急性スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からの安定した信頼性の高い記録を収集するためのステップバイステップの手順を説明します。電気生理学的測定は、細胞形態の事後回復と組み合わされます。成功した実験は、スライス、ソリューションおよびピペットの改善された準備、記録された構造と接触しているピペットの光学系と安定性の十分な調整に依存しています。ソムの標準原則ATICパッチクランプ記録は、樹状突起ではなくピペットの穏やかなアプローチが印加されています。これらの用途の広い技術は、樹状突起の興奮特性に関する様々な問題に対処するために実装することができます。
ニューロンは、それらの樹状突起に主にシナプスの情報を受け取ります。興奮性と抑制性シナプスの信号が活動電位(APは)出力信号として誘発された組み込み部位に世代の自分のサイトから広がりました。その途中で、シナプス電位は、樹状突起の構造およびパッシブとアクティブの膜特性の間の相互作用の両方の影響を受けています。これらの高度に可変パラメータの組み合わせは、ニューロン1,2の計算能力を広げます。しかし、樹状突起の小さい直径は、その電気的特性が研究を妨げます。 6,7の樹状突起- (3ミクロンのØ0.7)パッチクランプ法3の継続的な開発は、過去数十年の間に光学系4とスライス標本5のための方法の改良は、非常に薄いからの録音を有効にしています。これらの方法はあった、と、まだ大部分は様々なOで樹状突起の興奮性を調べるために使用されていますFニューロン8。直接の樹状記録は配布9-19と明確な神経区画におけるイオンチャネルの機能特性20-22の相違を決定するために必須です。これらのデータは、光と電子顕微鏡23,24に合わせた免疫組織化学で検出されたイオンチャネルの分布の必要な補数です。デュアル細胞体樹状突起の録音は、詳細な受動的なケーブルモデルを得る、活動電位の伝播9,13-15,21,22,25-27およびシナプス電位のニューロンの細胞体樹状突起ドメインに沿っ13,16,18を拡散を探索するために実装されました28- 30およびニューロンの統合31の時間分解能を調査します。
黒質(SN)は、このような運動の制御など、いくつかの機能に関与する中脳に位置する領域、報酬や習慣的な行動の符号化です。特定によるドーパミンの減少SN中のドーパミン作動性(DA)ニューロンの損失は、パーキンソン病を患っている32人の患者において観察される運動障害と関連しています。ドーパミン作動性及びGABA作動性ニューロン:黒質回路は、2つの主要な細胞型で構成されています。興味深いことに、これらのニューロンは他のニューロンからそれらを区別するいくつかの特定の機能を持っています。 DAニューロンの大部分と、いくつかのGABAニューロンの軸索は樹状突起樹は25,26,33(軸索軸受と軸索欠けている樹状突起)不均一であることを示す樹状サイトに由来します。これらのニューロンの形態は、ニューロンの典型的な組織で、したがって対照的情報伝達はカハールによって放出された動的分極の法則に従うする:樹状突起から、ソーマに、最終的に軸索34に始まります。 DAニューロンは、また、それらの樹状突起35からドーパミンを放出バースト活動36とNMDA受容可塑性37を生成することが知られています。 dissecこれらの現象の化は、それらが開始されているサイトからの直接録音することなく、とらえどころのないです。正確な位置とイオンチャネルの機能特性と黒質ニューロンにおける樹状突起の興奮や情報伝達における役割との関係への洞察を得るために、直接樹状記録が選択される方法です。
このレポートでは、黒質神経細胞の樹状突起と対応する事後ビオサイチンラベリングから、シングルおよびデュアルパッチクランプ記録を得るために使用できる詳細な手順を説明します。体細胞と樹状突起膜にパッチを適用するための基本的な原則は非常に似ています。実際にしかし、樹状の部位からの記録は、体細胞の録音と比較して、特定の最適化を必要とします。成功した樹状記録はスライス、光学系の最適調整、録音のパッチピペットと安定性の穏やかなアプローチの品質に依存しています。
このレポートでは、二重の細胞体樹状突起細胞全体のレコーディングや地元の樹状突起の録音を実現するためのステップバイステップのプロトコルを記述しています。これは、シナプス後電位の時間経過にイオンチャネルの影響( すなわち、I h)を決定し、それぞれ、黒質DAニューロンの細胞体樹状突起ドメインに沿ってイオンチャネル(I hの )の分布をマッピングするために有用です。得られた電気生理学的測定は、細胞の形態を回復するためにアドホック組織化学を投稿するために組み合わされます。手順は、腹側被蓋領域DAニューロンまたは他の中脳ニューロンは、黒質に位置するDAニューロンを研究するために使用されたが、隣接する黒質GABAニューロンのために一般化することができます。すべてのステップはまた、重要な変更を加えることなく、黒質ニューロンの樹状突起で発現される他のイオンチャネルを調べるために続くことができる。 事後可視化は、軸索ベアリングとニューロンのために特に適切ですこのような黒質ニューロンのような樹状突起、25,26、海馬oriens-白板の介在ニューロン21またはいくつかのCA1錐体ニューロン67。興味深いことに、この機能を共有するニューロンは、一般的に67考えられていたよりも一般的であるように見えます。形態素解析は、電極と軸索の正確な位置を明らかにする。後者の検出は、免疫組織化学68,69を使用して軸索最初のセグメント(電位依存性Na +チャネルまたはアンキリンG)で発現されたタンパク質を標識によって最適化することができます。
樹状記録とその後の神経細胞のラベリングで収集されたデータの信頼性は、常にスライスの品質に依存します。最大限の努力は、したがって、組織内の細胞の生存率を維持するために適用する必要があります。これは、スライスの準備を通して健康な動物、高品質のツールおよび試薬の穏やかな取り扱い、組織や氷冷温度の十分な酸素を用いて達成されます。安定した記録条件は、健康なニューロンの選択に依存しています。全細胞モードでは、直列抵抗は、最初はできるだけ低くあるべきであり、実験中一定に維持しました。録音の安定性は、ドリフトや振動を欠いている高品質のマニピュレータにさらに依存します。ピペットホルダとの接続を確認し、ヘッドステージには、マイクロマニピュレータケーブルが緩みであることを制御する、温度またはステージ移動の急激な変化を回避し、マニピュレータの機構を確認これらの摂動は、ピペットの安定性を最適化することによって低減することができます。デュアル記録のために、メチル13,15,21は、細胞内液に含まれているが、グルコン酸9,14,25は、代わりに使用することができます。しかし、主な陰イオンは、70,71、膜電位およびいくつかの電圧依存電流72を変更することができます。細胞内液はphysioloを維持するためにATP、GTPおよびクレアチンリン酸を補充することができますニューロンの外科用機能。また、体細胞記録中の樹状突起を可視化するためのピペット溶液( 例えば 、アレクサ594またはスルホローダミン101 41)内の蛍光色素を添加すると、圧力アプリケーションを配置するには、インスタンスのために有用であることができる(参考文献中の図7。41)または電気刺激ピペット。細胞接着型の記録のためのピペット溶液は、大規模な私の 時間を記録するために、高K +濃度となしのNa +が含まれています 。注目に値するのNa + / K +濃度比は、電流振幅10、現在11の逆転電位とI hの 73のゲーティングに影響を与えます。あるいは、I Hはまた、外部アウト10を用いて記録することができます。しかし、この記録構成では、チャネルの近傍の細胞内環境を摂動することができます。その結果、Iの電圧依存性活性化の違い<比較電流がセル付きパッチと外側アウト10を用いて得られたときに、サブ> Hが観察されます。神経細胞の膨潤が時折パッチクランプ記録中に発生した、と多くの場合、そのような溶液の組成の溶液39またはエラー細胞内および細胞外の間の水の低品質、強力な不均衡浸透圧やpHが明確な原因から生じるされます。電気生理学的記録の品質が回復したニューロンの形態の品質に直接入射しています。細胞内環境14の希釈を最小限にするために細胞接着型の録音後- (参考文献で6,11として、10MΩ。6)と、単一の体細胞の録音のために高抵抗体細胞ピペットは、二重の録画に使用されています。細胞接着型の記録以下の全細胞体細胞記録は、したがって、短い(<10分)に維持されます。体細胞および樹状ピペットの両方からアウトサイドアウトのパッチは、cの適切な閉鎖のために不可欠ですエル膜および細胞形態のその後の回復。セルの構成に加えて、神経化学的コンテンツが記録されたニューロン59,74のために決定されてもよいです。例えば、細胞内タンパク質のチロシンヒドロキシラーゼは、DAニューロン13の明確な識別のために免疫標識することができます。
DAニューロンは、SNに主に集中しているSNに存在するはるかに低い密度で、緻密部は、それらがGABAニューロン75のより多くの数と混合された網様を、扁平部。 DAニューロンの細胞体は、GABAニューロンよりもしばしば大きいが、IR-ビデオ顕微鏡でこれらの細胞の視覚的同定が不明と部分的に緻密部の不透明性により妨げられます。これらの制限を回避するために、DAニューロンの事前選択は、DAニューロンのための神経細胞(TH 65 DATの特定の集団における蛍光マーカーを発現するトランスジェニックマウスを使用することによって促進することができる、GADGABAニューロン)と落射蛍光照明用。あるいは、蛍光色素は、樹状突起の可視化を容易にするために、体の電極の液に含まれてもよいです。蛍光細胞の増加解像度はニポースピニングディスク共焦点14,22,30またはIR-DGC 6に合わせた2光子顕微鏡7によってもたらされます。いくつかの利点がDICと比較してDGCに関連しています。 DICプリズムが必要とされないように、まず、IR-DGC画像は蛍光画像49,52,53,76と重ね合わせることができます。第二に、DGCは、光刺激とし、77光遺伝学組み合わせることができます。
スライス標本の欠点は、ニューロンの完全性の維持です。 DAニューロンは、3つの空間の平面78,79に彼らの樹状突起を伸ばすため、樹枝状の区画の切り捨ては完全にスライス80で回避することはできません。スライスの向きの選択(冠状、水平またはパラ)サジタルトレードオフがあります。神経支配と実験デザインの起源は、スライスの右方向を選択するために考慮しなければなりません。
直接樹状パッチは、細胞の異なるコンパートメントにおける機能的イオンチャネルの分布をマッピングするために使用される技術です。また、この技術は、チャネル20の機能的特性の変動を決定するために提供しています。補体のイオンチャネルの位置および密度は、光及び電子顕微鏡レベル17,23で免疫組織化学を使用して確認することができます。このアプローチは、パッチピペットにアクセスできない小口径構造におけるチャネル密度を決定する可能性を提供しています。しかし、これらのチャネルは、パッチクランプ技術を使用して記録したものと比較して異なる機能状態24、あるいは非アクティブになることがあります。両方の技術は、場所との特性の全体像を取得することが必要です特定の細胞領域17におけるイオンチャネル。電位感受性色素の開発と、電圧画像化は、複数の位置81でのニューロンのAPとEPSPSが増殖を調べるために使用されています。デュアルパッチクランプ記録の代わりに、このアプローチはあってもパッチピペットにアクセスすることはできませんが、信号と平均の正確なキャリブレーションを必要と薄いデンドライトのために実施することができます。
SNと腹側被蓋領域におけるDAニューロンが広く生理学的および病態生理学的文脈における体細胞の録音を経由して調査しているが、それらの樹状突起の機能特性は、両方の条件で大部分が未知のままです。樹状突起からパッチ適用は成功13,25,26といくつかのグループによって黒質ドーパミンニューロンのために実装されており、これらの微細な細胞内構造8の興奮性の特性を分析するための最適な方法のままされています。樹状録音はさらにopportuを提供します無限大は、効率性とシナプス伝達の可塑性と樹状突起の興奮82,83の可塑性を精査します。
The authors have nothing to disclose.
私は2番目のAxopatch 200B増幅器の贈り物、GIGA-イメージングのための共焦点顕微鏡とのアドバイスのための優れた技術支援、博士ジャンDefournyとサンドラOrmenese、博士ジャック命運を決めるための彼の一定の支援、のChristelle GillissenとローランMassotteのために博士ヴィンセントSeutinに感謝します批判的に原稿を読み取るための共焦点顕微鏡とIMARISソフトウェアおよび博士スティーブン・フリーマンを共有するためのプラットフォーム。この作品は、ベルギーのFRSからの助成金によってサポートされていました – FNRS(U.N002.13とT.N0015.13)とベルギーの大学財団(PubliéAVECル・コンクール・デ・ラ・財団Universitaire・デ・ベルギー)の支援を発表しました。
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |