Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Дендриты дофаминергических нейронов получают и передают синаптическую вход, поддержка потенциала действия обратного распространения и высвобождения нейромедиаторов. Понимание этих основных функций будет пролить свет на передачу информации в этих нейронов. Дендритные записи патч-зажим обеспечивают возможность непосредственного изучения электрических свойств дендритов и лежащих в основе напряжения закрытого ионных каналов. Тем не менее, эти тонкие структуры не являются легко доступными для патч-пипеток из-за их малого диаметра. В настоящем докладе описывается процедура шаг за шагом собрать стабильные и надежные записи из дендритов дофаминергических нейронов в острых срезов. Электрофизиологические измерения объединены с постфактум восстановлением морфологии клеток. Успешные эксперименты опираются на повышении качества подготовки срезов, растворов и пипеток, адекватной регулировки оптики и стабильности пипетке в контакте с записанной структурой. Стандартные принципы сомаА.Т.И.Ц. записи патч-зажим применяются к дендритов, но с более мягким подходом пипетку. Эти универсальные методы могут быть реализованы для решения различных вопросов, касающихся возбудимых свойств дендритов.
Нейроны получают синаптическую информацию преимущественно на их дендритов. Возбуждающие и тормозные синаптические сигналы распространяются от их места производства к месту интеграции, где потенциалы действия (AP) вызываются в качестве выходного сигнала. На их пути, синаптические потенциалы влияют как структуры дендритов и взаимодействия между пассивными и активными свойствами мембраны. Сочетание этих параметров сильно изменяющимися расширяет вычислительные мощности нейронов 1,2. Тем не менее, малый диаметр дендритов мешает однако исследование их электрических свойств. Непрерывное развитие техники патч-зажим 3, оптика 4 и уточнение способов получения срезов 5 в течение последних десятилетий позволили записи с очень тонким (0,7 – 3 мкм Ø) дендриты 6,7. Эти методы были, и, по-прежнему в основном используются для изучения возбудимость дендритов в различных OF нейроны 8. Прямые дендритные записи имеют важное значение для определения распределения 9-19 и различия в функциональных свойствах 20-22 ионных каналов в различных нейрональных отсеков. Эти данные являются необходимым дополнением распределений каналов ионов , обнаруженных с помощью иммуногистохимии в сочетании с легкой и электронной микроскопии 23,24. Двойные somatodendritic записи были реализованы для изучения распространения потенциалов действия 9,13-15,21,22,25-27 и расширяющих синаптических потенциалов 13,16,18 вдоль somatodendritic области нейронов, получить детальные пассивные модели кабельных 28- 30 и исследовать временное разрешение нейрональной интеграции 31.
Черной субстанции (SN) является область, расположенная в среднем мозге, участвующих в нескольких функций, таких как контроль движения, кодирование вознаграждения и привычных форм поведения. Снижение дофамина в связи с особенностямипотеря дофаминергических (DA) нейронов в SN связано с двигательных нарушений , наблюдаемых у пациентов , страдающих болезнью Паркинсона 32. Черной субстанции схема состоит из двух основных типов клеток: дофаминергические и ГАМКергических нейронов. Интересно, что эти нейроны имеют ряд специфических особенностей, которые отличают их от других нейронов. Аксон большой долей DA нейронов и некоторых ГАМК нейронов происходит от дендритной сайта , указывая , что дендритов неоднородна (аксонов несущих и аксонов-дендриты отсутствуют) 25,26,33. Морфология этих нейронов контрастирует поэтому с типичной организации нейронов , в которых передача информации следует закон динамической поляризации испускаемого Кахалем: начиная от дендритов к соме и , наконец , к аксона 34. DA нейроны также известно, высвобождение дофамина из своих дендритов 35, генерируют разрывной активность 36 и NMDA-рецептор пластичностью 37. dissecние этих явлений неуловим без прямых записей с того места, где они зарождаются. Для того, чтобы получить представление о взаимосвязи между точным местоположением и функциональных свойств ионных каналов и их роли в дендритных возбудимости и передачи информации в нигральных нейронов, прямые дендритные записи являются методом выбора.
В этом докладе описывается подробная процедура , которая может быть использована для получения одно- и двойной записи патч-зажим с дендритах нейронов черной субстанции и соответствующего Постфактум biocytin маркировки. Основные принципы латание соматического и дендритных мембраны очень похожи. Практически, однако, записи с дендритных сайтов требуют специальной оптимизации по сравнению с соматическими записей. Успешные дендритные записи полагаться на качество срезов, оптимальная регулировка оптики, мягкий подход патч пипетку и стабильности записей.
Этот отчет описывает протокол шаг за шагом реализовать двойной somatodendritic записи целых клеток и местных дендритных записи. Это полезно для определения влияния ионных каналов (то есть, я з) о времени хода постсинаптических потенциалов и отображение распределения ионного канала (I ч) вдоль somatodendritic области нигральных нейронов DA соответственно. Полученные в результате электрофизиологические измерения объединены , чтобы постфактум гистохимии для восстановления морфологии клеток. Процедура была использована для исследования да нейронов, расположенных в черном веществе, но могут быть обобщены для соседних нигральных нейронов ГАМК, вентральный тегментальной DA нейронов или других нейронов среднего мозга. Все шаги также можно проследить , чтобы исследовать другие ионные каналы , выраженные в дендритах нейронов нигральных без важных изменений. Постфактум визуализация особенно актуально для нейронов с аксона подшипникедендриты, такие как нигральных нейронов гиппокампа, 25,26 Оринс-ALVEUS интернейронов 21 или некоторых СА1 пирамидальных нейронов 67. Интересно отметить , что нейроны , разделяющие эту функцию , как представляется, более распространены , чем обычно считается 67. Морфологический анализ показывает также точное положение электродов и аксона. Обнаружение последнего может быть оптимизировано с помощью мечения белков , экспрессированных в начальном сегменте аксона (напряжения закрытого Na + каналов или анкириновых г) с использованием иммуногистохимии 68,69.
Достоверность данных, собранных с помощью дендритных записей и последующего нейронного маркировки неизменно зависит от качества среза. Максимальное усилие требует поэтому должны применяться для сохранения жизнеспособности клеток в ткани. Это достигается при осторожном обращении здоровых животных, высококачественных инструментов и реагентов, достаточной оксигенации тканей и ледяной температуры на протяжении подготовки срезов, Стабильные условия съемки зависят от выбора здоровых нейронов. В режиме цельноклеточной, последовательное сопротивление должно сначала быть настолько низким, насколько это возможно, и поддерживается постоянной в течение всего эксперимента. Стабильность записи дополнительно зависит от высококачественных манипуляторов, лишенных дрейфа и колебаний. Эти возмущения могут быть уменьшены за счет оптимизации стабильности пипеток: проверка подключения к держателю пипетки и headstage, что контрольный пакет Микроманипулятор кабели слабину, избегая резких изменений температуры или сценического движения и проверки механизма манипулятора. Для двойной записи, метилсульфат 13,15,21 был включен в внутриклеточном растворе, но в качестве альтернативы глюконат 9,14,25 могут быть использованы. Тем не менее, основной анион может привести к изменению мембранного потенциала 70,71 и некоторые зависящие от напряжения тока 72. Внутриклеточных решение может быть дополнена АТФ, ГТФ и фосфокреатина сохранения physioloмиологических функции нейронов. Кроме того, добавление флуоресцентного красителя в растворе пипеткой (например, Alexa 594 или сульфородамин 101 41) для визуализации дендритов во время соматического записи может быть полезно, например , для размещения приложения давления (рисунок 7 в работе. 41) или электрический стимулирующий пипетка. Раствор пипетка для клеточных подключаемых записей содержит высокую концентрацию К + и Na + не запись больших I H. Обращает на себя внимание отношение концентраций Na + / K + влияет на амплитуда тока 10, обратный потенциал тока 11 и стробирование I ч 73. В качестве альтернативы, I ч также могут быть записаны с помощью снаружи аутов 10. В этой конфигурации записи однако, внутриклеточная среда, в непосредственной близости от каналов может быть возмущенных. Следовательно, различия в напряжении-зависимой активации I <к югу> ч наблюдаемый при сравнении токов , полученных с использованием клеточных подключенных заплаты и снаружи аутов 10. Отек нейронов иногда встречается во время записи патч-зажим, и часто возникает из различных причин , таких как низкое качество воды, сильного дисбаланса в осмолярности или рН между внутри- и внеклеточной решения 39 или ошибки в составе решений. Качество Электрофизиологические записи имеет прямое падение на качество морфологии восстановленных нейронов. Высокое сопротивление соматические пипетки используются для двойных записей (6 – 10 МОм, как и в работах 6,11.) , А также для отдельных соматическими записей после клеточных подключаемых записей , чтобы минимизировать разбавление внутриклеточной среды 14. Цельноклеточная соматическая записи следующие записи клеточного прилагается поэтому хранится короткий (<10 мин). Вне-патчи от как соматические и дендритные пипеток имеют важное значение для надлежащего закрытия CELL мембрана и последующее восстановление морфологии клеток. В дополнение к структуре клетки, нейрохимическое содержание может быть определено для зарегистрированных нейронов 59,74. Например, внутриклеточный белок тирозин гидроксилазы может быть immunolabeled для однозначной идентификации DA нейронов 13.
DA нейроны в основном сосредоточены в SN Парс компактов, с гораздо более низкой плотностью , присутствующей в SN Парс геисиЫа, где они перемешаны с большим числом ГАМК нейронов 75. В то время как тело клетки DA нейронов часто больше, чем у ГАМК-нейронов, визуальной идентификации этих клеток с ИК-видеомикроскопии является неопределенным и частично препятствует непрозрачности Парс компактов. Чтобы обойти эти ограничения, предварительный выбор DA нейронов может быть облегчено за счет использования трансгенных мышей , экспрессирующих флуоресцентный маркер в конкретной популяции нейронов (TH 65 или DAT для DA нейронов, ГТРдля ГАМК нейронов) и эпифлуоресцентной освещения. В качестве альтернативы, флуоресцентный краситель, могут быть включены в раствор соматичекой электрода для облегчения визуализации дендритов. Увеличенное разрешение флуоресцентного клетки вносят Nipkow вращающийся диск конфокальной 14,22,30 или двухфотонной микроскопии 7 в сочетании с ИК-6 DGC. Несколько преимуществ связаны с DGC по сравнению с DIC. Во- первых, как ДИК призм не требуется, изображение ИК-DGC могут быть наложены с 49,52,53,76 флуоресцентного изображения. Во- вторых, РСК может быть объединен с фотостимуляцией и оптогенетика 77.
Недостатком препарата ломтика является сохранение целостности нейронов. DA нейроны расширяют свои дендриты в трех пространственных плоскостях 78,79 и поэтому укорочение дендритов отсека не может быть полностью избежать в срезах 80. Выбор ориентации срезов (корональные, горизонтальный или парасагиттальный) является компромиссом. Происхождение иннервации и опытно-конструкторских необходимо учитывать, чтобы выбрать правильную ориентацию срезов.
Прямой дендритных латание это метод, используемый для картирования распределения функциональных ионных каналов в разных отсеках ячеек. Кроме того, этот метод предлагает определить изменчивость функциональных свойств каналов 20. В качестве дополнения расположение и плотность ионных каналов можно определить с помощью иммуногистохимии на уровне 17,23 световой и электронной микроскопии. Этот подход также дает возможность определить плотность каналов в малых калибров структур, которые недоступны для патч-пипеток. Однако эти каналы могут быть в отдельном функциональном состоянии 24 или даже неактивного по сравнению с теми , записанные с использованием методов патч-зажим. Оба метода Поэтому необходимо, чтобы получить полное представление о местоположении и свойствахионных каналов в конкретной сотовой зоне 17. С развитием напряжения чувствительных красителей, визуализация напряжения использовалась для изучения распространения точек доступа и ВПСП в нейронах в нескольких местах 81. В качестве альтернативы двойной записи патч-зажим, этот подход может даже быть реализован для тонких дендритов, которые не доступны для патч-пипеток, но вызывают необходимость точной калибровки сигнала и усреднения.
В то время как DA нейронов в SN и вентральной области покрышки широко исследованы с помощью соматической записей в физиологической и патофизиологической контексте, функциональные свойства их дендритов остается в значительной степени неизвестны в обоих условиях. Заделка от дендритов была реализована для нигральных нейронов допамина несколькими группами с успехом 13,25,26 и остается методом выбора рассекать возбудимых свойств этих тонких субклеточных структур 8. Дендритные записей обеспечивают дальнейшее возщества тщательно исследовать эффективность и пластичность синаптической передачи и пластичности дендритов возбудимости 82,83.
The authors have nothing to disclose.
Благодарю д-ра Винсента Seutin за постоянную поддержку, Кристель Gillissen и Лоран Massotte за отличную техническую помощь, д-ра Жан Defourny и Сандра Ormenese для советов с конфокальной микроскопии, д-р Жак Направляемся за дар второго усилителя Axopatch 200В, Giga-изображений платформой для обмена конфокальной микроскопии и программного обеспечения Imaris и д-р Стивен Фриман для критически чтении рукописи. Эта работа была поддержана грантами от бельгийской FRS – FNRS (U.N002.13 и T.N0015.13) и издана при поддержке Фонда университета бельгийского (Publié АВЭК ле Concours де ла Fondation Университетский де Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |