Summary
有组织的脑切削程序是必要的,以与确定的神经病理学诊断特定神经精神现象相关。脑屑基于各种临床 - 学术突发不同的方式执行。本协议描述的对称bihemispheric脑部切割程序,调查人的大脑半球病变差异,以最大限度地提高当前和未来的生物分子/神经影像学技术。
Abstract
Neuropathologists,有时感到生成在人脑尸检要求的患者描述复杂的神经精神现象,明确的诊断所需要的知识量吓倒。尽管生物医学影像学和的进步已经彻底改变了神经精神领域,他们也产生了误导性的想法,大脑解剖只有一个确定的值。这个假想法在尸检速率的急剧减少,因此,降低的可能性进行更详细的和广泛的神经病理调查,这是必要的,以理解众多正常和病理方面未知的人脑。观察神经精神现象及其可能的相关因素neurohistological相应的本地化/特性之间的相关传统推理方法继续有一个不可否认的价值。在neuropsychi的上下文atric疾病,传统的临床方法仍是最好的可能的方法(通常是唯一可用的),以唯一的神经精神功能链接到其相应的神经病理学基材,因为它在脑组织中的直接身体评估特别依赖。死后大脑的评估是基于大脑切割跨越不同的神经病理学变化中心的程序。脑屑基于存在于每个机构的各种临床和学术突发相对广泛和系统的方式进行。更解剖学包容性和对称双向大脑半球切割的方法至少应该用于研究目的的人类神经病理学连贯调查,深入,与人脑( 即半球专业化和偏侧特定的特殊性正常和病理条件功能)。这种方法将提供更全面的科尔神经病理良好的特点适用于当前和未来的生物科技和神经成像技术的大脑ction。我们描述了在人类大脑半球病变的差异进行调查并与目前使用的以及未来的生物分子/神经影像学技术的对称双大脑半球切割程序。
Introduction
Neuropathologists有科学的特权,智力的荣誉和诊断义务评估人类大脑。几十年来,脑部疾病和重大努力的详细的临床描述,以个体化在人死后的大脑其可能neurohistological相关因素已经开展。从历史上看,这些努力所代表的最有成效的方式由医学科学和神经学尤其是在当今时代先进。由于以前的杰出neuropathologists和他们的奉献精神,决心,奖学金,惊人的能力,以正常和异常的脑组织(通常使用非常残留的工具)之间的区别,我们现在可以研究和目标疾病,如阿尔茨海默Perusini病(不公平只被称为阿尔茨海默氏症病; APD / AD)1,帕金森病(PD)2,克雅氏病(CJD)3,娄格里克病/肌萎缩侧索SclerosiS(ALS)4,和关岛病5,仅举几例。
神经影像学的先进的技术,如高清晰计算机断层扫描( 即多层螺旋CT扫描,CT血管造影),功能和形态磁共振成像( 即功能磁共振成像,弥散核磁共振成像,示踪-MRI 等 ),正电子发射断层扫描(PET),基于超声波的成像,等人,都肯定是我们修改关于如何诊断和治疗神经和精神病患者一般做法。尽管如此,虽然神经成像技术能够可视化的人的大脑时活着,他们不提供的机会,在发生的时刻,直接分析细胞,如神经元的高度复杂的细胞和亚细胞结构的;或可视化,标记和量化特定类型的细胞内病变;或精确显示他们的神经解剖学和次区域定位在circuital和分circuital解剖层次。例如,神经成像技术不能在嗅皮层识别或定位在黑质(SN),与帕金森病相关的一个共同的病理学特征,或神经原纤维缠结(NFT)的色素神经元Lewy小体(LB),AD的经典特征和其他脑病变。神经病理学的调查与先进的数码显微镜相结合仍然是不可替代的详细的临床相关性,因此,为明确诊断。
由于人脑的特有anatomo功能特性,特别是它的解剖定位(即,颅骨,天然保护系统,该系统不允许内容的直接检查内部),引入体内神经成像技术非常有帮助临床医生和调查人员发现最初的解答一些这种复杂组织的奥秘。然而,没有临床或neuroimagiNG的方法,可替换的独特的机会,脑组织尸检过程中直接分析。仅有组织收集,保存,和人脑的分类可允许神经元和非神经元细胞,亚细胞成分,细胞内和细胞外的病理病变直接与系统的调查,而大脑内的任何类型的异常进行确认,修改,或重新定义临床诊断和发现新的临床相关性。之一有关的大脑尸检评估表观限制一直是事实,这过程是一个剖方法论。总会有一个持续的神经病理过程(临床表现或不)和机会,如果有的话,在neurohistological级别来定义它之间的延迟。这主要是由于人的大脑没有能力再生本身。它目前还无法获得的脑组织在体内 ,而无需创建PErmanent伤害。因此,是不可能在纵向和神经病理学评估相同的大脑/人。然而,标准化的大脑银行程序和脑捐赠广大市民日益认识到可以极大地持续增加收集和分析案件的数量有助于脑尸检时序问题的解决。以这种方式,可以得到死后的大脑的更充分的数字,以定义病理起源和进展的恒定模式与每个人脑疾病相关的脑损伤的每个特定类型。这将需要从受任何神经精神障碍的患者在所有年龄捐献和尽可能多的大脑尽可能收集,以及来自健康对照受试者。一个可能的方法可以从一般和专门的医疗中心作为一个标准的程序中收集尽可能多的尸检大脑越好。需要对脑捐赠最近已表示那些谁研究老年痴呆症和正常老化6。相同的必要性应由神经字段作为整体来表示。
用于上述和其他原因,正在进行的脑切割程序的更新是必要的。此外,脑切割程序应普遍在不同的神经病理学的研究中心标准化在世界各地,也考虑帐户的可能性聘请当前和未来的生物技术,以更好地调查,并希望能以明确理解的原因和脑部疾病的机制人类。
在这里,主要用于研究目的,我们描述了死后的大脑在人类切对称方法。此过程提出收集比正常完成,并从两个大脑和小脑半球更多脑区。对称双大脑半球切割过程将符合我们当前的人类知识好得多神经解剖学,神经化学,神经生理学和。这种方法还允许的可能性神经病理学分析人类大脑的独特功能,诸如半球专业化和偏侧是与较高的认知和非认知功能一般或专门存在于我们的物种相关联。是否有半球专业化/偏侧和特定类型的脑病变之间的具体发病的关系,或一种特殊的神经精神病发病事件是否是最初,普遍地,或只与特定的半球关联和功能不是目前公知的。通过描述这种大脑对称切割程序,我们的目标是提出人类大脑解剖的更新方法,可以帮助更好地了解一个高度专业化的正常组织和病理条件下,大脑。该方法还考虑到,只存在于人类的那些吗啉官能半球方面。
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Protocol
涉及死后人体组织程序已被机构审查委员会审查,并在45 CFR(联邦法规)豁免。
注:本协议描述了完成在人类神经病理学研究死后的大脑评估对称bihemispheric脑部切割程序。的装置,仪器,材料和必要执行人类大脑切割建筑材料的详细描述将被排除。对于脑解剖材料和用品在单研究者决定被选择并且是基于允许或在各研究机构批准尸检工具。集此过程所需的工具和材料最小的材料/设备表中描述。具体切割程序和疑似传染性脑疾病,如人类克雅氏病的预防措施,是这个手稿的目标之外,并从其他来源获得7。
1.对称双大脑半球切割
注意:确保大脑已经接收了必要的组织固定(使用,例如,中性缓冲的10%福尔马林),为期两到三周的,这取决于periagonal,代谢( 即,pH值),和组织保存( 即,温度)的条件。然而,对于成像病理学相关研究,固定的周期较长(>5.4周)已建议8。
- 放置在面向研究者平坦表面脑,与朝向相反的方向相对于所述研究者的正面极。
- 将这样的方式大脑以允许所有皮质脑回和整个大脑( 图1a)的沟的完整和清晰的可视化。
- 先来说一下脑膜异常,宏观半球不对称性(焦点,叶,或萎缩的广义半球现象可能的指标),宏观tissutal病变( 即吐沫RS或症),先天性畸形,脉管异常,以及任何其他可能的异常或脑表面的不寻常的演示。
注:有关如何评估一个人的大脑的详细说明,请参阅市售的神经病理学教科书和尸检手册9,10。
2.协议序列
- 面对正面极点从调查路程,半球(端脑)所面临的研究者肤浅的方面。多少就拿多少数码照片根据需要在每一个特定的情况下记录可能的宏观异常现象,并考虑到可能的临床 - 神经解剖和切割后的注意事项。有一个研究助理拿数码照片垂直于大脑捕捉整个皮质表面( 图1a - C)。
- 马克前和使用的墨水或彩色针中央后皮质脑回切割前脑( 图1b 注:此过程有利于电机和切割后体感皮层主要的更直接的认识。
- 旋转180度的脑,同时保持其朝向相同的方向(即从研究者背向正面极)。仔细检查大脑底部。要特别注意脑血管系统的条件( 即,基底动脉和椎动脉和Willis环)在其脑干出口/入口水平和颅神经。管理嗅球和大片特别小心,以避免tissutal裂伤,由于他们的极端脆弱性。
- 多少就拿多少数码照片根据需要在每一个特定的情况下记录可能的宏观异常现象,并考虑到可能的临床 - 神经解剖和切割后的注意事项。有一个研究助理拿数码照片垂直于大脑捕捉到皮层和脑干表面的全部。
- 朝向脑的碱和使用手术刀,剪在脑桥的上部的水平脑干横向(尽可能接近到大脑的碱)。仔细检查SN( 即 ,为苍白)11和其他邻近结构12。需注意,可能相比于正常脑13用脑的任何不寻常的外观的音频记录装置中,。
- 再次旋转180度脑并用一把锋利的刀,通过集中切断胼胝体通过内侧纵裂缝,并遵循额枕部方向的两个半球分开。检查每个半球为可能的异常( 例如,心室扩印,畸形,组织软化,肿瘤等 )13的每一侧。参见图2a
- 多少就拿多少数码照片根据需要在每一个特定的情况下记录可能的宏观异常和考虑到可能的临床 - 神经解剖和切割后的注意事项。有一个研究助理拿数码照片垂直于大脑捕捉整个皮质表面。注意到脑的任何不寻常的特点的相比于正常脑。
- 放置两个半球扁平,躺在其内侧方面,朝向从研究者远额叶, 如图2b所示 。将它们放置在这样一种方式,其中心触摸(也标记为半球不对称的情况下)。
- 用一把锋利的刀,手动通过两个大脑半球切开,开始在额极,并通过半球的整个长度走向两极枕部移动。获得两个系列的脑组织1厘米厚的块(约18板为每个半球)。
- 放置脑板坯在一个单独的平面上的解剖学组织(额枕骨方向)序列。使用白色surfa与拍摄时印有更好的对比度尺子CE。显示两个系列脑板坯在解剖学对称方式(额枕方向),确保它们的冠状表面是直接目视和数字摄影( 图3a)中可见。使用两侧印刷毫米波网格切割表面来定位大脑结构,尺寸和可能的异常以更精确的方式。
- 多少就拿多少数码照片根据需要在每一个特定的情况下记录可能的宏观异常现象,并考虑到可能的临床 - 神经解剖和切割后的注意事项。有一个研究助理拿数码照片垂直于大脑捕捉整个皮质表面。记笔记相比于正常脑(可能使用音频记录器设备),大脑中的任何不寻常的方面。
- 用锋利的手术刀,解剖手动较小的矩形块脑组织中的每个建立脑区。按照表1所述建议的脑区域收集方案。
- 放入单独标示histocassettes每个组织块。
注:脑组织中的每块需要被切断,以适应,尽可能,标准histocassette最大体积(30×20×4mm的3)。 - 标签使用每一种情况下的去识别代码和使用特定的神经解剖学标识符histocassettes(不使用随机字母或数字为不同的大脑;相反,始终使用相同的区域的解剖学的名称或相应的数字,如表1所示)。创建去识别码,例如,通过产生随机或半随机数为每一种情况下( 即 ,BRC 130,其中B停留脑,R停留资源,C停留中心和130是一个渐进的加入或AD160001,其中,AD代表“阿尔茨海默氏症研究”,16是年时进行尸体解剖(2016),和0001逐行加入检体数)。
注意:这一步是为未来的研究非常有帮助的;保持一个传奇,并指定半球(L =左脑,R =右半球)。使用histocassettes两种不同颜色,建立为每个半球特定的颜色。 - 多少就拿多少数码照片根据需要在每一个特定的情况下记录可能macroanomalies,并考虑到可能的临床 - 神经解剖和切割后的注意事项。有一个研究助理拿数码照片垂直于大脑捕捉整个皮质表面。注意到脑的任何不寻常的特点的相比于正常脑。
- 放入单独标示histocassettes每个组织块。
- 拍摄数字图片(多达必要或期望的)整个切脑和相关histocassettes的。
- 冲床( 例如,通过的Accu冲)小块组织的DNA提取和遗传分析。使用直径5毫米 - 2一记重拳。
注:对于其高的基因组材料的含量,小脑是首选;然而,任何其他区域是好的。 - 再浸入含有相同类型的先前使用,直到组织处理的下一步骤固定液( 例如,10%的中性缓冲的福尔马林)的脑组织块所有histocassettes。
- 按照人类福尔马林固定,组织处理14的标准程序。
3.特殊的方法:交替冷冻和固定对称Bihemispheric切割
注:在第2描述的对称bihemispheric脑切削协议提供了从未定影,新鲜的大脑切割组织板坯在相同的系统和对称的方式的可能性(当可用时)。
- 将整个大脑清新倒挂(最好在半球碗状的塑料表面)8 - 10分钟,在-80℃冷冻硬化的脑组织withouŧ挑起生化损伤,以方便手动切割。
- 用一把锋利的刀,切两半球在交替和连续的方式,按照第2节中描述的大脑切割协议,但冻结和修复每隔板(由两个半球和沿额枕部解剖方向)。
- 此时,不要试图削减各脑区域,如表1所述。切新鲜的特定脑区仅在必要时立即RNA或蛋白质的提取( 即对基因组或蛋白质组学研究)15。
- 切割后,立即冻结,标签和数量每个新鲜组织。占据整个平板系列数码照片;装在一个塑料袋每个切片;收集在一个单独的,一个脑只容器中的板;和容器存放在专用-80℃冰箱中。
注:冰箱应致力于只有人脑组织。只是后来会唱根据需要为每个特定实验勒冷冻大脑区域进行切割。 - 沉浸选择用于在含有固定剂的足够量(3/1体积固定剂/组织块的比例)分离袋固定(10%的中性缓冲的福尔马林或其他固定剂)每隔其它组织板坯。通过连续编号他们跟着一个额枕部序列标签每袋。密封每个袋,拍摄数字图片,并将它们存储在塑料容器中。
- 2周组织固定后打开含有固定剂袋和如表1中所述切割每个脑区。
4. Histostain及免疫组化
注:本套脑区的切基础上,提出方案( 表1)足以满足大多数,如果不是全部,当前已建立共识为基础的病理标准AD 16,PD 17,路易体痴呆(DLB)18,额颞叶痴呆(FTD / MND) (PSP)20,多系统萎缩(MSA)21,慢性创伤性脑病(CTE)22, 等等 。
- 对于每一个脑区和两个半球,请执行下列最低限度histostains的:苏木和曙红(H&E),甲酚紫(CV;如果形态计量学研究计划,例如),银染色(如“探索性”分析是需要)。
- 对于每一个脑区和两个半球,请执行下列最低限度的免疫组化协议:β淀粉状蛋白(βA),磷酸化头(pTau),磷酸化α突触核蛋白(Pα-SYN)和磷酸化TDP43(pTDP43) ,如上所述14。
注:组织切片,以评估每个脑内此协议的总数为46(如果由两个半球各脑区都可用)。
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Representative Results
协议长度
花为单个对称bihemispheric固定脑切削过程中的时间估计为1小时(不包括花费建立解剖台,工具和切割表面的时间;标签; 等 )。为一个单一的对称双半球交替冻结和固定脑切割过程所需的时间估计需要2小时。它可以至少在4 - 6周获得明确的组织学诊断为单人脑/主题。后从头骨,组织固定的适当时期死后的大脑切除(2 - 3周至少)必须发生。然后,一系列的协议,包括对称bihemispheric脑切割,组织处理,组织包埋,块切片和染色和免疫组化,必须进行。最后,使用共同的每半球各区域的微观评估,nsensus建立病理标准和分类的临床记录进行审查,并可能临床病理的相关性,必须病理结论之前发生。一个完整的人脑病理评估整个时机应规划具体的调查研究时,应慎重考虑。此外,医疗和同事研究调查,捐助者的家庭,法律部门应当通知总时间要求,复杂性和团队时间/精力来获得现代神经病理学评估。
虽然所提出的脑切削协议代表一个费时和具有挑战性的过程,它实际上代表一个科学有益的方法,广泛评估在健康和病理条件下的人的大脑。期间收到的控制/正常人尸检,绞尽脑汁强调的是,往往是很重要的( 即评定为临床或之前死亡的神经功能正常)者实际上可能是找到一个准确的病理评估后,正面的为不同脑病变。这些情况下,表示所谓的无症状和临床前受试者关于各种脑疾病,特别是那些表征年龄相关的神经变性疾病。这突出评估在一个非常广泛和细致的方式接收作为“对照”,特别是用于研究目的的大脑中的重要性。它正变得日益明显的是,人类大脑/受试者症状的或不为神经/精神病症,可以老化23,24期间累积多发性脑的病理(所谓的共同发生的病状)。有趣的是,这些共同发生脑损伤是生物化学的那些相同患者临床上表现疾病发现,在相同的解剖区域是局部的,以及(PARS,ARTAG,推车)25-27。这些MO再最近的调查结果(只能通过尸检调查)有一个非凡的意义,以对人脑老化影响的研究。
表2和图4描述了使用一系列在我们的脑库收集了人类大脑的执行对称双向大脑半球切割过程获得了一些初步的半定量数据。这些初步数据显示,收到的“正常”或“控制”,从年长者实际上不仅积极为βA-神经炎斑块和tau蛋白神经原纤维缠结(tau蛋白NFT),作为已知的28-32,也是最大脑该不溶性βA-神经炎斑的负担相比于同一脑的右内嗅皮质和海马分别在左内嗅皮层和海马更高。脑用CERAD 33评估,并Braak分期34 SYSTEMS,分别评估βA-神经炎斑块和tau蛋白NFT。对于不溶性的β病理观察左半球偏爱也存在,但仅作为相比于右半球的趋势,在大多数左半球的其余区域。这些初步的双半球发现的关联性是所分析的脑均从一个普通人群尸检队列。所有受试者均住院治疗,实际上,对于非神经/精神的原因和在不同的社区综合医院死于非神经系统的原因。该分析大脑分析从专门的神经系统/痴呆中心只有当大脑是从一般人群尸检队列减少选择偏倚可能存在的事实。另见NINDS 6的建议。我们的研究结果是初步的(4出46用“控制”大脑),并确认需要在更大的规模。然而,这些新的发现S,如果得到证实,建议半球偏爱的一个可能的现象AD病理学的积累和发展,或至少β病理。类似类型的病理半球偏好的可能很可能与每个特定类型的神经或神经退行性疾病有关。此外,通过对称双半球大脑切割程序,精确的细胞和病变quantifications( 即 ,无偏体视学)的方法相结合,它可以是可以测量的垂直于病理状况的比率,以及神经元损失的比率来恢复/神经可塑性现象可能存在于相对于人类特定半球和功能。有趣的是,虽然每个主要的脑部病理(β淀粉样,头,LB,TDP43,FUS 等 )半球好发有待建立,脑功能成像34,神经心理学36 P>,和显微解剖分析37,38似乎是与我们的初步结果一致。这进一步加强了对各种不同类型的脑病理及相关疾病的可能半球偏爱的假设。
图1. 初步评估脑脑Bihemispheric切割前。该图显示了人类大脑起两周固定在10%中性缓冲的福尔马林后的各种浅表方面。在顺时针序列中,大脑的优越方面(A,B)是随后在大脑,包括小脑检查(c)中 ,脑干和颅神经(d)和嗅球的底部的观察和束(E)。02 / 54602fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2. Bihemispheric人脑切割。福尔马林固定人脑放置在平坦表面上为眼睛检查(a)中 。红线表示内侧纵裂缝。通过内侧纵裂缝( 二 )中央切断后,大脑两半球的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. Bihemispheric脑切割程序。该图显示了一些步骤在bihemispheric人脑切割协议。所有的大脑板(两半球)的部署和承接额枕部方向( 一 ),建立各脑区来收集( 表1)后,将在组织块切配合标准histocassette尺寸(B - E)。小脑组织块将需要更大的histocassettes(见绿[右侧小脑半球]和蓝[左小脑半球]; e和f)。白盒是用于中间结构,如延髓,脊髓等 。 ( 五-克 )。所述bihemispheric人脑切削协议和从表1中所列的每个神经解剖学区域含有脑组织块后得到的最终histocassettes重新浸渍在相同的初始类型固定液(10%的中性缓冲的福尔马林)(F -克 )。tp_upload / 54602 / 54602fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图 4. 每个大脑半球彩色组织切片不同的抗原免疫组化。 (A)中该图表示从同一人的大脑的两个半球的一系列组织切片。每个系列的双半球切片进行免疫染色对β淀粉样蛋白,磷酸化的tau和磷酸化α突触核蛋白(α-SYN),其阳性与共同年龄相关的神经变性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏相关联。的图像显示部分的可能的总量的代表例使用所提出的双半球对称脑切削协议分析。 LH =左脑半球,RH =右半球。 ( B)的这些图像显示共同年龄相关的脑部病变的样品,如使用特异性免疫协议β淀粉样神经炎斑,tau蛋白神经原纤维缠结,α突触核蛋白(α-顺)阳性路易体后在显微镜下观察。在各图像的右下角是使用(5X,20X,和40X)放大并准确地识别不同类型病灶的目的的类型。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1. Bihemispheric切割方案。该表格示出了单个的解剖区域中都各大脑的左和右半球解剖。该bihemispheric对称切割可以在新鲜和固定的大脑来完成。rce.jove.com/files/ftp_upload/54602/54602table1.xlsx">Please~~MD~~aux点击这里下载该文件。
获得通过Bihemispheric人脑切割表2初步结果 。此表显示从通过临床正常,年长者在四个人类大脑进行bihemispheric对称人类大脑的切割方法得到的初步调查结果。数据显示两个脑区(内嗅皮层和海马)不断地和早期参与β淀粉样神经炎斑和tau-NFT的积累。这种类型的损伤被认为是最可能的致病过程引起的AD。 F =女性; M =男性。括号内的数字代表每个解剖学科的死亡年龄(年)。可能的赫米斯的快速可视化半定量的比色码横跨病变类型,严重程度的水平,不同的年龄较大的受试者中的解剖本地化的pheric差异已被使用。 NEG =阴性(绿色);稀疏= 1 - 2病变(黄色);中等= 3 - 6病变(橙色);频繁=> 6病变(红色)。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
这种脑切断方法可适于对每个神经病理学实验室的特定需求(例如,通过减少脑区域的数量,以评估每个半球),同时仍保留bihemispheric对称切割的步骤,其主要特征之一。此提出的协议可用于常规程序(研究型神经病理学中心)或只在必要时(具体临床取向研究)。它可以选择性地仅用于特定类型的调查( 即,免疫组织化学)或分子分析( 即 ,基因组或蛋白质组分析)。从技术角度来看,它是有用提及某些病理差异(特别是在免疫组织化学)可能是由于在immunohistostaining强度可能人为的变化。这些可以通过利用自动染色机,这大大减少人为的染色效果的可能性被最小化次变化。它是目前可能的,事实上,通过使用可靠机器人染色机技术减少大部分由于技术工件混杂因素。因此,比较的结果可以评估时得到,例如,从相同受试者,或多组来自多个受试者两个半球两个大脑半球。
此外,在过去的几年中,脑部病变在人类大脑识别的人数已大大增加39。这些新类型的脑损伤的产生增加风险分类为正常或控制以前的大脑其实并不。免疫组化技术和新的病理发现的改善建议以前存入银行,因为所有的大脑的智慧和定期评估“控制”,因为“伪控制”或“假控”的情况下,大脑总是可能的40。
的主要限制此方法包括的时间和专业知识(解剖学和病理学知识)需要执行它的量。此外,研究旨在分析人类大脑的基因组和蛋白质组方面的必要脑银行团队,随时准备进行管理,以快速的方式,所有的大脑捐献手续,法律同意的安排,脑清除,并冻结或固定程序直接切割。通常情况下,这些设施和人员只能在专门的学术或研究中心提供。此外,虽然详细的切割程序,肯定能帮助我们更好地理解可能的解剖起源和各脑部疾病传播的途径,他们也将永远靠到可用于每个案件的详细的临床信息的数量,以进行精确的临床病理研究。一个用于此协议的最佳用途,那么,将在临床纵向研究,这往往是侦查的最佳类型的上下文n至收集更详细的临床,成像,遗传,环境,和其他类型的数据的关联尸检,微观的,和免疫组织化学与先前收集的临床数据的结果。
出人意料的是,神经病理学的调查分析,分类,定量或病理病变广泛涉及到半球的功能或本地化是极其罕见的41-44。然而,似乎时间和技术是准备在人类神经病理学研究前所未有的挑战。提出一个对称的双大脑半球切割程序的主要原因是尊重特有的功能不对称性人脑(解剖或病理)。很多时候,多为盲目接受传统不是行之有效的科学道理,只有一个半球(通常选择随机)已修复了神经病理学或免疫组织化学的评估,而其他已经冻结了可能的分子或生化分析。尤其是研究人类大脑的时候,半球和随之而来的脑部切割的休闲选择含有解剖术语的潜在风险,并可能导致可能的病理生理选择偏倚。而对于实际的原因,固定一个半球和冷冻相反的是在非研究环境合理,它是站不住脚在神经精神障碍的神经病理学研究的上下文中的任何时间。特别是在目前的时间,当潜在可用尸检“体内”神经影像学和遗传信息的一致的量,与相应的广泛的神经病理学评估的对称双半球大脑切削过程应常规进行。人类大脑半球专业化已被证明在许多认知功能,如语言,灵巧,和情绪( 即 ,差的活化在左和右杏仁核),以名称AFEW。这个半球专业化和偏侧较高的认知和非认知功能,通常区分和其他哺乳动物和非哺乳动物物种人类的特征,必须在神经病理学的角度来仔细考虑。有,在人类中,在神经变性,神经炎症反应,和neuroreparative能力方面对特定病理过程半球偏爱尚未知的,并且它已经很少研究40-43。虽然成像支持生理公知的,临床上半球的特定功能,这是令人惊讶的多少少在可能的神经病理学差异而言是已知的。通过提出的对称双半球大脑切割过程中,或更复杂的交替冻结和固定对称的双半球大脑切削协议中,我们的目的是描述可能有助于在健康和pathologi发现人脑的特有方面的方法CAL条件,基于其独特的半球专业化,偏侧功能。
一个本协议的最重要的步骤在于具有大脑切割设置,材料和工具,可立即在任何时刻,因为它是非常罕见的可以,当大脑预期特别是新鲜标本的必要性,是到达。此协议的另一个重要步骤包括新鲜和固定大脑切割所需的手巧。虽然处理的相同组织中,两个物理化学条件(新鲜和固定的组织)使专门知识的脑采集切割协议的一个重要和关键的组成部分。此外,神经解剖知识(尤其是新鲜的大脑程序)设特定的学术训练周期。对于新鲜脑程序,而且,有必要和关键的那样迅速行动尽可能并保持精度和Tissu酒店的完整性即这将保留包含在组织的所有生物信息,以及执行需要新鲜冷冻的材料将来的调查的可能性(RNA,蛋白质等 )。
双冷冻和固定对称脑切断方法表示用于获得两个新鲜冷冻的最佳折衷(用于遗传,分子和显微分析)和固定(对于神经解剖学,免疫组化是有用的,和PCR 原位分析)从脑组织切片特定脑区,并从两个半球的相邻区域。该方法表示使用完全相同的大脑区域/地区通过不同的分子和成像技术获得的比较分析的来源(分解剖区域,灰质细胞核,细胞群,树突/棘, 等 )。双冷冻和固定对称脑切割过程将允许人们从相同的网元获得的连续脑组织切片uroanatomical区。这将允许(使用不同的程序为每种类型的显微镜),使用明亮的光,荧光和电子显微镜分析道。 RNA / DNA /蛋白质的提取技术也可应用于,通过激光捕获microdissections,例如,神经元细胞,血管等的确切同一区域或组。这种交替冻结和固定对称bihemispheric脑部切割技术,与样品跟踪和制冷计算机系统联合,似乎提供了正在进行的和潜在的未来生物分子研究中的应用潜力巨大。
一种替代的方式来描述的大脑切削过程可以是每个整半球面的横截面切割。然而,该方法需要更专业的和昂贵的工具( 即,较大的切片机,更大的幻灯片等 )比通常在大多数神经病理学实验室使用的。相反,我们的并购ethod提出的大脑区域从两个半球更广泛的收集,使用切割通常可用的(和负担得起的)在大多数研究神经病理学实验室工具的单一脑区。
所提出的脑切割可以与组织学,细胞和亚细胞量化( 即 ,为无偏体视学)45-47的精确方法结合。定量神经病理学研究是最重要的,并且有必要的,因为在电路中,核,神经元,非神经元细胞,血管系统异常和神经元损失相关的特定病理损伤的定量数据大多在人类缺乏。近日,由用人偏见的体视协议获取特定的神经病理病灶精确quantifications开始在特定的突触损伤的积累之间可能存在的新的关系(即路易体),神经元的损失(即黑质损失)揭示,和临床表现(如帕金森的症状)分析人类大脑48时。确定剩余功能神经元的相对量或神经胶质细胞反应的必要的,例如,对比,延迟或补偿特定神经病理过程,将有助于更好地了解成人的大脑的反应和适应能力,特别是在老化过程中。容积神经元的变化,突起,病变载荷,纤维长度,皮质厚度,皮质层的厚度比,以及其他可能的形态方面是特别令人感兴趣的,因为在神经精神疾病或神经变性进程的上下文中,细胞和亚细胞水平及其可能的病理生理相关性尚未完全阐明49。数量,大小,纤维或突起,灰质和白质卷和比率的长度,皮质层分析等都是参数精确衡量的感谢具体统计公式和几何算法50的组合。几何方程和统计公式都高度敏感,电脑测微立体机动协调几乎任何类型的生物测量tissutal的组织学定量分析系统(体视电动系统)经过精心集成。
该组现已研究人类脑组织neuroanalyses的是不可想象在几年前,这是极有可能会有在不久的将来的进一步发展。今天的大脑的患者,临床上无症状个体和正常人的详细特征将加快不得了明天的发现和治疗的大多数神经和神经退行性疾病的个性化。在复杂的疾病,如神经精神疾病的背景下,即使当前的复杂的神经成像技术不能提供更高水平的细胞定义和生物信息,现代神经病理学技术可以的。此外,只有静态脑组织图像提供到对神经元细胞或病变或切割单个神经元的可能性的一个单一组执行无偏定量研究的机会( 即,激光显微切割)提取基因或蛋白原料为质谱分析,为例如51 .The对称bihemispheric脑部切割方法可以适用,除其他外,专门研究,如研究的同卵双胞胎的大脑。在这个独特的experimentum naturae的情况下,潜在的更好的理解半球专业化/偏侧和认知/病理学之间存在的可能存在的关系是令人印象深刻。不同层次半球相关的病理对称/非对称可以在一个自然/培育的困境而言更容易解释。例如,对称双大脑半球切割程序可以在同卵双生与异卵双生52-56的大脑进行。
对称bihemispheric脑部切割技术也应该适用于人类神经发育研究57。高度信息数据可以被收集为婴儿和儿童中的半球相关的神经元和神经胶质成熟定时,发育神经可塑性现象,和中枢神经系统的neuroreparative能力的具体方面。对称双大脑半球切割过程可以大大促进正常发育,正常老化过程中更好地确定人格特质的形成和行为变化的自然/培育的困境,而作为最初的临床表现的一部分。“零星”神经变性进程的58。
通过结构化的大脑切割程序进行经典的临床方法是不是历史的技术,但它仍然是诊断和研究的有效和有用的工具。特别是在当前的时间,如果是潜在可在尸检的临床和生物信息令人印象深刻的数量,临床上良好的特点的情况下,神经影像数据,并有详细的现代神经病理学/定量分析基因/分子信息的组合可能代表了前所未有的“权-match“神经科学的历史。结合生前和死后的调查能够极大地阐明神经精神疾病的功能和神经元/ tissutal基地和这些疾病的确切机制etiopathogenetic揭示,也考虑在帐户中没有具体考虑前半球的可能因素。作者都知道,所提出的对称bihemispheric大脑切割技术是时间和资金消耗,而是努力类似于那些神经影像学的发展应该执行在神经病理学研究领域进行为好。更加统一和结构化的大脑银行活动不会比建造或购买MRI机器,具有潜在的科学成果,将不会比神经影像学研究获得的回报少越贵。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Copy of signed informed consent allowing autopsy and brain donation for research use. | |||
Detailed clinical history of the subject which should include a detailed description of any neurologic and psychiatric symptoms and signs. | |||
Medical or nonmedical video-recordings when available (especially useful in movement disorders field). Next-of-kin’s consent required. | |||
Neuroimaging, neurophysiology, neuropsychiatric and assessment or clinicometric scales. | |||
Genetic and family history data. Genetic reports review, if neurogenetic diseases were diagnosed. | |||
Histology Container | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64233-24 | |
Histology Cassettes | VWR | 18000-142 (orange) | |
Histology Cassettes | VWR | 18000-132 (navy) | |
Knife Handles and Disposable Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62560-04 | |
Long Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62561-20 | |
Disposable Blade Knife Handles | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72040-08 | |
Scalpel Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72049-22 | |
Accu-Punch 2 mm | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 69038-02 | |
Polystyrene Containers – Sterile | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64240-12 | |
Dissecting Board | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63307-30 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 SIGMA | |
Hematoxylin Solution, Gill No. 2 | Sigma-Aldrich | GHS280 SIGMA | |
Eosin Y solution, aqueous | Sigma-Aldrich | HT1102128 SIGMA | |
anti-beta-amyloid | Covance, Princeton, NJ | SIG-39220 | 1:500 |
anti-tau | Thermo Fisher Scientific | MN1020 | 1:500 |
anti-alpha-synuclein | Abcam | ab27766 | 1:500 |
anti-phospho-TDP43 | Cosmo Bio Co. | TIP-PTD-P02 | 1:2000 |
Digital Camera | Any | ||
Head Impulse Sealing machine | Grainger | 5ZZ35 |
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