Summary
主催脳の切断手順は決定的な神経病理学的診断と特定の神経精神現象を相関させる必要があります。脳挿し木は、様々な臨床学術不測の事態に基づいて異なる方法で実行されています。このプロトコルは、ヒトの脳の病理における半球の違いを調査し、現在および将来の生体分子/ニューロイメージング技術を最大限にするために、対称bihemispheric脳切断手順を説明します。
Abstract
神経病理学者は、時々、脳の剖検が要求された人のために、これらの患者に説明し、複雑な神経精神現象の決定的な診断を生成するのに必要な知識の量におびえを感じます。生物医学科学とニューロイメージングの進歩は、神経精神分野に革命を起こしているが、彼らはまた、脳の解剖のみ確認値を持っていることを誤解を招くようなアイデアを生成しています。この偽のアイデアは、結果として、減少する可能性が人間の脳の未知の多数の正常および病的な側面を理解するために必要な、より詳細かつ広範な神経病理学的調査を実行するために、剖検率の大幅な削減を作成します。観測された神経精神現象とその可能性neurohistological相関の対応するローカリゼーション/特性評価との間の相関の伝統的な推論方法は、紛れもない価値を持ち続けています。 neuropsychiの文脈でそれは脳組織の直接の物理的な評価に特異的に依存しているので、atric疾患は、伝統的な臨床病理学的方法は、まだそれらに対応する神経病理学的基質にユニークな精神神経機能をリンクするため、可能な限り最高の方法論（および多くの場合のみ利用可能）です。死後脳の評価は、異なる神経病理学センター間で異なる脳の切断手順に基づいています。脳挿し木は、各施設に存在する様々な臨床的および学術不測の事態に基づいて、比較的広範かつ体系的な方法で行われています。より多くの解剖学的に包括的かつ対称双半球脳の切断方法は、少なくとも深さ、特定のための人間の脳（ すなわち 、半球専門と定位の特殊性と正常および病的状態で、コヒーレントに調査するために人間の神経病理学の研究目的のために使用されるべきです機能）。このような方法は、より包括的なコレを提供するであろう現在および将来のバイオテクノロジー及びニューロイメージング技術のための利用可能な神経病理学的によく特徴付けられた脳のction。私たちは、人間の脳の病理における半球の違いの調査のため、現在での使用だけでなく、将来の生体分子/ニューロイメージング技術のための対称双半球脳の切断手順を説明します。
Introduction
神経病理学者は、人間の脳を評価するための科学的な権限、知的名誉、および診断義務があります。何十年もの間、脳疾患と人間の死後脳におけるそれらの可能neurohistological相関を個別化するための主要な取り組みの詳細な臨床説明が行われています。歴史的に、これらの努力は、現代の時代に高度な、最も生産性の高い医学によるモダリティ、特に神経を表します。以前の著名な神経病理学者と献身、決意、奨学金、および（しばしば非常にルディメンタルツールを使用して）正常および異常脳組織とを区別するための驚異的な能力のおかげで、我々は今、このようなアルツハイマーPerusini病などの疾患を調査し、ターゲットすることができます（不当のみアルツハイマー病と呼ばれます疾患; APD / AD）1、パーキンソン病（PD）2、クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）3、ルー・ゲーリック病/筋萎縮性側索硬化SclerosiS（ALS）4、およびグアム病5は 、いくつかを言及します。
、機能的および形態学的磁気共鳴イメージング（ すなわち、fMRIの、拡散MRI、ラクト-MRI など ）、ポジトロン放出断層撮影法等の高精細コンピュータ断層撮影（CT血管造影、すなわち 、マルチセクションスパイラルCTスキャン）のような神経画像の高度な技術、 （PET）、超音波ベースのイメージング、および他のものは、確かに診断し、神経学的および精神病患者を治療する方法に関する私たちの一般的なアプローチを変更しました。それにもかかわらず、神経画像技術が生きている、彼らは直接ニューロンなどの細胞の高度に複雑な細胞および細胞内構造を分析するために、発生した瞬間に、機会を提供していないとき、人の脳を可視化することが可能であるものの、または、マークを視覚化し、細胞内の病変の特定のタイプを定量します。または正確に周回し、サブで彼らの神経解剖学や小地域局在を示すために周回解剖学的レベル。例えば、神経画像技術は、嗅内皮質でADの古典的な特徴を黒質（SN）、PDに関連する一般的な病理学的特徴、または神経原線維変化（NFT）の色素性ニューロンにおけるレビー小体（LB）を識別またはローカライズすることができず、他の脳の病理。高度なデジタル顕微鏡と組み合わせた神経病理学的研究は決定的な診断のために、このように、詳細な臨床病理学的相関関係をまだunreplaceableあると。
人間の脳の特異な解剖機能特性に、特にその解剖学的局在する（つまり、頭蓋骨、その内容を直接審査を許可していない自然保護システム内部）、in vivoでの神経画像技術の導入非常にこの複雑な組織の謎のいくつかに最初の答えを見つけるために臨床医や研究者を支援してきました。しかし、臨床的またはneuroimagiはありません直接剖検時に脳組織を分析するためのユニークな機会を置き換えることができますngの方法。組織的な収集、保存、および人間の脳の分類のみを変更、確認するために、神経細胞および非神経細胞、それらの細胞内成分、細胞内および細胞外の病変、および脳内部の異常のいずれかの種類の直接的かつ体系的調査を許可することができ、または臨床診断を再定義し、新しい臨床病理学的相関を発見します。剖検で脳の評価に関する明白な制限の1つは、この手順は、断面の方法であるという事実でした。常に継続的な神経病理学的プロセス（臨床的に明らかかどうか）とneurohistologicalレベルでそれを定義する機会があれば、間の遅延があります。これは主に自分自身を再生成するために人間の脳の無能力によるものです。 PEを作成せずに、in vivoでの脳組織を得ることが現在可能ではありませんrmanent損傷。これにより、縦方向および神経病理学的に同じ脳/人を評価することはできません。しかし、標準化された脳の銀行手続き、一般市民の間で脳の寄付のための意識向上が大幅に一貫して収集して分析するための例数を増やすことで脳剖検タイミング問題の解決に貢献することができます。このように、死後脳のより適切な数字は、各人間の脳疾患に関連した脳病変の各特定の種類の病理学的起源および進行の一定のパターンを定義するために得ることができました。これは、すべての年齢層全体で寄付し、できるだけ多くの脳のコレクション任意の神経精神障害に罹患した患者から、同様の健康な対照被験者を必要とするであろう。一つの可能な方法は、標準的なルーチンなどの一般的な、専門の医療センターからできるだけ多くの死後脳を集めることができました。脳の寄付の必要性は、最近、発現されています認知症と正常な老化6を研究者たちによります。同じ必要性は全体として精神神経フィールドによって表現されるべきです。
上記および他の理由のために、継続的な脳の切断手順の更新が必要です。また、手続きを切断脳は普遍的にもアカウントに、より良いに調査し、うまくいけば、決定的に理解することは、脳疾患の原因やメカニズムするために、現在および将来のバイオテクノロジーの技術を採用する可能性を取って、世界中のさまざまな神経病理学研究センター全体で標準化されるべきです人間。
ここでは、主に研究目的のために、我々は、ヒトの死後脳の切断のための対称的な方法論を説明します。この手順は、正常に行わよりも多くの脳領域を収集し、大脳と小脳両半球から提案しています。対称双半球脳切断手順は、人間の私たちの現在の知識を持ってはるかに良いフィットします神経解剖学、神経化学、および神経生理学。また、この方法は、可能性が神経病理学的に、一般的または排他的に存在する私たちの種で高い認知および非認知機能と関連しているような半球専門や定位などの人間の脳のユニークな機能を、分析することができます。半球専門/定位脳病変の特定のタイプの間の特定の病原性の関係が存在するかどうか、または独特の精神神経病原性のイベントがあるかどうかを最初に、広く、または排他的に特定の半球に関連した機能は、現在知られていません。この対称的な脳の切断手順を記述することにより、私たちはより良い高度に専門的な組織における正常および病的状態、脳を理解するのに役立つ可能性があり、人間の脳の解剖の更新方法を提案することを目指しています。この方法も考慮に人間だけに存在したものモルフォ機能半球の側面を取ります。
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Protocol
死後のヒト組織を含む手順は、倫理審査委員会により審査し、45 CFR（連邦規則集）の下で免除されています。
注：このプロトコルは、ヒトにおける神経病理学的研究のために確定死後脳の評価のための対称bihemispheric脳切断手順を説明します。装置、器具、材料、人間の脳の切断を実行するために必要な消耗品の詳細な説明は除外されます。脳の解剖のための材料および消耗品は、単一の治験責任医師の裁量で選択され、各研究機関で許可または承認された剖検ツールに基づいています。この手順に必要な工具と材料の最小セットは、材料/機器表に記載されています。例えば、ヒトCJDなどの疑いが伝染脳疾患に特異的な切断手順や注意事項は、この原稿の目的外であり、他の情報源7から入手可能です。
1.対称のBi半球脳切削
注：脳はperiagonal、代謝（ すなわち、pH値）に応じて、2〜3週間の期間のために必要な組織固定（使用して、例えば、中性緩衝10％ホルマリン）を受信したことを確認し、組織保存（ すなわち、温度）の条件。しかし、撮像病理相関研究、固定の長期間（> 5.4週）8が提案されています。
- 研究者に対して反対方向に向け前頭極と、研究者が直面している平らな面に脳を置きます。
- すべての皮質脳回と全体の大脳（ 図1a）の脳溝の完全かつ明確な可視化を可能にするような方法で脳を置きます。
- 髄膜異常をまず見て、巨視的な半球非対称性（焦点、大葉、または萎縮の一般半球現象の可能性指標）、肉眼tissutal病変（ すなわち、tumoRSまたはヘルニア）、先天性奇形、血管の異常、および他の可能性のある異常や脳表面の異常なプレゼンテーション。
注：人間の脳を評価する方法の詳細については、市販の神経病理学の教科書と剖検マニュアル9,10を参照してください。
2.プロトコルシーケンス
- 研究者が直面している半球（終脳）の表面的な側面と、離れた研究者から前頭極に直面しています。可能なマクロ異常を文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手は、全体の皮質表面をキャプチャするために脳に垂直（ 図1a - c）のデジタル写真を撮影しています。
- マークの前と脳を切断する前に、インクまたは着色針を使用して、中心後皮質脳回（ 図1b 注：この手順は、切断後、モータと体性感覚の一次皮質のより多くの即時認識を容易にします。
- それが同じ方向を向いて維持しながら180度の脳を回転させる（ すなわち、研究者から反対側前頭極）。慎重に脳の基底部を点検します。その脳幹出口/入り口レベルでの脳血管系（ すなわち、脳底および椎骨動脈とウィリスのサークル）と脳神経の条件に特別な注意を払ってください。その極端な弱さに起因するtissutal裂傷を避けるために特別な注意を払って嗅球とトラクトを管理します。
- 可能なマクロ異常を文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手が、皮質および脳幹の表面の全体をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。
- 脳の基底部に直面し、メスを用いて、（大脳のベースにできるだけ近い）橋の上部のレベルで脳幹の横方向をカット。慎重SN（ すなわち 、蒼白用）11と隣接する他の構造体12を検査します 。正常な脳13と比較して、脳の異常な外観の、おそらくオーディオレコーダーデバイスを使用して、注意してください。
- 再び180度の脳を回転させると、鋭いナイフを使用して、内側縦裂の中心を通って脳梁を切断し、前頭後頭方向に従うことによって、2つの半球を分離します。可能な異常（ 例えば、心室拡大、奇形、組織の軟化、腫瘍など ）13のための各半球の各側面を点検します。 図2aを参照してください。
- 可能なマクロの異常を文書化するためにそれぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ると、可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮します。研究助手が全体皮質表面をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。正常な脳と比較して、脳の異常な特徴をメモしておいてください。
- 図2bに示すように、離れた研究者から直面して前頭葉と、その内側の面の上に横たわって、平らな2つの半球を置きます。その中心は、（マークされた半球非対称の場合にも）に触れるような方法でそれらを配置します。
- 鋭いナイフを使用して、手動で両方の大脳半球を切って、前頭極から始まり、半球の全長にわたって後頭部の極に向かって移動します。 （各半球のための18のスラブの周囲に）脳組織の厚さ1cmのブロックの2つのシリーズを取得します。
- 別々の平らな面に、解剖学的に組織（前頭後頭方向）の順序で脳のスラブを配置します。白いsurfaを使用してください撮影良好なコントラストのためにそれに印刷された定規とCE。彼らの冠状面が直接眼の検査とデジタル写真（ 図3a）のために表示されていることを確認して、解剖学的に対称的な方法（前頭後頭方向）における脳スラブの2つのシリーズを表示します。より正確に脳構造、大きさ、および可能な異常をローカライズするために両面に印刷ミリグリッドで切断面を使用してください。
- 可能なマクロ異常を文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手が全体皮質表面をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。正常な脳と比較して、脳の異常な側面の、（おそらくオーディオレコーダーデバイスを使用して）メモを取ります。
- 鋭いメスを使用して、手動でのより小さな矩形ブロックを分析確立された各脳領域に対して脳組織。 表1に記載の提案脳領域コレクションスキームに従ってください。
- 別々に標識されたhistocassettes内の各組織ブロックを置きます。
注：脳組織の各ブロックは、可能な限り、標準histocassette最大量（30×20×4 mm 3で）を適合するように切断される必要があります。 - （;むしろ、 表1に示すように、常に、同じ地域の解剖学的名称または対応する番号を使用し、異なる脳のために、ランダムな文字や数字を使用していない）各ケースのデ識別コードを使用して、特定の神経解剖学的識別子を使用してhistocassettesにラベルを付けます。例えば、それぞれの場合のために、ランダムまたは半ランダムな数字を生成することにより、脱識別コードを作成します（ すなわち 、Bは脳のためにとどまりBRC 130は、Rは、リソースのためにとどまり、Cはセンターのためにとどまり、130プログレッシブアクまたはAD160001ですADは、16である」、アルツハイマー病研究」を表します剖検が行われた年（2016年）、そして0001プログレッシブアク検体番号）。
注：この手順は、将来の研究のために非常に便利です。伝説を維持し、半球（L =左半球、R =右半球）を指定します。各半球のための特定の色を確立し、histocassettesの2つの異なる色を使用してください。 - 可能macroanomaliesを文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手が全体皮質表面をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。正常な脳と比較して、脳の異常な特徴をメモしておいてください。
- 別々に標識されたhistocassettes内の各組織ブロックを置きます。
- デジタル写真を撮る全体カット脳および関連histocassettesの（必要または所望のように多くのように）。
- （アキュパンチにより例えば、）パンチDNA抽出と遺伝子解析のための組織の小片。つかいます直径5ミリメートル - 2のパンチ。
注：ゲノム物質の含量が高いため、小脳が好ましい選択肢です。しかし、他のどの地域で結構です。 - 以前に組織処理の次のステップまで使用されるような固定液（ 例えば、10％中性緩衝ホルマリン）の同じタイプで脳組織のブロックを含むすべてのhistocassettesを再浸します。
- 人間のホルマリン固定組織処理14のための標準的な手順に従ってください。
3.特別なアプローチ：交互冷凍と固定対称Bihemispheric切削
注：セクション2で説明した対称bihemispheric脳の切断プロトコルは同じ体系的かつ対称に未固定、新鮮な脳（使用可能な場合）からの組織スラブを切断する可能性を提供しています。
- 中で10分間-80℃のフリーザー脳組織を強化するためにwithou - 逆さまに（好ましくは半球状の椀状のプラスチック表面上の）8のための全体の新鮮な脳を置きますtは、生化学的損傷を誘発し、手動切断を容易にします。
- 鋭いナイフを使用して、交互に連続するようにして両半球をカットし、第2節で説明した脳の切断プロトコルに従うが、（両半球からと前頭後頭解剖学的な方向に沿って）他のすべてのスラブを凍結して修正。
- この時点で、 表1に記載したように、各脳領域をカットしようとしません。即時RNAまたはタンパク質の抽出（ すなわち、ゲノムやプロテオーム研究のため）15のために必要な場合にのみ、特定の新鮮な脳領域をカットします。
- 切断した後、すぐに各新鮮な組織を、ラベルを凍結し、そして数。全体スラブシリーズのデジタル写真を撮ります。単一ビニール袋に各スラブを詰めます。独立した、1 - 脳専用容器にスラブを集めます。そして専用の-80°Cの冷凍庫で容器を保管します。
注：冷凍庫は唯一のヒト脳組織専用にする必要があります。唯一の後に歌います各特定の実験に必要なレ凍結脳領域を切断します。 - 十分な固定液の量（固定液/組織ブロック比の3/1量）を含む別々の袋で固定（10％中性緩衝ホルマリンまたは他の固定剤）のために選択された他のすべての組織のスラブを浸し。連続前頭後頭シーケンスに続く、それらを番号付けすることにより、各袋にラベルを付けます。各袋を密封、デジタル写真を撮って、そしてプラスチック容器に保管してください。
- 組織固定の2週間後に、固定剤含有袋を開き、 表1に記載されているように、各脳領域をカット。
4.組織染色剤および免疫組織化学
注：脳領域の集合が提案方式に基づいてカット（ 表1）は AD 16のために最も、全てではないが、現在確立合意に基づく病理学的基準を満たすのに十分である、PD 17、レビー小体（DLB）18認知症、前頭側頭型認知症（FTD / MND）
- 各脳領域のため、両半球のために、histostainsの次の最小セットを実行：ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）、クレシルバイオレット（CV;定量的形態学的研究は、例えば計画されている場合）、および銀染色（もし「探索」の分析があります必要に応じて）。
- 各脳領域の場合と両半球のために、免疫組織化学プロトコルの次の最小セットを実行します（βA）、リン酸化タウ（pTau）、リン酸化αシヌクレイン（Pα-SYN）アミロイドβ、およびリン酸化-TDP43（pTDP43） 14について記載しました 。
注：（両半球からのすべての脳領域が利用可能な場合）、このプロトコルに従って各脳を評価するために、組織切片の総数は46です。
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Representative Results
プロトコルの長さ
単一の対称bihemispheric固定脳切断手順のために費やされた時間は1時間と推定されている（;ラベリング;表面を解剖テーブル、ツールを設定し、切削費やした時間を除く。 など ）。単一の対称双半球交互凍結固定脳切断手順に必要な時間は2時間を要すると推定されます。単一のヒトの脳/主題のための決定的な組織学的診断を得るために6週間 - それは、少なくとも4の間に取ることができます。頭蓋骨からの死後脳を除去した後、組織固定の適切な期間（2 - 少なくとも3週間）が発生しなければなりません。そして、対称bihemispheric脳切断、組織の処理、組織包埋ブロック切片、および染色および免疫組織化学を実施しなければならないなどのプロトコルの一連。半球ごとの各領域の最後に、微視的評価、共同の使用nsensus確立病理基準及び分類、臨床記録のレビュー、そしておそらくclinicopathologyの相関は、神経病理学的な結論の前に行わなければなりません。具体的な調査研究を計画する際、完全な人間の脳の神経病理学的評価のための全体タイミングは慎重に検討する必要があります。また、医療同僚や研究調査官、ドナーの家族、および法的当局は、近代的な神経病理学的評価を得るために、合計時間の要件、複雑さ、およびチームの時間/労力を知らされるべきです。
提案された脳の切断プロトコルは時間がかかり、困難な手順を示しているが、実際に広く健康および病的状態の両方で人間の脳を評価する科学的にやりがいの方法を表します。これは、制御/正常な対象として受信剖検、脳の間にかなり頻繁に、それを強調することが重要である（ すなわち、、臨床的または死亡の前に神経学的に正常）として評価対象は、実際に正確な神経病理学的評価の後、様々な脳の病理のために陽性であることが見出され得ます。これらの例は、様々な脳疾患のための加齢に関連する神経変性疾患を特徴付ける特に、いわゆる無症候性および前臨床科目を表します。これは、特に研究目的のために、非常に広範かつ綿密な方法で「対照」として受信脳を評価することの重要性を強調する。これは、神経/精神障害のための症候またはない人間の脳/対象は、23,24の老化中に複数の脳の病理（いわゆる共起病理）を蓄積することができることがますます明らかになってきています。 （PARS、ARTAG、カート）25-27興味深いことに、これらの共起脳病変は、臨床的に明らかな疾患を持つ患者に見られるものと生化学的に同一であり、同様に同じ解剖学的領域に局在しています。これらのカ（のみ剖検調査を通じて可能）最近の知見再人間の脳の老化の影響の研究に特別な関連性を持っています。
表2および図4は、私たちの脳バンクに採取したヒトの脳の一連の上で行わ対称双半球脳切断手順を使用して得られたいくつかの予備半定量的なデータを記述する。これらの予備的データは、ほとんどの脳は既に28-32知られているように、だけでなく、実際にβの A-老人斑とタウ神経原線維変化（タウ-NFT）に陽性であったが、また古い被験者から「通常」または「コントロール」として受け取ったことを示しています不溶性βの A-老人斑の負担は同じ脳の右側嗅内皮質および海馬に比べて左嗅内皮質および海馬においてより高かったこと。脳を34 systeをステージングCERAD 33およびブラークを用いて評価しましたそれぞれβA-老人斑を評価し、タウ- NFTミリ秒、。病理β不溶性のために観察された左半球の偏愛は、また存在していたものの唯一の右半球と比較して、左半球の残りの領域のほとんどの傾向、など。これらの予備的双半球所見の関連性を分析した脳は、一般的な集団剖検コホートからのすべてだったということです。すべての被験者は、非神経学/精神医学的原因のため、実際には、入院および非神経学的理由のために、異なるコミュニティ一般の病院で死亡しました。分析脳は特殊な神経学/認知症センターからのみの脳を分析する際に存在する可能性の選択バイアスを最小限に抑え、一般的な集団剖検コホートからのものであったという事実。また、NINDS 6からの推薦を参照してください。我々の調査結果は、（46利用可能な「コントロール」の脳のうち4）予備的であり、はるかに大きな規模での確認が必要です。しかし、これらの新規な知見sが、確認された場合、AD病理の蓄積および進行のために半球好みの可能な現象を示唆している、または少なくとも病状をβ。病的半球predilectionsの同様の種類は非常に可能性神経精神または神経変性疾患のそれぞれの特定のタイプに関連付けることができました。さらに、正確な細胞および病変定量化（ すなわち 、公平なステレオロジー）の方法を用いて、対称双半球脳切断手順を組み合わせることにより、回復する病的状態の法線の比率、ならびにニューロンの損失の割合を測定することが可能かもしれません特定の半球と機能に関連して、ヒトに存在するかもしれない/神経可塑性現象。興味深いことに、各脳病理の主要なタイプ（βアミロイド、タウ、LB、TDP43、FUS、 など 。）のための半球偏愛がまだ確立されていないものの、機能的神経画像34、神経心理学36 P>、および微細構造の解剖学は37,38は、私たちの予備的な結果と一致しているようだ分析します。これは、脳の病理学および関連疾患のそれぞれ異なるタイプの可能な半球好みの仮説を補強します。
図1. Bihemispheric脳切断する前の準備脳アセスメント。この図は、10％中性緩衝ホルマリンで固定の2週間後に人間の脳の様々な表面的な側面を示しています。時計回りの順序では、脳の優れた側面は（a、b）は、小脳の検査を含む大脳の基部に観察、（c）は 、脳幹や脳神経の（d）、及び嗅球が続いていると管（E）。02 / 54602fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2. Bihemispheric人間の脳の切断図 。眼の検査のために平坦な表面上に配置されたホルマリン固定ヒト脳（A）。赤い線は内側縦裂を示しています。内側縦裂（b）の中央貫通カット後の2大脳半球の配置。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. Bihemispheric脳切断手順。この図は、以下の工程の一部を示しています bihemispheric人間の脳の切断プロトコル。 （ 表1）（両半球のための）全ての脳スラブを廃棄し、前頭後頭方向（a）は、確立された各脳領域を収集するために、次の後に組織ブロックにカットされますフィッティング標準histocassette寸法（B - E）。 （緑色の[右小脳半球]と青[左小脳半球]を参照してください; e及びf）小脳組織ブロックは、より大きなhistocassettesが必要になります。ホワイトカセットは、このような等延髄、脊髄などの中央値構造のためのものです。 （ ホ-グラム ）。最終histocassettes bihemisphericヒト脳切断プロトコルの後に得られた表1に列挙された各神経解剖学的領域からの脳組織のブロックを含むが、固定液の同じ初期種類（10％中性緩衝ホルマリン）（ - G F）に再浸漬されます。tp_upload / 54602 / 54602fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
免疫組織化学によって異なる抗原に対する各大脳半球ステンドから 4. 組織切片を 図 。 （A）この図は、同じ人間の脳の両半球からの組織切片のシリーズを示しています。双半球のセクションの各シリーズは、その陽性、アルツハイマー病やパーキンソンなどの一般的な加齢に関連する神経変性疾患に関連付けられている、βアミロイド、リン酸化タウ、およびリン酸化αシヌクレイン（α-SYN）、のために免疫染色しました。画像は、提案された二半球対称脳切断プロトコルを使用して分析するセクションの可能な合計量の代表的な例を示しています。 LH =左半球、RH =右半球。 （ B）これらの画像は、βアミロイド老人斑、タウ神経原線維変化、およびαシヌクレイン（α-SYN）陽性レビー小体型のために、特定の免疫組織化学プロトコルを使用した後、顕微鏡下で観察されるように、一般的な加齢に関連する脳病変のサンプルを示しています。各画像の劣る右隅に拡大表示して、正確に病変の各タイプを識別するために（5X、20X、および40X）使用目的のタイプです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
スキームを切断表1 Bihemispheric。この表は、各脳の左右半球の両方に解剖するための単一の解剖学的領域を示しています。 bihemispheric対称切断が新鮮で固定頭脳に行うことができます。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックrce.jove.com/files/ftp_upload/54602/54602table1.xlsx">Please~~MD~~aux。
Bihemispheric人間の脳切断して得られた表2の予備的調査結果 。このテーブルには、臨床的に正常な、古い科目から4人間の脳で行わbihemispheric対称人間の脳の切断手順を経て得られた予備調査結果を示しています。データは、2の脳領域（嗅内皮質および海馬）は常に、早期βアミロイド老人斑とタウ-NFTの蓄積に関与していることを示しています。病変のこのタイプは、ADを引き起こす最も可能性の高い病原性プロセスであると考えられています。 F =女性。メートル=男性。括弧内の数字は、各剖検被験者の（年）死亡時の年齢を表しています。可能hemisの迅速な可視化のための半定量比色コード別の古い被験者間の病変、重症度のレベル、および解剖学的ローカライズのタイプ間pheric違いが使用されてきました。 NEG =陰性（緑）。スパース= 1から2病変（黄色）;中等度= 3から6病変（オレンジ）。頻繁=> 6病変（赤）。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この脳の切断方法は、依然として、その主な機能の一つとしてbihemispheric対称な切断手順を維持しながら（例えば、各半球のために評価する脳領域の数を減らすことによって）それぞれの神経病理学研究室の特定のニーズに適合させることができます。この提案されたプロトコルは、日常的な手順（研究指向の神経病理学的中心）または、必要な場合にのみ（特定の臨床的指向の研究）を使用することができます。これは、選択的にのみ調査の特定のタイプ（ すなわち、免疫組織化学）または分子分析（ すなわち 、ゲノムまたはプロテオーム解析）のために使用することができます。技術的な観点からは、（特に免疫組織化学で）いくつかの病理学的な違いは、免疫組織染色強度の可能な人工的な変動に起因することができることを言及するのに有用です。これらは、劇的に人工染色効果aの可能性を低減する、自動染色機を使用することによって最小にすることができますNDバリエーション。これは、技術的に信頼性の高いロボット染色機を用いて技術的アーティファクトによる交絡因子の大部分を最小化するために、実際には、現在可能です。 、例えば2つの同一の被験者から大脳半球、または複数の対象からの両半球の複数のセットを評価する際にこのように、比較可能な結果を得ることができます。
また、ここ数年の間に、人間の脳で認識脳病変の数が莫大に39を増加しています。脳病変のこれらの新しいタイプのは、正常または対照として分類前の脳は実際にはないリスクの増加を作成しました。 「擬似制御」の例または「偽コントロール"脳が常に40可能であるため、免疫組織化学技術と新たな神経病理学的発見の改善」、コントロール「以前のようにバンクのすべての脳の賢明かつ定期的な再評価を示唆しています。
の主な制限この方法は、それを実行するために必要な時間と専門知識（解剖学的および病理学的知見）の量にあります。また、人間の脳のゲノムおよびプロテオミクス面を分析することを目指した研究は、全ての脳の寄付手続きは、迅速な方法で、法的同意の手配、脳の削除、凍結または固定の手順については、即時切断を管理する準備ができて脳バンクチームを必要とします。通常、これらの設備や人員のみ専門の学術や研究センターでご利用いただけます。詳細な切断手順が確実に良い可能解剖学的起源と各脳疾患の拡散経路を理解するのに役立つことができるがまた、それらは、常に正確な臨床病理学的相関研究を行うために、それぞれの場合に使用可能な詳細な臨床情報の量に依存します。このプロトコルの最適な使用方法の1つは、その後、多くの場合investigatioの最高の一種である臨床病理学的縦断研究の文脈になりますnが以前に収集した臨床データとの剖検、顕微鏡、および免疫組織化学の結果を相関させるために、より詳細な臨床、イメージング、遺伝的、環境的、および他のタイプのデータを収集します。
驚くべきことに、神経病理学的な調査、分析分類、または半球の機能または局在化に関連して神経病理学的病変の広いスペクトルを定量化するには、41-44極めて稀です。しかし、時間と技術が人間の神経病理学の研究において前例のない挑戦の準備ができていることが表示されます。対称双半球脳切断手順を提案する主な理由は、人間の脳の（解剖学的または病理学）特有の機能非対称性を尊重することでした。あまりにも頻繁に、他の可能性分子のために凍結されていながら、実績のある科学的な理由、唯一の半球（多くの場合、確率的に選択された）は、神経病理学的または免疫組織化学的評価のために修正されているよりも、盲目的に受け入れられた伝統のためのより多くのまたは生化学的分析。人間の脳を研究する際、特に、半球のカジュアルな選択とその結果としての脳の切断は、解剖学的観点から潜在的なリスクが含まれているし、可能な病態生理学的な選択バイアスが発生することがあります。実用的な理由のために、1半球を固定し、反対を凍結することは、非研究環境で合理的であるが、それは精神神経疾患のための神経病理学的研究の文脈でもはや批判に耐えられるではありません。特に、現時点で、「インビボ」神経画像と遺伝情報の一貫性のある量際には、対応する広範な神経病理学的評価対称双半球脳切断手順が日常的に行われるべきで、剖検時に潜在的に利用可能です。人間の脳の半球専門は、名前、AFに、そのような言語、器用さ、および感情（ すなわち 、左と右扁桃体における差動活性化）のような多くの認知機能に実証されていますEW。典型的には、他の哺乳動物および非哺乳動物種から人間を区別し、特徴付ける高い認知および非認知機能のこの半球専門と定位は、慎重に神経病理学の観点から考慮されなければなりません。あることを、ヒトでは、神経変性、神経炎症応答、およびneuroreparative容量の点で特定の病理学的プロセスのための半球状の偏愛は、まだ知られていない、それは非常にまれにしか行われていない40-43を調査しました。イメージングは、生理学的によく知られており、臨床的に半球固有の機能サポートしていますが、可能な神経病理学的差異の観点で知られているどのくらいの少ない驚くべきことです。手順をカット対称双半球脳、またはより洗練された交番凍結し、固定対称双半球脳の切断プロトコルを提案することにより、私たちは健康とpathologi中に人間の脳の特異な側面を発見するのに役立つ可能性があり方法を説明することを目的としましたcalの条件、そのユニークな半球専門と定位特徴に基づくように。
このプロトコルの最も重要なステップの一つは、ときに脳の特定の新鮮な試料で、予想できることは非常にまれですので、いつでもすぐに利用できる設定、材料、及び切削工具の脳を持つことの必要性で構成されてい到着。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、新鮮で固定された脳の切断に必要な手先の器用さで構成されています。同一の組織を扱っているが、2つの物理的・化学的条件（新鮮で固定された組織）は、プロトコルの本質的かつ重要な成分をカット脳のための専門知識の取得を行います。また、（特に新鮮な脳の手続きのための）神経解剖学の知識は、特定の学校教育期間を想定しています。新鮮な脳の手順については、また、可能な限り迅速に移動し、精度とTISSUの整合性を維持するために不可欠と重要です電子。これは、組織に含まれるすべての生体情報だけでなく、新鮮凍結材料が必要な将来の調査を実行する可能性は保持されます（RNA、タンパク質、 などを 。）。
脳組織切片からの二重冷凍と固定対称脳の切断方法は、新鮮凍結両方得るために可能な限り最良の妥協点を表す（、分子遺伝学のために有用な、と顕微解剖分析）と固定（神経解剖学、免疫組織化学のために有用な、とその場で PCR分析します）特定の脳の領域と両半球からの連続した領域。この方法論は全く同じ脳領域/エリア使用して異なる分子およびイメージング技術により得られた比較分析の源を表す（サブ解剖学的領域、灰白質核、細胞群、樹状/棘などを 。）。二重凍結固定対称脳切断手順は1つが同じNEから隣接する脳組織切片を得ることができるようになりますuroanatomicalエリア。これは、（顕微鏡検査の種類ごとに異なる手順を使用する）、明るい光、蛍光および電子顕微鏡を使用して分析を可能にします。 RNA / DNA /タンパク質抽出技術、レーザーキャプチャーmicrodissections介して、例えば、ニューロン細胞、血管などのまったく同じ領域またはグループに、適用することができます。この交互凍結し、共同でサンプル追跡および冷凍のためのコンピュータ化されたシステムで、対称bihemispheric脳切断技術を固定は、継続的かつ潜在的な将来の生体分子の研究の応用のための巨大な可能性を提供しているようです。
記載脳切断手順の別のアプローチは、それぞれ全体の半球面の断面の切断である可能性があります。しかし、この方法は、より専門的で高価なツール通常、ほとんどの神経病理学研究室で使用されるものよりも（ すなわち、より大きなミクロトーム、大きくスライドなどを 。）が必要です。その代わりに、私たちのメートルethodは、ほとんどの研究の神経病理学研究室で通常利用可能（と手頃な価格の）ツールを使用して、それらの単一の脳領域を切断、両半球からの脳領域のより広範なコレクションを提案しています。
提案された脳の切断組織、細胞、および（公平なステレオロジー用すなわち 、）細胞内定量45-47の正確な方法と組み合わせることができます。特定の病変に関連する回路、核、神経細胞、非神経細胞、血管系の異常、およびニューロン損失に関する定量的データは主にヒトで不足しているため、定量的な神経病理学的研究は、第一に重要、必要です。最近では、公平な立体学プロトコルを使用することによって得られる特定の神経病理学的病変の正確な定量化は、特定のニューロン内病変の蓄積との間の可能性のある新たな関係（ すなわち、レビー小体）、神経細胞の損失（ すなわち、黒質の損失）に光を当てるようになりましたおよび臨床症状（ すなわち、パーキンソン症状）人間の脳48を分析するとき。残留機能ニューロンの相対量を決定するか、必要な神経膠細胞を反応させ、例えば、遅延を対比するために、または特定の神経病理学的プロセスを補うため、特に高齢化の際に、より良い大人の人間の脳の応答性と適応能力を理解するのに役立つ可能性があります。体積ニューロンの変化、神経突起、病変負荷、繊維長、皮質の厚さ、皮質層の厚さ比、および他の可能な形態学的な側面は、神経精神医学的疾患または神経変性プロセスのコンテキスト内での細胞および細胞下レベルでのそれらの可能性の高い病態生理学的関連性あるため、特別な関心がありますまだ完全に49を解明されていません。数、サイズ、繊維または神経突起、灰色と白質容積および比の長さは、皮質層分析など、すべてのパラメータを正確に測定可能であるおかげで特定の統計式と幾何学的なアルゴリズム50の組み合わせ。幾何学的な方程式や統計式はエレガントバイオtissutal測定のほぼすべてのタイプの組織学的定量化のための高感度、コンピュータ化されたマイクロメートル三次元協調電動システム（立体学電動システム）と統合されています。
人間の脳組織を研究するために利用可能になりましneuroanalysesのセットは、数年前に想像ではなかった、近い将来にさらなる進歩が存在することになる可能性が高いです。患者、臨床的に無症候性の被験者、および正常な個体から、今日の脳の詳細な特徴は、信じられないほど明日の発見や最も神経精神や神経変性疾患の治療の個性を加速していきます。このような神経精神疾患などの複雑な病気のコンテキストでは、あっても現在の洗練された神経イメージング技術はできません携帯定義および生体情報現代の神経病理学的技術ができることを、より高いレベルを提供しています。また、唯一の静的な脳組織の画像がために、質量分析解析のための遺伝子またはタンパク質物質を抽出するために、単一のニューロン（ すなわち、レーザーマイクロダイセクション）をカットする神経細胞または病変または可能性の単一のグループについて、公正な定量的な研究を行う機会を提供しています例51【選択対称bihemispheric脳の切断方法は、一卵性双生児の脳を調査したものなど、特別な研究に、とりわけ、適用することができます。このユニークなexperimentum naturae状況では、より良い可能な関係を理解する可能性が半球専門/定位と認知との間に存在する/病状が印象的です。半球に関連した病理学的対称/非対称性の異なるレベルをより容易に自然/育成のジレンマの観点から説明することができました。例えば、対称双半球脳切断手順は、二卵性双生児52-56対一卵性双生児の頭脳に行うことができました。
対称bihemispheric脳切断技術はまた、ヒト神経発達の研究57に適用する必要があります。非常に有益なデータは、乳児期や小児期の半球に関連した神経細胞とグリア成熟時期、発達神経可塑性現象、及び中枢神経系のneuroreparative容量の特定の側面のために収集することができました。手順をカット対称双半球の脳は大きく、より良い性格特性の形成のための自然/育成のジレンマを定義するために貢献し、正常な発達中の行動の変化、正常な老化、および「散発的な「神経変性の初期臨床症状の一部として58を処理することができます。
構造化脳の切断手続きを経て行われ、古典的な臨床病理学的なアプローチではありません歴史的な技術が、それはまだ診断や研究の有効かつ便利なツールです。特に詳細な近代的な神経病理学的/定量分析と臨床的および生物学的情報の印象的な量は、剖検時に潜在的に利用可能であり、現在の時刻、臨床的に十分に特徴付けられた例を組み合わせ、神経画像データ、および分子/遺伝情報で前例のない「権利を表すことができ神経科学の歴史の中で "-match。組み合わせ生前と死後の調査は非常に精神神経疾患の機能とtissutal /神経基盤を明らかにし、また、アカウントに特異的に前に考慮されなかった可能性半球の要因を取って、これらの疾患の正確なetiopathogeneticメカニズムに光を当てることができます。著者は、提案された対称bihemispheric脳切断技術は、時間と資金がかかることを認識しているが、ニューロイメージングの進歩のために行ったものと同様の努力すべきです同様に神経病理学研究分野で行われます。より多くの調和と構造化された脳の銀行業務は、ニューロイメージング研究によって得られたものよりも小さいやりがいのではないであろう潜在的な科学的成果で、建物またはMRIマシンを購入するよりも高価ではありません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copy of signed informed consent allowing autopsy and brain donation for research use. | |||
| Detailed clinical history of the subject which should include a detailed description of any neurologic and psychiatric symptoms and signs. | |||
| Medical or nonmedical video-recordings when available (especially useful in movement disorders field). Next-of-kin’s consent required. | |||
| Neuroimaging, neurophysiology, neuropsychiatric and assessment or clinicometric scales. | |||
| Genetic and family history data. Genetic reports review, if neurogenetic diseases were diagnosed. | |||
| Histology Container | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64233-24 | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-142 (orange) | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-132 (navy) | |
| Knife Handles and Disposable Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62560-04 | |
| Long Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62561-20 | |
| Disposable Blade Knife Handles | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72040-08 | |
| Scalpel Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72049-22 | |
| Accu-Punch 2 mm | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 69038-02 | |
| Polystyrene Containers – Sterile | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64240-12 | |
| Dissecting Board | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63307-30 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 SIGMA | |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 2 | Sigma-Aldrich | GHS280 SIGMA | |
| Eosin Y solution, aqueous | Sigma-Aldrich | HT1102128 SIGMA | |
| anti-beta-amyloid | Covance, Princeton, NJ | SIG-39220 | 1:500 |
| anti-tau | Thermo Fisher Scientific | MN1020 | 1:500 |
| anti-alpha-synuclein | Abcam | ab27766 | 1:500 |
| anti-phospho-TDP43 | Cosmo Bio Co. | TIP-PTD-P02 | 1:2000 |
| Digital Camera | Any | ||
| Head Impulse Sealing machine | Grainger | 5ZZ35 |
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