Summary
Procedimientos de corte cerebrales organizados son necesarios para correlacionar fenómenos neuropsiquiátricos específicos con diagnósticos neuropatológicos definitivas. esquejes cerebrales se realizan de manera diferente en base a diversas contingencias clínico-académica. Este protocolo describe un procedimiento de corte cerebro bihemisférica simétrica para investigar las diferencias hemisféricas en patologías del cerebro humano y para maximizar las técnicas biomoleculares / neuroimagen actuales y futuras.
Abstract
Neuropatólogos, a veces, se sienten intimidados por la cantidad de conocimiento necesario para generar diagnósticos definitivos para los fenómenos neuropsiquiátricos complejos descritos en aquellos pacientes en los que se ha solicitado una autopsia del cerebro. A pesar de los avances de las ciencias biomédicas y de neuroimagen han revolucionado el campo de los trastornos neuropsiquiátricos, que también han generado la idea errónea de que las autopsias cerebrales sólo tienen un valor de confirmación. Esta falsa idea creado una reducción drástica de las tasas de autopsia y, en consecuencia, una posibilidad reducida para realizar investigaciones más detalladas neuropatológicos y amplios, que son necesarios para comprender numerosos aspectos normales y patológicas todavía desconocidas del cerebro humano. El método de estimación tradicionales de correlación entre los fenómenos observados y neuropsiquiátricos correspondiente localización / caracterización de sus posibles correlatos neurohistológicos sigue teniendo un valor innegable. En el contexto de neuropsychienfermedades psi-, el método clínico-patológica tradicional sigue siendo la mejor metodología posible (ya menudo la única disponible) para enlazar características neuropsiquiátricas únicas para sus substratos neuropatológicos correspondientes, ya que se basa específicamente en la evaluación física directa de los tejidos del cerebro. La evaluación de cerebros postmortem del cerebro se basa en procedimientos que varían entre los diferentes centros de neuropatología corte. esquejes cerebrales se llevan a cabo de una forma relativamente extensa y sistemática sobre la base de las diversas contingencias clínicos y académicos presentes en cada institución. Una metodología de corte cerebro bihemisférica anatómicamente más inclusiva y simétrica al menos debería ser utilizado con fines de investigación en neuropatología humana para investigar de manera coherente, en profundidad, en condiciones normales como patológicas con las peculiaridades del cerebro humano (es decir, la especialización hemisférica y lateralización de concreto funciones). Tal método proporcionaría un Colle más completacción de cerebros neuropathologically bien caracterizados disponibles para las técnicas biotecnológicas y de neuroimagen actuales y futuras. Se describe un procedimiento de corte cerebro bihemisférica simétrica para la investigación de las diferencias hemisféricas en patologías del cerebro humano y para uso con actuales, así como las técnicas biomoleculares / neuroimagen futuras.
Introduction
Neuropatólogos tienen el privilegio científica, el honor intelectual, y la obligación de diagnóstico para evaluar los cerebros humanos. Durante muchas décadas, las descripciones clínicas detalladas de las enfermedades del cerebro y los grandes esfuerzos Individuar han llevado a cabo sus posibles correlatos neurohistológicos en cerebros postmortem humanos. Históricamente, estos esfuerzos representan la modalidad más productiva mediante el cual las ciencias médicas y la neurología, en particular, avanzaron en la era moderna. Gracias a neuropatólogos anteriores eminentes y su dedicación, determinación, becas y sorprendente capacidad para discriminar entre los tejidos normales y anormales del cerebro (a menudo utilizando herramientas muy rudimentarias), que ahora puede investigar y enfermedades objetivo, tales como la enfermedad de Alzheimer-Perusini (injustamente única llamada la enfermedad de Alzheimer la enfermedad; APD / AD) 1, la enfermedad de Parkinson (EP) 2, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) 3, la enfermedad de Lou Gehrig-/ Esclerosis lateral Sclerosis (ALS) 4, y 5 Guam enfermedad, por mencionar algunos.
Las técnicas avanzadas de neuroimagen, como la alta definición de la tomografía computarizada (es decir, escaneo CT multicorte espiral; angiografía TC), resonancia magnética funcional y morfológica (es decir, fMRI, por difusión de resonancia magnética, MRI-tractography, etc.), por emisión de positrones (PET), de imágenes basados en ultrasonidos, y otros, sin duda han modificado nuestro enfoque general sobre la forma de diagnosticar y curar a los pacientes neurológicos y psiquiátricos. Sin embargo, aunque las técnicas de neuroimagen son capaces de visualizar el cerebro de una persona cuando vivo, no ofrecen la oportunidad, en el momento que ocurre, para analizar directamente las estructuras celulares y subcelulares altamente complejos de células, tales como las neuronas; o para visualizar, marcar y cuantificar tipos específicos de lesiones intracelulares; o para indicar con precisión su localización neuroanatómica o subregional en circuital y sub-niveles anatómicos circuitales. Por ejemplo, las técnicas de neuroimagen no pueden identificar o localizar cuerpos de Lewy (LB) en las neuronas pigmentadas de la Sustancia negra (SN), una característica patológica común asociado con PD, o marañas neurofibrilares (NFT) en la corteza entorrinal, una característica clásica de la EA y otras patologías cerebrales. investigaciones neuropatológicas combinados con microscopía digital avanzada siguen siendo insustituible para las correlaciones clinicopatológicas detalladas y, por lo tanto, para los diagnósticos definitivos.
Debido a las propiedades peculiar anatomo-funcional del cerebro humano, y en especial a su localización anatómica (es decir, dentro del cráneo, un sistema natural de protección que no permite el examen directo de su contenido), la introducción de técnicas de neuroimagen in vivo tienen los clínicos e investigadores extraordinariamente ayudado a encontrar respuestas iniciales a algunos de los misterios de este tejido complejo. Sin embargo, no hay clínica o neuroimagimetodología ng que puede sustituir a la oportunidad única para analizar directamente el tejido del cerebro durante la autopsia. Sólo el conjunto organizado, conservación y clasificación de los cerebros humanos puede permitir investigaciones directas y sistemáticas de las células neuronales y no neuronales, sus componentes subcelulares, intracelular y lesiones patológicas extracelulares, y cualquier tipo de anormalidad en el cerebro para confirmar, modificar o redefinir los diagnósticos clínicos y descubrir nuevas correlaciones clínico-patológicas. Una de las limitaciones aparentes sobre la evaluación del cerebro en la autopsia ha sido el hecho de que este procedimiento es una metodología de sección transversal. Siempre habrá un retraso entre un proceso continuo neuropatológico (clínicamente manifiesta o no) y la posibilidad, en su caso, para definirlo a nivel neurohistológica. Esto se debe principalmente a la incapacidad del cerebro humano de regenerarse. Actualmente no es posible obtener tejido cerebral in vivo sin crear permanent daños. En consecuencia, no es posible evaluar longitudinalmente y neuropathologically el mismo cerebro / persona. Sin embargo, los procedimientos bancarios cerebro estandarizados y una mayor conciencia de la donación de cerebro entre el público en general podrían contribuir en gran medida a la resolución de problemas de sincronización con el cerebro mediante el aumento de la autopsia constantemente el número de casos para recoger y analizar. De esta manera, los números más adecuadas de cerebros postmortem podrían obtenerse para definir patrones constantes de origen patológico y la progresión para cada tipo específico de lesión cerebral asociada con cada enfermedad cerebro humano. Esto requeriría la donación y la colección de tantos cerebros como sea posible de los pacientes afectados por cualquier trastorno neuropsiquiátrico, así como de los sujetos de control sanos en todas las edades. Un método posible podría ser la recogida tantas cerebros postmortem como sea posible de los centros médicos especializados y generales, como una rutina estándar. La necesidad de donaciones del cerebro se ha expresado recientementepor los que estudian la demencia y el envejecimiento normal 6. La misma necesidad se debe expresar por el campo neuropsiquiátrico como conjunto.
Por lo anterior, y por otras razones, una actualización de los procedimientos de corte cerebral en curso es necesario. Por otra parte, el cerebro procedimientos de corte debe ser universalmente estandarizado a través de diferentes centros de investigación neuropatología en todo el mundo, teniendo también en cuenta la posibilidad de emplear técnicas biotecnológicas actuales y futuros para investigar mejor y, con suerte, para entender definitivamente, las causas y mecanismos de las enfermedades cerebrales en los seres humanos.
Aquí, principalmente con fines de investigación, se describe una metodología simétrica para cerebral postmortem de corte en los seres humanos. Este procedimiento se propone recoger las regiones más cerebral que normalmente hecho y de ambos hemisferios cerebrales y el cerebelo. Un procedimiento de corte cerebro bihemisférica simétrica encaja mucho mejor con nuestro conocimiento actual de los recursos humanosneuroanatomía, neuroquímica, neurofisiología y. Este método también permite la posibilidad de analizar neuropathologically las características únicas del cerebro humano, tales como la especialización hemisférica y lateralización que están asociadas con funciones cognitivas y no cognitivas superiores o exclusivamente típicamente presente en nuestra especie. Si existen relaciones específicas entre patogénicos hemisférica especialización / lateralización y determinados tipos de lesiones cerebrales, o si un evento patogénico neuropsiquiátrico es peculiar inicialmente, predominantemente o exclusivamente asociados con un hemisferio específica y la función no se conoce actualmente. Mediante la descripción de este procedimiento de corte simétrico cerebro, nuestro objetivo es proponer un método de actualización de la disección del cerebro humano que podría ayudar a comprender mejor las condiciones normales y patológicas en un tejido altamente especializado, el cerebro. Este método también toma en consideración aquellos aspectos hemisféricos morfo-funcionales que existen sólo en los seres humanos.
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Protocol
Los procedimientos que implican tejidos humanos postmortem han sido revisados por la junta de revisión institucional y exenta en virtud de 45 CFR (Código de Regulaciones Federales).
NOTA: El protocolo describe un procedimiento de corte cerebro bihemisférica simétrica para la evaluación cerebral postmortem finalizado para los estudios neuropatológicos en los seres humanos. serán excluidos descripciones detalladas de los aparatos, instrumentos, materiales y suministros necesarios para realizar el corte cerebro humano. Materiales y suministros para las disecciones del cerebro se seleccionan según el criterio del investigador único y se basan en instrumentos de autopsia permitidos o autorizados en cada institución de investigación. El conjunto mínimo de herramientas y materiales necesarios para este procedimiento se describe en la Tabla de materiales / equipo. Procedimientos de corte específicos y precauciones para enfermedades cerebrales transmisibles sospechosos, tales como la ECJ humana, están fuera de los objetivos de este manuscrito y están disponibles de otras fuentes 7.
1. simétrica BiEl corte cerebral hemisférica
Nota: Asegúrese de que el cerebro ha recibido la fijación del tejido necesario (utilizando, por ejemplo, tamponada neutra al 10% de formalina) por un período de dos a tres semanas, dependiendo de la periagonal, metabólica (es decir, pH), y el tejido de preservación ( es decir, temperatura) condiciones. Sin embargo, para los estudios de correlación de imágenes de patología, un período de fijación más largo (> 5,4 semanas) se ha sugerido 8.
- Coloque el cerebro en una superficie plana hacia el investigador, con los polos frontales dirigidas en la dirección opuesta con respecto al investigador.
- Coloque el cerebro de una manera tal como para permitir una visualización clara y completa de todos circunvoluciones cortical y surcos del cerebro entero (Figura 1a).
- Primer vistazo a las anomalías de las meninges, las asimetrías hemisféricas macroscópicas (posibles indicadores de focal, lobar o fenómenos generalizados hemisféricas de atrofia), lesiones macroscópicas tissutal (es decir, tumors o hernia), malformaciones congénitas, anomalías de los vasos, y cualesquiera otras anomalías posibles o presentaciones inusuales de la superficie cerebral.
NOTA: Para obtener descripciones detalladas sobre cómo evaluar un cerebro humano, se refiere a los libros de texto neuropatología disponibles en el mercado y manuales de la autopsia 9,10.
2. Protocolo de Secuencia
- Enfrentar los postes frontales lejos del investigador, con los aspectos superficiales de los hemisferios (telencéfalo) que se enfrenta el investigador. Tomar tantas fotos digitales, según sea necesario en cada caso en particular para documentar posibles macro-anomalías y dar cuenta de posibles consideraciones clínico-neuroanatómicas y post-corte. Haga que un asistente de investigación tomar fotografías digitales de forma perpendicular al cerebro para capturar toda la superficie cortical (Figura 1a - c).
- Marcos pre y circunvoluciones corticales poscentral utilizando tinta o agujas de color antes de cortar el cerebro (Figura 1b NOTA: Este procedimiento facilita un reconocimiento más inmediata del motor y la corteza somatosensorial primaria después del corte.
- Girar el cerebro por 180 grados mientras que lo mantiene en la misma dirección (es decir, los polos frontales frente lejos del investigador). Con cuidado, inspeccionar la base del cerebro. Prestar especial atención a las condiciones de los sistemas cerebrovasculares (es decir, las arterias basilar y vertebral y el círculo de Willis) y los nervios craneales en el tronco del encéfalo sus niveles de salida / entrada. Manejo de los bulbos olfatorios y extensiones con especial cuidado para evitar la laceración tissutal, debido a su extrema fragilidad.
- Tomar tantas fotos digitales, según sea necesario en cada caso en particular para documentar posibles macro-anomalías y dar cuenta de posibles consideraciones clínico-neuroanatómicas y post-corte. Tiene un asistente de investigación tomar fotografías digitales de forma perpendicular al cerebro para capturar la totalidad de las superficies corticales y del tronco cerebral.
- Frente a la base del cerebro y el uso de un bisturí, cortar el tronco cerebral transversalmente a nivel de la parte superior de la protuberancia (lo más cerca posible a la base del cerebro). Inspeccione cuidadosamente el SN (es decir, por la palidez) 11 y otras estructuras vecinas 12. Tome en cuenta, posiblemente utilizando un dispositivo grabador de audio, de cualquier aspecto inusual del cerebro en comparación con un cerebro normal 13.
- Una vez más girar el cerebro en 180 grados y, con un cuchillo afilado, separar los dos hemisferios al cortar el cuerpo calloso centralmente a través de la fisura longitudinal medial y siguiendo una dirección fronto-occipital. Inspeccionar cada lado de cada hemisferio de posibles anomalías (por ejemplo, ampliaciones ventriculares, malformaciones, suavizantes de tejidos, tumores, etc.) 13. Véase la figura 2a.
- Tomar tantas fotos digitales, según sea necesario en cada caso en particular para documentar posibles anomalías y macro-para tener en cuenta las posibles consideraciones clínico-neuroanatómicas y post-corte. Tiene un asistente de investigación tomar fotografías digitales de forma perpendicular al cerebro para capturar toda la superficie cortical. Atender a cualquier característica inusual del cerebro en comparación con un cerebro normal.
- Coloque los dos hemisferios plana, acostado en sus aspectos mediales, con los lóbulos frontales de espaldas al investigador, como se muestra en la Figura 2b. Colocarlos en una forma que sus centros se tocan (también en caso de marcada asimetría hemisférica).
- Con un cuchillo afilado, cortar manualmente a través de ambos hemisferios cerebrales, a partir de los polos frontales y en movimiento hacia los polos occipital a través de toda la longitud de los hemisferios. Obtener dos series de 1 cm de espesor bloques de tejido cerebral (alrededor de 18 losas para cada hemisferio).
- Coloque las losas del cerebro en una secuencia organizada anatómica (dirección fronto-occipital) sobre una superficie plana separada. Use un surfa blancoce con una regla impresa en él para un mejor contraste al fotografiar. Mostrar las dos series de placas cerebrales de una manera anatómicamente simétrico (dirección fronto-occipital), asegurándose de que sus superficies coronales son visibles para la inspección visual directo y la fotografía digital (Figura 3a). Use superficies de corte con rejillas milimétricas impresas en ambos lados para localizar estructuras cerebrales, tamaños y posibles anomalías de una manera más precisa.
- Tomar tantas fotos digitales, según sea necesario en cada caso en particular para documentar posibles macro-anomalías y dar cuenta de posibles consideraciones clínico-neuroanatómicas y post-corte. Tiene un asistente de investigación tomar fotografías digitales de forma perpendicular al cerebro para capturar toda la superficie cortical. Tome notas (posiblemente utilizando un dispositivo grabador de audio), de cualquier aspecto inusual del cerebro en comparación con un cerebro normal.
- El uso de un escalpelo afilado, diseccionar manualmente pequeños bloques rectangulares detejido cerebral para cada región cerebral establecido. Siga el sistema de recogida región cerebral propuesto que se describe en la Tabla 1.
- Poner cada bloque de tejido en histocassettes etiquetados por separado.
NOTA: Cada bloque de tejido cerebral necesita ser cortado para ajustarse, tanto como sea posible, el volumen máximo histocassette estándar (30 x 20 x 4 mm 3). - Etiquetar los histocassettes utilizando un código de identificación de cada caso y el uso de identificadores neuroanatómicas específicas (no usar letras o números aleatorios para diferentes cerebros; más bien, utilizar siempre la misma región anatómica nombres o números correspondientes, como se muestra en la Tabla 1). Crear códigos de identificación de, por ejemplo, mediante la generación de números aleatorios o semi-aleatoria para cada caso (es decir, BRC 130, donde B se mantiene para el Cerebro, R se mantiene para el recurso, C se mantiene durante Center y 130 es una adhesión progresiva o AD160001, donde AD es sinónimo de "estudio de la enfermedad de Alzheimer", 16 es elaño en el que se realizó la autopsia (2016), y 0001 una serie de muestras de adhesión progresiva).
NOTA: Este paso es muy útil para los futuros investigadores; mantener una leyenda, y especificar el hemisferio (L = hemisferio izquierdo, R = hemisferio derecho). Utilice dos colores diferentes de histocassettes, el establecimiento de un color específico para cada hemisferio. - Tomar tantas fotos digitales, según sea necesario en cada caso en particular para documentar posibles macroanomalies y para tener en cuenta las posibles consideraciones clínico-neuroanatómicas y post-corte. Tiene un asistente de investigación tomar fotografías digitales de forma perpendicular al cerebro para capturar toda la superficie cortical. Atender a cualquier característica inusual del cerebro en comparación con un cerebro normal.
- Poner cada bloque de tejido en histocassettes etiquetados por separado.
- Tomar fotografías digitales (tantos como sea necesario o deseado) de todo el cerebro corte y los histocassettes asociados.
- Punch (por ejemplo, por Accu-punch) pequeños trozos de tejido para la extracción de ADN y análisis genéticos. Utilizarun punzón de 2 - 5 mm de diámetro.
NOTA: Por su alto contenido de material genómico, el cerebelo es la opción preferida; Sin embargo, ninguna otra región está muy bien. - Re-sumergir todas histocassettes que contienen bloques de tejido cerebral en el mismo tipo de solución de fijación (por ejemplo, 10% de formalina tamponada neutra) tal como se utiliza anteriormente hasta que el siguiente paso de procesamiento de tejidos.
- Siga los procedimientos estándar para el procesamiento de tejido fijado con formalina humano 14.
3. Un enfoque especial: Alterna fijos y congelados de corte simétrico bihemisférica
NOTA: El protocolo de corte cerebro bihemisférica simétrica se describe en la sección 2 ofrece la posibilidad de cortar losas de tejido de cerebro no fijadas, frescos (cuando esté disponible) de la misma manera sistemática y simétrica.
- Coloque todo el cerebro fresco al revés (preferentemente en una superficie de plástico en forma de bol semiesférica) para de 8 - 10 min en un congelador a -80ºC para endurecer el tejido cerebral Without provocando daño bioquímico y para facilitar el corte manual.
- Con un cuchillo afilado, cortar en ambos hemisferios en un suplente y de manera consecutiva, siguiendo el protocolo de corte cerebro se describe en la Sección 2, pero congelar y solucionar todos los demás losa (de ambos hemisferios ya lo largo de una dirección anatómica fronto-occipital).
- En este punto, no trate de cortar cada región cerebral, tal como se describe en la Tabla 1. Cortar regiones específicas del cerebro frescas de ser requerido para el ARN inmediata o la extracción de proteínas (es decir, para los estudios de genómica o proteómica) 15.
- Después del corte, inmediatamente congelar, etiqueta, y el número de cada tejido fresco. Tomar fotografías digitales de la serie completa de la losa; empacar cada losa en una sola bolsa de plástico; recoger las losas en una sola cerebro de sólo recipiente separado,; y almacenar el recipiente en un dedicado -80 ° C congelador.
NOTA: El congelador debe ser dedicado a sólo el tejido cerebral humano. Sólo más tarde se cantancortar le regiones del cerebro congelado como se requiere para cada experimento específico. - Sumergir cada otra losa de tejido escogido para la fijación (10% de formalina tamponada neutra u otro fijador) en bolsas separadas que contienen un volumen suficiente de fijador (3/1 volumen de la relación / tejido-bloque fijador). Etiquetar cada bolsa por consecutivamente la numeración de ellos siguiendo una secuencia fronto-occipital. Sellar cada bolsa, tomar fotografías digitales, y almacenarlos en un recipiente de plástico.
- Abrir las bolsas que contienen fijadores-después de 2 semanas de la fijación del tejido y cortar cada región cerebral como se describe en la Tabla 1.
4. Histostain e inmunohistoquímica
NOTA: El conjunto de regiones cerebrales reducido basadas en el esquema propuesto (Tabla 1) son suficientes para satisfacer los criterios patológicos mayoría, si no todos, basado en el consenso, actualmente fijado para el 16 AD, PD 17, demencia con cuerpos de Lewy (DCL) 18, La demencia frontotemporal (DFT / MND)
- Para cada región del cerebro y para ambos hemisferios, realice el siguiente conjunto mínimo de histostains: hematoxilina y eosina (H & E), cresil violeta (CV; si se planean estudios morfométricos cuantitativos, por ejemplo), y tinción con plata (si los análisis "exploratorias" son necesario).
- Para cada región del cerebro y para ambos hemisferios, realice el siguiente conjunto mínimo de protocolos de inmunohistoquímica: ß-amiloide (β A), Tau-fosforilada (ptau), α-sinucleína fosforilada (pα-syn), y fosforilados-TDP43 (pTDP43) , como se describe 14.
NOTA: El número total de secciones de tejido con el fin de evaluar cada cerebro después de este protocolo es de 46 (si todas las regiones cerebrales de ambos hemisferios están disponibles).
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Representative Results
Protocolo de cuerpo entero
El tiempo dedicado a un solo procedimiento de corte simétrico bihemisférica fijo cerebro se estima en 1 h (con exclusión del tiempo dedicado creación de la mesa de disección, las herramientas y las superficies de corte, etiquetado,. Etc). El tiempo requerido para una sola alterna bi-hemisférica simétrica congelado y el cerebro fijo procedimiento de corte se estima para tomar 2 h. Se puede tomar al menos entre 4 - 6 semanas para obtener los diagnósticos histopatológicos específicos para un solo cerebro / sujeto humano. Después de la extracción del cerebro después de la muerte del cráneo, un período adecuado de fijación del tejido (2 - 3 semanas por lo menos) debe ocurrir. Luego, una serie de protocolos, incluyendo el corte simétrica bihemisférica cerebro, el procesamiento de tejido, la incrustación de tejido, el bloque de corte, y la tinción inmunohistoquímica y debe llevarse a cabo. Por último, la evaluación microscópica de cada región por hemisferio, el uso de consensus-estableció los criterios y las clasificaciones de patología, la revisión de las historias clínicas, y, posiblemente, la correlación de clinicopathology, debe tener lugar antes de sacar conclusiones neuropatológicos. todo el tiempo para una evaluación completa neuropatológico cerebro humano debe ser considerado cuidadosamente en la planificación de los estudios de investigación específicos. Por otra parte, colegas médicos e investigadores de investigación, las familias de los donantes y las autoridades legales deben ser informados de la necesidad total de tiempo, la complejidad y el tiempo de equipo / esfuerzo para obtener una evaluación neuropatológico moderna.
Aunque el protocolo de corte cerebro propuesto representa un procedimiento que consume tiempo y desafiante, que en realidad representa una metodología científicamente gratificante para evaluar ampliamente cerebros humanos, tanto en condiciones sanas y patológicas. Es importante destacar que, con bastante frecuencia durante la autopsia, los cerebros recibido como sujetos de control / normales (es decir,, Los sujetos evaluados clínicamente o neurológicamente normales antes de la muerte), en realidad se pueden encontrar a ser positivo para diversas patologías cerebrales después de una evaluación precisa neuropatológico. Estos casos representan los llamados sujetos asintomáticos y preclínicos para diversas enfermedades cerebrales, especialmente las que caracterizan a las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad. Esto subraya la importancia de evaluar los cerebros recibidos como "control" de una manera muy extensa y meticulosa, sobre todo con fines de investigación. Cada vez es más evidente que los cerebros humanos / sujetos, sintomáticos o no para los trastornos neurológicos / psiquiátricos, pueden acumular múltiples patologías cerebrales (las denominadas patologías concomitantes) durante el envejecimiento 23,24. Curiosamente, estas lesiones cerebrales concomitantes son bioquímicamente idénticos a los encontrados en pacientes con enfermedades que se manifiestan clínicamente y se localizan en las mismas regiones anatómicas, así (PARS, Artag, CARROS) 25-27. estos more hallazgos recientes (posible sólo a través de las investigaciones de la autopsia) tienen una extraordinaria importancia para el estudio de los efectos del envejecimiento sobre el cerebro humano.
La Tabla 2 y la Figura 4 describen algunos datos semicuantitativos preliminares obtenidos usando un procedimiento de corte de cerebro bihemisférica simétrica se realiza en una serie de cerebros humanos recogidos en nuestro banco de cerebros. Estos datos preliminares muestran que la mayoría de los cerebros recibidos como "normal" o "control" de los sujetos mayores eran en realidad no sólo positivo para las placas neuríticas A-beta y ovillos neurofibrilares de tau-tau-(NFT), como ya se conoce 28-32, sino también que las cargas de las placas neuríticas a-beta insolubles fueron mayores en la corteza entorrinal y el hipocampo izquierdo en comparación con la corteza entorrinal y el hipocampo derecho del mismo cerebro. Los cerebros fueron evaluados utilizando CERAD 33 y 34 Braak puesta en escena systems, que evalúan respectivamente beta placas neuríticas y A-tau-NFT. La predilección del hemisferio izquierdo observada para β insolubles Una patología también estaba presente, aunque sólo como una tendencia, en la mayoría de las demás regiones del hemisferio izquierdo en comparación con el hemisferio derecho. La relevancia de estos preliminar hallazgo bihemisférica es que los cerebros analizados eran todos de una cohorte de la autopsia en la población general. Todos los sujetos fueron hospitalizados, de hecho, por causas no neurológicas / psiquiátricas y murieron en diferentes hospitales generales de la comunidad por razones no neurológicas. El hecho de que los cerebros analizados eran de una población general de la autopsia-cohorte sesgos de selección minimizada posiblemente presente al analizar sólo los cerebros de los centros neurológicos / demencia especializados. Véase también la recomendación de NINDS 6. Nuestros hallazgos son preliminares (4 de cada 46 disponibles cerebros "control") y necesitan ser confirmados en una escala mucho más grande. Sin embargo, estos hallazgo novedosos, en caso de confirmarse, sugieren un posible fenómeno de la predilección hemisférica para la acumulación y la progresión de la patología de la EA, o una patología beta por lo menos. Tipos similares de predilecciones hemisféricas patológicos muy posiblemente podría estar asociada con cada tipo específico de trastorno neuropsiquiátrico o neurodegenerativa. Además, mediante la combinación de procedimientos de corte cerebrales bi-hemisférica simétricas con métodos de cuantificaciones celulares y lesión precisas (es decir, estereología imparcial), podría ser posible medir la proporción de normal a condiciones patológicas, así como la relación de la pérdida neuronal a restaurador / fenómenos de neuroplasticidad que pueden estar presentes en los seres humanos en relación con un hemisferio y función específica. Curiosamente, a pesar de la predilección hemisférico para cada tipo principal de la patología cerebral (β-amiloide, tau, LB, TDP43, FUS, etc.) Aún no se ha establecido, la neuroimagen funcional 34, 36 neuropsicológica p>, y anatómica microestructural análisis 37,38 parecen estar en línea con nuestros resultados preliminares. Esto refuerza la hipótesis de una posible predilección hemisférica para cada tipo diferente de patología cerebral y la enfermedad relacionada.
Figura 1. Evaluación Preliminar del cerebro antes de cortar bihemisférica cerebro. Esta figura muestra los diferentes aspectos superficiales de un cerebro humano después de 2 semanas de la fijación en 10% de formalina tamponada neutra. En una secuencia de las agujas del reloj, los aspectos superiores de los cerebros (a, b) son seguidas por las observaciones en la base del cerebro, que incluyen las inspecciones del cerebelo (c), el tronco cerebral y los nervios craneales (d), y los bulbos olfativos y extensiones (e).02 / 54602fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Cortar bihemisférica cerebro humano. Fijados con formalina cerebro humano colocado sobre una superficie plana para la inspección ocular (a). La línea roja indica la fisura longitudinal medial. La colocación de los dos hemisferios cerebrales después de un corte central a través de la fisura longitudinal medial (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Procedimientos de corte bihemisférica cerebro. Esta figura muestra algunos de los pasos de el protocolo de corte cerebro humano bihemisférica. Después de la eliminación de todas las losas del cerebro (para ambos hemisferios) y siguiendo una dirección fronto-occipital (a), cada región cerebral establecido para recoger (Tabla 1) será cortado en bloques de tejido dimensiones histocassette estándar de ajuste (b - e). Bloques de tejido de cerebelo necesitarán histocassettes más grandes (ver el verde [hemisferio cerebeloso derecho] y azul [hemisferio cerebeloso izquierdo]; eyf). Cassettes blancos son para las estructuras de la mediana, tales como el bulbo raquídeo, la médula espinal, etc. (E - g). Los histocassettes finales obtenidos después del protocolo de corte cerebro humano bihemisférica y que contienen bloques de tejido cerebral de cada región neuroanatomical enumerados en la Tabla 1 se vuelven a sumergir en el mismo tipo inicial de solución de fijación (10% de formalina tamponada neutra) (f - g).tp_upload / 54602 / 54602fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los cortes de tejido cerebral de cada hemisferio de colores para los diferentes antígenos mediante técnicas de inmunohistoquímica. (A) Esta figura muestra una serie de secciones de tejido de ambos hemisferios del cerebro humano mismo. Cada serie de secciones bi-hemisféricas Inmunomarcamos de amiloide β, fosforilada-tau, y fosforilados α-sinucleína (α-syn), cuya positividad se asocia con las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad comunes como el Alzheimer y el Parkinson. La imagen muestra un ejemplo representativo de la cantidad total posible de secciones para analizar utilizando el protocolo de corte cerebro simétrica bihemisférica propuesto. LH = hemisferio izquierdo, HR = hemisferio derecho. ( B) Estas imágenes muestran muestras de lesiones cerebrales comunes relacionadas con la edad, como se observa bajo el microscopio después de usar protocolos de inmunohistoquímica específicas de placas beta amiloides neuríticas, los ovillos neurofibrilares de tau-y α-sinucleína (α-syn) -positivo cuerpos de Lewy. En la esquina inferior derecha de cada imagen es el tipo de objetivo utilizado (5X, 20X, 40X y) para ampliar y precisa identificar cada tipo de lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Esquema bihemisférica corte. Esta tabla muestra el área anatómica única de diseccionar, tanto en los hemisferios izquierdo y derecho de cada cerebro. El corte simétrica bihemisférica se puede hacer en cerebros frescos y fijos.rce.jove.com/files/ftp_upload/54602/54602table1.xlsx">Please~~MD~~aux clic aquí para descargar este archivo.
Tabla 2. Resultados preliminares obtenidos por medio de corte bihemisférica cerebro humano. Esta tabla muestra los resultados preliminares obtenidos a través de un procedimiento de corte cerebro humano simétrica bihemisférica realizado en cuatro cerebros humanos de sujetos clínicamente normales, de edad avanzada. Los datos muestran que dos regiones cerebrales (la corteza entorrinal y el hipocampo) participan constantemente y temprano en la acumulación de placas neuríticas amiloide beta y tau-NFT. Este tipo de lesión se considera que es la más probable AD causando proceso patogénico. f = mujer; m = masculina. Los números entre paréntesis representan la edad (en años) de cada sujeto una autopsia. Un código colorimétrico semi-cuantitativo para la visualización rápida de posibles hemisse ha utilizado a través de las diferencias atmos- tipos de lesiones, niveles de severidad, y localizaciones anatómicas entre los diferentes sujetos de mayor edad. Neg = negativo (verde); Escasos = 1 - 2 lesiones (amarillo); Moderado = 3 - 6 lesiones (naranja); Frecuente => 6 lesiones (rojo). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este método de corte cerebro se puede adaptar a las necesidades específicas de cada laboratorio de neuropatología (por ejemplo, mediante la reducción del número de regiones cerebrales para evaluar para cada hemisferio) al tiempo que conserva el procedimiento de corte simétrica bihemisférica como una de sus características principales. Este protocolo propuesto podría ser utilizado para procedimientos de rutina (centros neuropatológicos orientadas a la investigación) o sólo cuando sea necesario (estudios específicos de orientación clínica). Se puede utilizar selectivamente sólo para determinados tipos de investigaciones (es decir, inmunohistoquímica) o análisis moleculares (análisis es decir, genómica o proteómica). Desde un punto de vista técnico, es útil mencionar que algunas diferencias patológicas (especialmente en inmunohistoquímica) podría deberse a las posibles variaciones en las intensidades de artefactos inmunohistotinción. Estos pueden reducirse al mínimo mediante la utilización de máquinas de tinción automática, lo que reduce drásticamente la posibilidad de artefactos de tinción efectos unand variaciones. Actualmente es posible, de hecho, para reducir al mínimo tecnológicamente más de los factores de confusión debido a los artefactos técnicos mediante el uso de máquinas de tinción robóticos fiables. Por lo tanto, los resultados comparables se pueden obtener cuando se evalúa, por ejemplo, dos hemisferios cerebrales a partir de la misma materia, o varios conjuntos de ambos hemisferios de varios sujetos.
Además, durante los últimos años, el número de lesiones cerebrales reconocidas en el cerebro humano ha sido aumentado enormemente 39. Estos nuevos tipos de lesiones cerebrales crean un mayor riesgo de que los cerebros anteriores clasificados como normales o de control en realidad no lo son. La mejora de las técnicas de inmunohistoquímica y los nuevos descubrimientos neuropatológicos podría sugerir una reevaluación sabia y periódica de todos los cerebros previamente en bancos como "control", ya que los casos de "pseudo-control" o "control falso" cerebros son siempre posibles 40.
La principal limitación deeste método consiste en la cantidad de tiempo y experiencia (conocimiento anatómico y patológico) necesaria para llevarla a cabo. Por otra parte, los estudios con el objetivo de analizar los aspectos genómicos y proteómicos del cerebro humano requieren un equipo banco de cerebros preparado para gestionar, de una manera rápida, todos los procedimientos de donación de cerebro, disposiciones legales de consentimiento, mudanzas cerebrales y de corte inmediata para los procedimientos de congelación o de fijación. Normalmente, estas instalaciones y el personal están disponibles sólo en centros académicos o de investigación especializados. Además, mientras que los procedimientos de corte detalladas sin duda puede ayudar a comprender mejor los posibles orígenes anatómicos y difusión de las vías de cada enfermedad del cerebro, también a confiar siempre a la cantidad de información clínica detallada disponible para cada caso con el fin de realizar estudios de correlación clínico-patológicos exactos. Uno de los mejores usos para este protocolo y, a continuación, habrá en el contexto de los estudios longitudinales clínico-patológicos, que son a menudo el mejor tipo de investigation para recoger más detallada clínicos, de imagen, genéticos, ambientales, y otros tipos de datos para correlacionar, microscópica, y los hallazgos de la autopsia de inmunohistoquímica con los datos de orina recogidas.
Sorprendentemente, las investigaciones neuropatológicas analizar, clasificar, o cuantificar el amplio espectro de lesiones neuropatológicas en relación con la función hemisférica o la localización son extremadamente raros 41-44. Sin embargo, parece que los tiempos y las tecnologías están listos para desafíos sin precedentes en los estudios de neuropatología humanos. La razón principal para proponer un procedimiento de corte cerebro bihemisférica simétrica era respetar las asimetrías funcionales peculiares (anatómicas o patológicas) de los cerebros humanos. Con demasiada frecuencia, más por tradición ciegamente aceptado que probada la razón científica, solo hemisferio (a menudo seleccionado estocásticamente) se ha fijado para la evaluación neuropatológico o inmunohistoquímica, mientras que el otro ha sido congelado para su posible molecularo análisis bioquímico. Especialmente cuando se estudia el cerebro humano, la selección casual del hemisferio cerebral y el consiguiente corte de contener los riesgos potenciales en términos anatómicos y puede causar posibles sesgos de selección fisiopatológicos. Mientras que, por razones prácticas, la fijación de un hemisferio y la congelación de lo contrario es razonable en un entorno no-investigación, no es sostenible por más tiempo en el contexto de la investigación neuropatológico de los trastornos neuropsiquiátricos. Especialmente en el momento actual, cuando las cantidades consistentes de "in vivo" de neuroimagen y la información genética están potencialmente disponibles en la autopsia, un procedimiento de corte cerebro bi-hemisférica simétrica con una evaluación neuropatológico extensa correspondiente se debe realizar de forma rutinaria. La especialización hemisférica del cerebro humano se ha demostrado en muchas funciones cognitivas, tales como el lenguaje, la destreza, y las emociones (es decir, la activación diferencial en la amígdala izquierda y derecha), a nombre de afew. Esta especialización hemisférica y lateralización de las funciones cognitivas y no cognitivas superiores, que suelen diferenciar y caracterizar a los humanos de otras especies de mamíferos y no mamíferos, deben considerarse cuidadosamente en términos de la neuropatología. Que existe, en los seres humanos, una predilección hemisférico de procesos patológicos específicos en cuanto a la neurodegeneración, neuroinflammatory respuesta, y las capacidades neuroreparative no se conoce todavía, y ha sido muy raramente investigado 40-43. Aunque las imágenes soporta bien sabido fisiológica y características específicas-hemisféricas clínicamente, es sorprendente cómo se sabe mucho menos en términos de posibles diferencias neuropatológicos. Proponiendo un cerebro simétrico bihemisférica procedimiento de corte, o la alternancia más sofisticado congelado y fija el protocolo de corte cerebro bihemisférica simétrica, que tuvo como objetivo describir un método que podría ayudar a descubrir los aspectos peculiares del cerebro humano durante sano y pathologicondiciones de cal, como la base de sus características únicas de especialización y lateralización hemisférica.
Uno de los pasos más críticos de este protocolo consiste en la necesidad de tener el cerebro configuración, los materiales y las herramientas inmediatamente disponible de corte en cualquier momento, ya que es muy raro que ser capaz de anticipar cuando un cerebro, en particular, una muestra fresca, es llegando. Otro paso importante de este protocolo consiste en la destreza manual necesaria para el corte de cerebro fresco y fija. Aunque se trata de un tejido idéntico, las dos condiciones físico-químicas (frescos y tejidos fijo) hacen que la adquisición de conocimientos para el cerebro cortando un componente esencial y fundamental del protocolo. Por otra parte, el conocimiento neuroanatómica (especialmente para los procedimientos cerebrales frescas) supone periodos de formación académicas específicas. Para los procedimientos cerebrales frescas, por otra parte, es imprescindible y fundamental para avanzar tan rápido como sea posible y para mantener la precisión y la integridad de la tissumi. Esto conservará toda la información biológica contenida en el tejido, así como la posibilidad de realizar futuras investigaciones que requieren material fresco congelado (RNA, proteínas, etc.).
El método cerebro simétrica congelado y fija doble corte representa el mejor compromiso posible para obtener tanto fresco congelado (útil para genética, molecular, y analiza microdisección) y fija (útil para la neuroanatomía, inmunohistoquímica, y la PCR in situ analiza) secciones de tejido cerebral de áreas contiguas de regiones cerebrales específicas y de ambos hemisferios. Esta metodología representa una fuente de análisis comparativos obtenidos a través de diferentes técnicas moleculares y de imagen usando exactamente la misma región del cerebro / área (región sub-anatómico, núcleos de materia gris, grupos de células, dendríticas / espinas, etc.). Un procedimiento de corte cerebro simétrica congelado y fija doble permitiría una para obtener secciones de tejido cerebral contiguos de la misma neuroanatomical área. Esto permitiría su análisis usando luz brillante, la fluorescencia y microscopía electrónica (empleando diferentes procedimientos para cada tipo de microscopía). Técnicas de extracción de ARN / ADN / proteínas también se podrían aplicar, a través de microdisecciones captura por láser, por ejemplo, a la misma región exacta o grupo de neuronas, células, vasos, etc. Este fijos y congelados técnica de corte cerebro bihemisférica simétrica, conjuntamente con los sistemas informáticos de seguimiento de muestras y refrigeración alterna, parece ofrecer un enorme potencial para la aplicación de los futuros estudios biomoleculares en curso y potenciales.
Un enfoque alternativo para el procedimiento de corte de cerebro descrito podría ser el corte de la sección transversal de cada superficie hemisférica entero. Sin embargo, este método requiere herramientas más especializados y costosos (por ejemplo, un microtomo más grande, las diapositivas de mayor tamaño, etc.) Que las utilizadas normalmente en la mayoría de los laboratorios de neuropatología. En lugar de ello, nuestro método propone una más extensa colección de regiones cerebrales de ambos hemisferios, cortando esas regiones cerebrales individuales utilizando herramientas disponibles normalmente (y asequible) en la mayoría de los laboratorios de investigación de neuropatología.
El corte cerebro propuesto se puede combinar con métodos precisos de cuantificación histológica, celular y subcelular (es decir, para estereología imparcial) 45-47. estudios neuropatológicos cuantitativos son de importancia primordial, y la necesidad, ya que los datos cuantitativos sobre los circuitos, núcleos, neuronas, células no neuronales, anormalidades del sistema vascular, y la pérdida neuronal relacionados con lesiones patológicas específicas se carece de la mayoría en los seres humanos. Recientemente, cuantificaciones precisas de lesiones neuropatológicas específicas obtenidas mediante el empleo de protocolos Estereología imparciales comenzaron a arrojar luz sobre las posibles relaciones nuevas entre la acumulación de una lesión intraneuronal específica (es decir, cuerpos de Lewy), la pérdida neuronal (es decir, la pérdida de la sustancia negra),y las manifestaciones clínicas (es decir, los síntomas parkinsonianos) en el análisis de los cerebros humanos 48. La determinación de las cantidades relativas de neuronas funcionales residuales o la reacción de las células neuroglia necesario, por ejemplo, para contrastar, demorar o compensar los procesos neuropatológicos específicos, podría ayudar a comprender mejor las capacidades de respuesta y de adaptación del cerebro humano adulto, en concreto durante el envejecimiento. cambios volumétricos neuronales, neuritas, las cargas de la lesión, las longitudes de fibra, espesor cortical, relaciones de espesor capa cortical, y otros aspectos posibles morfométricos son de especial interés, ya que su relevancia fisiopatológica probable a nivel celular y subcelular en el contexto de enfermedades neuropsiquiátricas o procesos neurodegenerativos aún no se ha dilucidado completamente 49. Número, tamaño, longitud de fibras o axones, los volúmenes de materia gris y blanca y proporciones, analiza capa cortical, etc., son todos los parámetros medibles precisamente graciasa la combinación de fórmulas estadísticas específicas y algoritmos geométricos 50. ecuaciones geométricas y fórmulas estadísticas han sido elegantemente integrado con los sistemas computarizados de alta sensibilidad, micrométricos de coordinación tridimensional (sistemas motorizados Estereología motorizados) para la cuantificación histológica de casi cualquier tipo de medición bio-tissutal.
El conjunto de neuroanalyses disponibles ahora para estudiar los tejidos del cerebro humano no era imaginable hace unos años, y es muy probable que no habrá nuevos avances en un futuro próximo. La caracterización detallada de los cerebros de hoy de los pacientes, los sujetos clínicamente asintomáticos, y los individuos normales será increíblemente acelerar los descubrimientos del mañana y la individualización de las terapias para la mayoría de las enfermedades neuropsiquiátricas y neurodegenerativas. En el contexto de las enfermedades complejas, como las enfermedades neuropsiquiátricas, incluso las actuales técnicas de neuroimagen sofisticadas no puedenofrecer los niveles más altos de definición celular y la información biológica que las técnicas modernas neuropatológicos puede. Además, sólo las imágenes de tejidos cerebrales estáticas ofrecen la oportunidad de realizar estudios cuantitativos imparciales sobre un único grupo de células o lesiones neuronales o la posibilidad de cortar neuronas individuales (es decir, la microdisección por láser) para extraer los materiales genéticos o proteínas para los análisis de espectroscopía de masas, para ejemplo 51 .La metodología de corte cerebro bihemisférica simétrica se podría aplicar, entre otros, a los estudios especiales, tales como los que investigan los cerebros de gemelos idénticos. En esta situación única experimentum naturae, el potencial para comprender mejor las posibles relaciones existentes entre la especialización hemisférica / lateralización y la cognición / patología es impresionante. Los diferentes niveles de patológica simetría / asimetría hemisférica relacionada con el podrían explicarse más fácilmente en términos de un dilema naturaleza / crianza. Por ejemplo, un simétricoprocedimiento de corte cerebro bihemisférica podría llevarse a cabo en los cerebros de los gemelos idénticos frente a los mellizos 52-56.
Una técnica de corte cerebro bihemisférica simétrica también se debe aplicar a los estudios del desarrollo neurológico humanos 57. Altamente datos informativos podrían ser recogidos por los aspectos específicos de neuronas relacionadas hemisférico y el tiempo de maduración de la glía, fenómenos de neuroplasticidad del desarrollo y capacidades neuroreparative del sistema nervioso central durante la infancia y la niñez. Un procedimiento de corte cerebro bihemisférica simétrica podría contribuir en gran medida a definir mejor la naturaleza dilema / crianza para la formación rasgo de la personalidad y los cambios de comportamiento durante el desarrollo normal, el envejecimiento normal, y como parte de las manifestaciones clínicas iniciales de "esporádica" neurodegenerativa procesa 58.
El enfoque clásico clinicopathological realiza a través de procedimientos de corte cerebrales estructurados no es unatécnica histórica, pero sigue siendo una herramienta válida y útil de diagnóstico y la investigación. Especialmente en el momento actual, cuando una cantidad impresionante de información clínica y biológica están potencialmente disponibles en la autopsia, la combinación de casos clínicamente bien caracterizados, los datos de neuroimagen, y la información genética / molecular con neuropatológicos análisis detallados modernos / cuantitativos podría representar una cifra sin precedentes "derecho -match "en la historia de la neurociencia. antemortem combinado y las investigaciones post mortem pueden aclarar enormemente las bases tissutal / funcionales neuronales y de las enfermedades neuropsiquiátricas y arrojar luz sobre los mecanismos etiopatogénicos exactas de estos trastornos, teniendo también en cuenta los posibles factores hemisféricos que no fueron consideradas específicamente antes. Los autores son conscientes de que la técnica de corte cerebro bihemisférica simétrica propuesto es tiempo y financiación de consumo, pero los esfuerzos similares a las realizadas para el avance de la neuroimagen debepor hacer en el campo de la investigación, así neuropatología. Más armonizados y las actividades bancarias cerebro estructurados no será más caro que la construcción o la compra de máquinas de resonancia magnética, con posibles resultados científicos que no serían menos gratificante que los obtenidos por los estudios de neuroimagen.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copy of signed informed consent allowing autopsy and brain donation for research use. | |||
| Detailed clinical history of the subject which should include a detailed description of any neurologic and psychiatric symptoms and signs. | |||
| Medical or nonmedical video-recordings when available (especially useful in movement disorders field). Next-of-kin’s consent required. | |||
| Neuroimaging, neurophysiology, neuropsychiatric and assessment or clinicometric scales. | |||
| Genetic and family history data. Genetic reports review, if neurogenetic diseases were diagnosed. | |||
| Histology Container | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64233-24 | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-142 (orange) | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-132 (navy) | |
| Knife Handles and Disposable Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62560-04 | |
| Long Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62561-20 | |
| Disposable Blade Knife Handles | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72040-08 | |
| Scalpel Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72049-22 | |
| Accu-Punch 2 mm | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 69038-02 | |
| Polystyrene Containers – Sterile | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64240-12 | |
| Dissecting Board | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63307-30 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 SIGMA | |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 2 | Sigma-Aldrich | GHS280 SIGMA | |
| Eosin Y solution, aqueous | Sigma-Aldrich | HT1102128 SIGMA | |
| anti-beta-amyloid | Covance, Princeton, NJ | SIG-39220 | 1:500 |
| anti-tau | Thermo Fisher Scientific | MN1020 | 1:500 |
| anti-alpha-synuclein | Abcam | ab27766 | 1:500 |
| anti-phospho-TDP43 | Cosmo Bio Co. | TIP-PTD-P02 | 1:2000 |
| Digital Camera | Any | ||
| Head Impulse Sealing machine | Grainger | 5ZZ35 |
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