Summary
Organisiert Gehirn Schneidverfahren sind erforderlich, spezifische neuropsychiatrischen Phänomene mit endgültiger neuropathologischen Diagnosen zu korrelieren. Gehirn-Stecklinge werden unterschiedlich durchgeführt auf der Grundlage verschiedener klinisch-akademischen Eventualitäten. Dieses Protokoll beschreibt ein symmetrisches Verfahren bihemispheric Hirnschnitt hemisphärischen Unterschiede in der menschlichen Hirnerkrankungen zu untersuchen und zu aktuellen und zukünftigen biomolekularen / bildgebende Verfahren zu maximieren.
Abstract
Neuropathologen, zu Zeiten, fühlen sich von der Menge an Wissen eingeschüchtert benötigt definitive Diagnosen für komplexe neuropsychiatrische Phänomene bei Patienten beschrieben, zu erzeugen, für die ein Gehirn Autopsie angefordert wurde. Obwohl die Fortschritte der biomedizinischen Wissenschaften und bildgebenden Verfahren der neuropsychiatrischen Bereich revolutioniert haben, haben sie erzeugt auch die irreführende Vorstellung, dass Gehirn Autopsien nur einen Zweitwert haben. Diese falsche Idee schuf eine drastische Reduzierung der Autopsie Raten und damit eine reduzierte Möglichkeit detaillierter und umfangreiche neuropathologische Untersuchungen durchzuführen, die zahlreichen normalen und pathologischen Aspekten noch unbekannt des menschlichen Gehirns zu verstehen, notwendig sind. Die traditionelle folgernd Methode der Korrelation zwischen den beobachteten neuropsychiatrischen Phänomene und entsprechenden Lokalisierung / Charakterisierung ihrer möglichen neurohistologische Korrelate weiterhin einen unbestreitbaren Wert zu haben. Im Kontext der neuropsychiiatrischen Krankheiten, ist die traditionelle Methode clinicopathological noch die bestmögliche Methode (und oft auch die einzige verfügbare) eindeutige neuropsychiatric Funktionen auf die entsprechenden neuropathologischen Substrate zu verbinden, da sie speziell auf die direkte körperliche Untersuchung von Hirngewebe beruht. Die Beurteilung der postmortalen Gehirn basiert auf Gehirn Verfahren Schneiden, die über verschiedene Neuropathologie Zentren variieren. Gehirn-Stecklinge werden in einer relativ umfangreichen und systematischen Art und Weise auf der Grundlage der verschiedenen klinischen und akademischen Eventualitäten, die in jeder Einrichtung durchgeführt. Eine anatomisch inklusiven und symmetrische bi-hemisphärische Gehirnschnitt Methodik sollte zumindest für die Forschung in der menschlichen Neuropathologie verwendet werden , um spezifische kohärent zu untersuchen, in der Tiefe, normalen und pathologischen Bedingungen mit den Besonderheiten des menschlichen Gehirns (dh hemisphärische Spezialisierung und lateralization Funktionen). Ein solches Verfahren einen umfassen colle würdection von neuropathologisch gut charakterisierte Gehirne für aktuelle und zukünftige biotechnologische und bildgebenden Verfahren. Wir beschreiben eine symmetrische bi-hemisphärische Gehirnschneidverfahren für die Untersuchung der hemisphärischen Unterschiede in der menschlichen Hirnerkrankungen und für die Verwendung mit aktuellen sowie zukünftigen biomolekularen / bildgebende Verfahren.
Introduction
Neuropathologists haben die wissenschaftliche Privileg, intellektuelle Ehre und diagnostische Verpflichtung menschliche Gehirn zu beurteilen. Seit vielen Jahrzehnten detaillierte klinische Beschreibungen von Erkrankungen des Gehirns und großen Anstrengungen, um ihre mögliche neurohistologische Korrelate im menschlichen Gehirn Obduktion durchgeführt wurden, um individualisieren. Historisch gesehen, repräsentiert diese Bemühungen die produktivste Modalität, durch die die medizinischen Wissenschaften und Neurologie insbesondere in der modernen Ära fortgeschritten. Dank vorherigen eminent neuropathologists und ihre Hingabe, Entschlossenheit, Wissenschaft und erstaunliche Fähigkeit zwischen normalen und abnormen Hirngewebe zu unterscheiden (oft sehr rudimentären Werkzeuge verwenden), können wir jetzt untersuchen und zu bekämpfenden Krankheiten wie Alzheimer-Perusini-Krankheit (zu Unrecht nur genannt Alzheimer Krankheit; APD / AD) 1, Parkinson-Krankheit (PD) 2, Creutzfeldt-Jakob - Krankheit (CJD) 3, Lou-Gehrig-Krankheit / amyotrophische Lateral Sclerosis (ALS) 4 und Guam - Krankheit 5, um nur einige zu nennen.
Erweiterte Techniken der bildgebenden Verfahren, wie zum Beispiel hochauflösende Computertomographie (dh Multisektions Spiral - CT, CT - Angiographie), morphologische und funktionelle Magnetresonanztomographie (dh fMRI, diffusions MRI, tractography-MRI, etc.), Positronen - Emissions - Tomographie (PET), ultraschallbasierte Bildgebung, und andere haben sicherlich unsere allgemeinen Ansatz geändert, wie neurologische und psychiatrische Patienten zu diagnostizieren und zu heilen. Nichtsdestoweniger, obgleich bildgebender Verfahren in der Lage, das Gehirn eines Menschen zu visualisieren, wenn alive, sie nicht die Möglichkeit bieten, bei dem auftretende Moment, um direkt die hoch komplizierten zellulären und subzellulären Strukturen der Zellen, wie Neuronen zu analysieren; oder zu visualisieren, zu kennzeichnen, und bestimmte Arten von intrazellulären Läsionen zu quantifizieren; oder genau zu zeigen, ihre neuroanatomische oder subregionalen Lokalisierung an circuital und sub-circuital anatomischen Ebenen. So kann beispielsweise bildgebende Verfahren nicht identifizieren oder Lewy-Körperchen (LB) in pigmentierten Neuronen der Substantia Nigra (SN), ein gemeinsames pathologisches Merkmal lokalisieren mit PD assoziiert, oder Neurofibrillen (NFT) im entorhinalen Kortex, ein klassisches Merkmal von AD und andere Hirnerkrankungen. Neuropathological Untersuchungen mit modernsten digitalen Mikroskopie kombiniert sind immer noch unersetzbar für detaillierte klinisch-pathologischen Korrelationen und damit für die endgültige Diagnosen.
Wegen der eigentümlichen anatomo funktionellen Eigenschaften des menschlichen Gehirns und insbesondere seiner anatomischen Lokalisation (das heißt, innerhalb des Schädels, ein Naturschutzsystem , das nicht die direkte Prüfung ihres Inhalts nicht erlaubt), die Einführung von in vivo bildgebenden Verfahren haben außerordentlich geholfen, Kliniker und Forscher erste Antworten auf einige der Geheimnisse dieses komplexen Gewebe zu finden. Allerdings gibt es keine klinischen oder neuroimaging Methodik, die die einmalige Gelegenheit, ersetzen kann, um direkt Hirngewebe während einer Autopsie zu analysieren. Nur die organisierte Sammlung, Erhaltung und Kategorisierung von menschlichen Gehirnen können direkte und systematische Untersuchungen von neuronalen und nicht-neuronalen Zellen, deren subzelluläre Bestandteile, intra- und extrazellulären pathologischen Veränderungen erlauben, und jede Art von Anomalie im Inneren des Gehirns, um zu bestätigen, zu ändern oder klinischen Diagnosen neu zu definieren und neue klinisch-pathologischen Korrelationen zu entdecken. Einer der offensichtlichen Grenzen der Beurteilung des Gehirns bei der Autopsie wurde über die Tatsache, dass dieses Verfahren eine Schnittmethodik ist. Es wird immer eine Verzögerung zwischen einem laufenden neuropathologischen Prozess sein (klinisch manifestiert oder nicht) und die Möglichkeit, falls überhaupt, ist es am neurohistologischer Ebene zu definieren. Dies ist vor allem auf die Unfähigkeit des menschlichen Gehirns, sich zu regenerieren. Es ist derzeit nicht möglich , Hirngewebe in vivo zu erhalten , ohne die Schaffung permanent Schaden. Folglich ist es nicht möglich, in Längsrichtung und neuropathologisch die gleiche Gehirn / Person zu beurteilen. Allerdings könnte standardisierte Gehirn Bankverfahren und ein erhöhtes Bewusstsein für die Gehirnspende in der breiten Öffentlichkeit in hohem Maße zur Auflösung von Gehirn-Autopsie Timing-Probleme beitragen, indem sie konsequent die Zahl der Fälle zu erhöhen zu sammeln und zu analysieren. Auf diese Weise könnte eine ausreichende Anzahl von post mortem Gehirnen erhalten werden konstanten Muster pathologischer Herkunft und Entwicklung für jeden spezifischen Typ von Hirnläsion mit jedem menschlichen Gehirnerkrankung assoziiert zu definieren. Dies würde erfordern, Spende und Sammlung von so viele Gehirne wie möglich von Patienten durch eine neuropsychiatrische Störung betroffen sind, sowie von gesunden Kontrollpersonen in allen Altersgruppen. Eine mögliche Methode könnte so viele postmortale Gehirne wie möglich von allgemeinen und spezialisierten medizinischen Zentren als Standard Routine werden zu sammeln. Die Notwendigkeit für die Gehirn Spenden wurde kürzlich zum Ausdruck gebrachtvon denen , die Demenz und der normalen Alterung 6 studieren. Die gleiche Notwendigkeit sollte von der neuropsychiatrischen Feld als Ganzes ausgedrückt werden.
Für die oben genannten und aus anderen Gründen, ist ein Update der laufenden Gehirn Schneidverfahren erforderlich. Darüber hinaus sollte über sein Verfahren Gehirn Schneiden verschiedener Neuropathologie Forschungszentren auf der ganzen Welt allgemein standardisiert, auch die Möglichkeit, in Berücksichtigung aktuelle und zukünftige biotechnologische Techniken zu verwenden, um besser zu untersuchen und, hoffentlich, um endgültig zu verstehen, die Ursachen und Mechanismen von Hirnerkrankungen in Menschen.
Hier hauptsächlich für Forschungszwecke beschreiben wir eine symmetrische Methode zur postmortalen Hirn beim Menschen zu schneiden. Dieses Verfahren schlägt mehr Hirnregionen zu sammeln, als dies normalerweise getan und von beiden zerebralen Hemisphären und des Kleinhirns. Eine symmetrische bi-hemisphärische Gehirnschneidverfahren passt viel besser mit unseren derzeitigen Kenntnissen der menschlichenNeuroanatomie, Neurochemie und Neurophysiologie. Diese Methode ermöglicht es auch die Möglichkeit, die einzigartigen Eigenschaften des menschlichen Gehirns, wie hemisphärische Spezialisierung und Lateralisierung neuropathologisch zu analysieren, die mit höheren kognitiven und nicht-kognitiven Funktionen in der Regel oder ausschließlich in unserer Spezies zugeordnet sind. Ob es bestimmte pathogene Beziehungen zwischen hemisphärischen Spezialisierung / lateralization und bestimmte Arten von Hirnläsionen oder ob eine besondere neuropsychiatric pathogenetische Ereignis ist anfänglich vorwiegend oder ausschließlich mit einem bestimmten Halbkugel und der Funktion zugeordnet ist derzeit nicht bekannt. Durch die Beschreibung dieses symmetrischen Gehirn Schneidverfahren streben wir eine aktualisierte Methode des menschlichen Gehirns Dissektion vorzuschlagen, die besser helfen könnte, zu normalen und pathologischen Bedingungen in einem hoch spezialisierten Gewebe zu verstehen, das Gehirn. Diese Methode berücksichtigt auch diese morphologisch-funktionellen hemisphärischen Aspekte, die beim Menschen nur existieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verfahren postmortalen menschlichen Geweben beteiligt wurden von der Institutional Review Board überprüft und unter 45 CFR (Code of Federal Regulations) befreit.
HINWEIS: Das Protokoll beschreibt einen symmetrischen bihemispheric Gehirn Schneidverfahren für post mortem Gehirn Beurteilung für neuropathologische Untersuchungen am Menschen abgeschlossen. Detaillierte Beschreibungen der Geräte, Instrumente, Materialien und liefert notwendige menschliche Gehirn Schneiden durchzuführen, werden ausgeschlossen. Materialien und Zubehör für Gehirn Dissektionen sind im Ermessen des einzelnen Forschers ausgewählt und basieren auf Autopsie-Tools erlaubt oder bei jeder Forschungseinrichtung zugelassen. Die minimale Menge von Werkzeugen und Material für dieses Verfahren erforderlich ist, in der Material / Ausrüstung Tabelle beschrieben. Spezifische Schnitt Verfahren und Vorsichtsmaßnahmen wegen des Verdachts auf übertragbare Krankheiten des Gehirns, wie menschliche CJD, sind außerhalb der Ziele dieses Manuskripts und sind aus anderen Quellen zur Verfügung 7.
1. Symmetrische Bihemisphärische Gehirn Cutting
Hinweis: Sicherstellen , dass das Gehirn die notwendige Gewebefixierung erhalten hat (unter Verwendung von zum Beispiel neutral gepufferte 10% Formalinlösung) für einen Zeitraum von zwei bis drei Wochen, abhängig von der periagonal, metabolischer (dh pH) und Gewebekonservierung ( dh Temperatur) Bedingungen. Doch für die Bildgebung Pathologie Korrelationsstudien, eine längere Zinsbindung (> 5,4 Wochen) wurde 8 vorgeschlagen.
- Legen Sie das Gehirn auf eine ebene Fläche, die Ermittler gegenüber, mit den frontalen Pole in die entgegengesetzte Richtung gerichtet in Bezug auf die Ermittler.
- Legen Sie das Gehirn in einer solchen Weise, dass eine vollständige und klare Visualisierung aller kortikalen Windungen und Furchen des gesamten Großhirn (Abbildung 1a) ermöglicht.
- Erster Blick für meningeal Anomalien, makroskopische hemisphärische Asymmetrien (mögliche Indikatoren für fokale, lobar oder generali hemisphärischen Erscheinungen der Atrophie), makroskopische tissutal Läsionen (dh tumors oder Herniation), angeborene Fehlbildungen, Gefäßanomalien und andere mögliche Anomalien oder ungewöhnliche Präsentationen der Gehirnoberfläche.
HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen, wie ein menschliches Gehirn zu bewerten, beziehen sich auf handelsüblichen neuropathology Lehrbücher und Handbücher Autopsie 9,10.
2. Protokoll Sequence
- Gesicht frontal Pole vom Prüfer weg, mit den oberflächlichen Aspekte der Hemisphären (Telenzephalon), um die Ermittler gegenüber. Nehmen Sie so viele digitale Bilder wie nötig in jedem einzelnen Fall zu dokumentieren mögliche Makro Anomalien und für mögliche klinisch-neuroanatomische und Nachschnitt-Überlegungen zu berücksichtigen. Haben wissenschaftlicher Mitarbeiter digitalen Fotos senkrecht zum Gehirn nehmen die gesamte kortikalen Oberfläche zu erfassen (Abbildung 1a - c).
- Mark vor und postcentralis kortikalen gyri mit Tinte oder farbigen Nadeln vor dem Gehirn Schneiden (Abbildung 1b Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht eine sofortige Anerkennung des Motors und somatosensorischen Primärrinden nach dem Schneiden.
- Drehen Sie das Gehirn um 180 Grad , während halten sie in die gleiche Richtung (dh die frontale Pole abgewandten Ermittler). Überprüfen Sie sorgfältig die Basis des Gehirns. Achten Sie besonders auf die Bedingungen für zerebrovaskuläre Systeme (dh basilaris und vertebralis und den Kreis von Willis) und Hirnnerven an ihren brainstem Ausgangs- / Eingangsstufen. Verwalten Sie die Riechkolben und Traktate mit besonderer Sorgfalt tissutal laceration, die aufgrund ihrer extremen Schwäche zu vermeiden.
- Nehmen Sie so viele digitale Bilder wie nötig in jedem einzelnen Fall zu dokumentieren mögliche Makro Anomalien und für mögliche klinisch-neuroanatomische und Nachschnitt-Überlegungen zu berücksichtigen. Haben wissenschaftlicher Mitarbeiter digitalen Fotos senkrecht zum Gehirn, um die Gesamtheit der kortikalen und brainstem Flächen zu erfassen.
- Mit Blick auf die Basis des Gehirns und mit einem Skalpell, schneiden Sie die brainstem quer auf der Ebene des oberen Teils der Brücke (so nahe wie möglich an die Basis des Cerebrum). Inspizieren Sie vorsichtig die SN (dh für Blässe) 11 und andere 12 benachbarten Strukturen. Beachten Sie , möglicherweise eine Audio - Recorder - Gerät, jedes außergewöhnliche Erscheinung des Gehirns im Vergleich zu einem normalen Gehirn 13.
- Wieder drehen Sie das Gehirn um 180 Grad und durch Schneiden des Corpus callosum eine fronto-occipital Richtung mittig durch den medialen Längsfissur ein scharfes Messer, trennen die beiden Hemisphären mit und folgende. Überprüfen Sie jede Seite jeder Hemisphäre für mögliche Anomalien (zB ventrikuläre Vergrößerungen, Mißbildungen, Gewebe Erweichung, Tumoren, etc.) 13. Siehe Abbildung 2a.
- Nehmen Sie so viele digitale Bilder wie nötig in jedem einzelnen Fall möglich Makro Anomalien zu dokumentieren undzu berücksichtigen möglich klinisch-neuroanatomische und Nachschnitt-Überlegungen. Haben wissenschaftlicher Mitarbeiter digitalen Fotos senkrecht zum Gehirn nehmen die gesamte kortikalen Oberfläche zu erfassen. Beachten Sie jede ungewöhnliche Eigenschaft des Gehirns im Vergleich zu einem normalen Gehirn.
- Legen Sie die beiden Hemisphären flach liegend auf ihrer medialen Aspekte, wobei die Stirnlappen abgewandten dem Forscher, wie in 2b gezeigt. Legen sie in der Weise, dass ihre Mittelpunkte berühren (auch bei gekennzeichnet hemisphärischen Asymmetrie).
- Mit einem scharfen Messer von Hand geschnitten durch beide Gehirnhälften, an den Stirn Pole starten und bewegt sich in Richtung der Hinterhaupts Pole durch die gesamte Länge der Hemisphären. Erhalten zwei Serien von 1 cm dicken Blöcken von Hirngewebe (etwa 18 Platten für jede Hemisphäre).
- Legen Sie die Gehirn-Platten in einer anatomisch organisiert (fronto-occipital Richtung) Sequenz auf einer separaten ebene Fläche. Verwenden Sie einen weißen surface mit einem Lineal gedruckt auf es für einen besseren Kontrast beim Fotografieren. Zeigen Sie die zwei Serien von zerebralen Platten in einer anatomisch symmetrischen Art und Weise (fronto-occipital Richtung), um sicherzustellen , dass ihre koronalen Flächen für die Inspektion direkten Auge sichtbar sind und digitale Fotografie (Abbildung 3a). Verwenden Schneidflächen mit aufgedruckter Millimeternetze auf beiden Seiten Hirnstrukturen, Größen zu lokalisieren, und mögliche Anomalien in einer genaueren Art und Weise.
- Nehmen Sie so viele digitale Bilder wie nötig in jedem einzelnen Fall zu dokumentieren mögliche Makro Anomalien und für mögliche klinisch-neuroanatomische und Nachschnitt-Überlegungen zu berücksichtigen. Haben wissenschaftlicher Mitarbeiter digitalen Fotos senkrecht zum Gehirn nehmen die gesamte kortikalen Oberfläche zu erfassen. Machen Sie sich Notizen (möglicherweise eine Audio-Recorder-Gerät), der ungewöhnliche Aspekt des Gehirns im Vergleich zu einem normalen Gehirn.
- Mit einem scharfen Skalpell, sezieren manuell kleineren rechteckigen BlöckeHirngewebe für jeden etablierten Gehirnregion. Folgen Sie dem in Tabelle 1 beschrieben Gehirnregion Sammelsystem vorgeschlagen.
- Setzen Sie jeden Gewebeblock in separat gekennzeichnet histocassettes.
Hinweis: Jeder Block von Hirngewebe muss geschnitten werden zu passen, so viel wie möglich, die Standard histocassette maximale Volumen (30 x 20 x 4 mm 3). - Beschriften Sie die histocassettes mit einem de-Identifizierungscode für jeden Fall und unter Verwendung spezifischer neuroanatomischen Kennungen (verwenden Sie keine zufällige Buchstaben oder Zahlen für unterschiedliche Gehirne, sondern immer die gleichen regionalen anatomischen Namen oder entsprechenden Zahlen, wie in Tabelle 1 gezeigt). Erstellen de-Identifizierungscodes, beispielsweise durch die Erzeugung von Zufalls oder halbZufallsZahlen für jeden Fall (dh BRC 130, wobei B für Hirn bleibt, R für Ressourcen bleibt, C für Zentrum bleibt und 130 ist eine progressive Beitritt oder AD160001, wo AD steht für "Alzheimer-Krankheit Studie" 16 ist dieJahr, wenn die Autopsie durchgeführt wurde (2016), und 0001 eine progressive Beitritt Probennummer).
HINWEIS: Dieser Schritt ist für zukünftige Forscher sehr hilfreich ist; halten eine Legende, und geben Sie die Hemisphäre (L = linke Hemisphäre, R = rechte Hemisphäre). Verwenden Sie zwei verschiedene Farben von histocassettes, eine bestimmte Farbe für jede Hemisphäre zu etablieren. - Nehmen Sie so viele digitale Bilder wie nötig in jedem einzelnen Fall möglich macroanomalies zu dokumentieren und für mögliche klinisch-neuroanatomische und Nachschnitt-Überlegungen zu berücksichtigen. Haben wissenschaftlicher Mitarbeiter digitalen Fotos senkrecht zum Gehirn nehmen die gesamte kortikalen Oberfläche zu erfassen. Beachten Sie jede ungewöhnliche Eigenschaft des Gehirns im Vergleich zu einem normalen Gehirn.
- Setzen Sie jeden Gewebeblock in separat gekennzeichnet histocassettes.
- Nehmen digitale Bilder (so viele wie erforderlich oder gewünscht) der gesamten Schnitt Gehirn und die damit verbundenen histocassettes.
- Stanze (beispielsweise durch Accu-punch) kleine Stücke von Gewebe für die DNA - Extraktion und genetische Analysen. Benutzenein Stempel von 2 bis 5 mm im Durchmesser.
HINWEIS: Für seinen hohen Gehalt an Genmaterial, das Cerebellum ist die bevorzugte Wahl; Es ist jedoch jede andere Region in Ordnung. - Wieder tauchen alle histocassettes Blöcke Hirngewebe in der gleichen Art von Fixierungslösung enthält (beispielsweise 10% neutral-gepuffertes Formalin) , wie zuvor bis zum nächsten Schritt der Gewebebearbeitung verwendet.
- Folgen Sie Standardverfahren für den menschlichen Formalin fixierten Gewebeverarbeitung 14.
3. Ein besonderer Ansatz: Alternating Tiefgekühltes und Feste Symmetric Bihemispheric Schneiden
HINWEIS: Die symmetrische bihemispheric Gehirn Schneid Protokoll in Abschnitt 2 bietet die Möglichkeit von Gewebeplatten aus nicht fixierten, frische Gehirne (wenn vorhanden) in der gleichen systematischen und symmetrische Weise zu schneiden.
- Legen Sie das gesamte frische Gehirn auf den Kopf nach unten (vorzugsweise auf einer halbkugelförmigen schalenförmigen Kunststoffoberfläche) für 8 - 10 min in einem -80 ° C Gefrierschrank das Hirngewebe zu härten without provozieren biochemische Schäden und manuelles Schneiden zu erleichtern.
- Mit einem scharfen Messer, schneiden beide Hemisphären in einer alternativen und aufeinanderfolgenden Weise, nach dem Protokoll Gehirn Schneiden in Abschnitt 2, aber frieren und jede andere Platte fixieren (aus beiden Hemisphären und entlang einer fronto-occipital anatomischen Richtung).
- An diesem Punkt, versuchen Sie nicht jede Gehirnregion zu schneiden, wie in Tabelle 1 beschrieben. Schneiden Sie spezifische frische Hirnregionen nur dann , wenn für die sofortige RNA oder Proteinextraktion erforderlich (dh für Genom- oder Proteom - Studien) 15.
- Nach dem Schneiden sofort einfrieren, Etikett und Nummer jedes frischem Gewebe. Nehmen Sie digitale Bilder von der gesamten Platte Serie; packen jede Platte in einem einzigen Plastikbeutel; sammeln die Platten in einem separaten, ein hirn nur Behälter; und speichern Sie die Behälter in einem dedizierten -80 ° C Gefrierschrank.
HINWEIS: Der Gefrierschrank sollte nur für die menschliche Hirngewebe gewidmet sein. Erst später wird singenle gefrorenen Hirnregionen geschnitten werden, wie für jeden spezifischen Experiment erforderlich. - Tauchen Bramme jedes andere Gewebe ausgewählt zur Fixierung (10% neutral gepuffertem Formalin oder ein anderes Fixiermittel) in separaten Beuteln ein ausreichendes Volumen an Fixiermittel (3/1 Volumen Fixiermittel / gewebeBlockVerhältnis) enthält. Beschriften Sie jede Tasche durch nacheinander Nummerierungs sie nach einer fronto-occipital Sequenz. Siegel jede Tasche, nehmen Sie digitale Bilder und speichern sie in einem Plastikbehälter.
- Öffnen Sie die Fixiermittel enthaltenden Taschen nach 2 Wochen der Gewebefixierung und schneiden Sie jede Gehirnregion , wie in Tabelle 1 beschrieben.
4. Histostain und Immunhistochemie
HINWEIS: Die Menge der zerebralen Regionen schneiden auf der Grundlage der vorgeschlagenen Regelung (Tabelle 1) sind ausreichend , um die meisten zufrieden zu stellen, wenn nicht alle, die derzeit etablierten konsensbasierte pathologische Kriterien für AD 16, PD 17, Demenz mit Lewy - Körperchen (DLB) 18, frontotemporale Demenz (FTD / MND)
- Für jede Region des Gehirns und für beide Hemisphären, führen Sie die folgenden minimalen Satz von histostains: Hematoxylin und Eosin (H & E), Kresylviolett (CV; wenn quantitative Morphometrie geplant sind, zum Beispiel), und Silberfärbung (wenn "explorative" Analysen erforderlich).
- Für jede Region des Gehirns und für beide Hemisphären, führen Sie die folgenden minimalen Satz von Immunhistochemie Protokolle: ß -Amyloid (β A), phosphoryliert-Tau (PtAu), phosphoryliert α-Synuclein (P & agr;-syn) und phosphoryliert-TDP43 (pTDP43) wie beschrieben 14.
HINWEIS: Die Gesamtzahl der Gewebeschnitte, um jedes Gehirn nach diesem Protokoll zu beurteilen ist 46 (wenn alle Hirnregionen von beiden Hemisphären zur Verfügung stehen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokoll Länge
Die Zeit für einen einzigen symmetrischen bihemispheric festen Gehirn Schneidvorgang ausgegeben wird , auf 1 h geschätzt (ohne Zeit damit verbracht die Einrichtung der Seziertisch, Werkzeuge und Schneidflächen; Kennzeichnung;. Usw.). Die benötigte Zeit für eine einzelne symmetrische bi-hemisphärische abwechselnd gefroren und fixiert Gehirn Verfahren Schneiden wird geschätzt, 2 h zu nehmen. 6 Wochen für ein einzelnes menschliches Gehirn / Thema endgültige histologische Diagnose zu erhalten - Es kann zumindest zwischen 4 nehmen. Nach dem postmortalen Gehirn Entfernung aus dem Schädel, einen angemessenen Zeitraum der Gewebefixierung (2 - 3 Wochen mindestens) erfolgen muss. Dann wird eine Reihe von Protokollen, einschließlich der symmetrischen bihemispheric Gehirn Schneiden, Gewebeverarbeitung, Gewebeeinbettung, Block Schnitte und Färbung und Immunhistochemie muss durchgeführt werden. Schließlich ist die mikroskopische Beurteilung der einzelnen Regionen pro Hemisphäre, die Verwendung von consensus etablierte Pathologie Kriterien und Klassifikationen, die Überprüfung der klinischen Aufzeichnungen, und möglicherweise auch die Korrelation von clinicopathology, muss vor neuropathologischen Schlussfolgerungen stattfinden. Der gesamte Zeitplan für eine vollständige menschliche Gehirn neuropathologische Beurteilung sollte sorgfältig geprüft werden, wenn für bestimmte Forschungsstudien zu planen. Darüber hinaus medizinischen Kollegen und Forschung Ermittler, der Geber Familien und Justizbehörden sollten der Gesamtzeitaufwand, Komplexität und Team Zeit / Aufwand informiert werden, um eine moderne neuropathologische Beurteilung zu erhalten.
Obwohl die vorgeschlagene Gehirn Schneid Protokoll eine zeitaufwendige und schwierige Verfahren darstellt, es tatsächlich eine wissenschaftlich lohnende Methodik ausführlich das menschliche Gehirn bei gesunden und pathologischen Bedingungen zu beurteilen. Es ist wichtig zu betonen, dass sehr oft während der Autopsie Gehirn als Kontroll / normale Probanden erhielten (dh, Themen wie klinisch oder neurologisch normalen vor dem Tod beurteilt) für verschiedene Hirnerkrankungen nach einer genauen neuropathologischen Beurteilung kann tatsächlich gefunden werden , positiv zu sein. Diese Fälle stellen die sogenannten asymptomatischen und präklinische Fächer für verschiedene Hirnkrankheiten, insbesondere diejenigen, die Charakterisierung altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen. Dies unterstreicht die Bedeutung der Gehirne erhielten als "Kontrolle" in einem sehr umfangreichen und sorgfältigen Art und Weise der Bewertung, vor allem für Forschungszwecke. Es wird immer deutlicher , dass das menschliche Gehirn / Fächer, symptomatisch oder nicht für neurologische / psychiatrische Störungen können mehrere Hirnerkrankungen akkumulieren (sogenannte Co-auftretende Pathologien) während 23,24 Alterung. Interessanterweise sind diese Co-auftretende Hirnläsionen biochemisch identisch mit denen in Patienten gefunden mit klinisch manifestierte Erkrankungen und sind in der gleichen anatomischen Regionen sowie (PARS, ARTAG, CARTS) 25-27 lokalisiert. Diese moWieder jüngsten Erkenntnisse (nur durch Autopsie Untersuchungen) haben eine außerordentliche Bedeutung für die Untersuchung von Alterungseffekten auf das menschliche Gehirn.
Tabelle 2 und Abbildung 4 beschreiben einige vorläufige semi - quantitative Daten unter Verwendung eines symmetrischen bi-hemisphärische Gehirnschneidverfahren durchgeführt auf einer Reihe von menschlichen Gehirnen in unserem Gehirn Bank gesammelt. Diese vorläufigen Daten zeigen , dass die meisten Gehirne als "normal" empfangen oder "Kontrolle" von älteren Probanden waren eigentlich nur nicht positiv für β A-neuritic Plaques und Tau-Neurofibrillen (tau-NFT), wie bereits bekannt , 28-32, aber auch dass die Belastungen von unlöslichen β A-neuritischen Plaques waren in der linken entorhinalen Cortex und Hippocampus im Vergleich zur rechten entorhinalen Cortex und Hippocampus aus dem gleichen Gehirn höher. Die Gehirne wurden unter Verwendung von CERAD bewertet 33 und Braak Inszenierung 34 Systems, die jeweils β A-neuritic Plaques und Tau-NFT beurteilen. Die beobachtete linken Hemisphäre Vorliebe für unlösliches β eine Pathologie war ebenfalls, obwohl nur als Trend, in den meisten der übrigen Bereiche der linken Hemisphäre im Vergleich zu der rechten Hemisphäre. Die Relevanz dieser vorläufigen bi-hemisphärische Erkenntnis ist, dass die untersuchten Gehirne von einer allgemeinen Bevölkerung Autopsie Kohorte alle waren. Alle Probanden wurden im Krankenhaus, in der Tat, für Nicht-neurologische / psychiatrische Ursachen und starb in verschiedenen Gemeinschafts allgemeinen Krankenhäusern für Nicht-neurologische Gründe. Die Tatsache, dass die untersuchten Gehirne von einem allgemeinen Bevölkerung Autopsie Kohorte minimiert Selektionsverzerrungen waren möglicherweise vorhanden, wenn nur Gehirne von spezialisierten neurologischen / Demenz Zentren zu analysieren. Siehe auch die Empfehlung von NINDS 6. Unsere Ergebnisse sind vorläufig (4 von 46 verfügbaren "Kontrolle" Gehirne) und benötigen eine Bestätigung in einem viel größeren Maßstab. Allerdings sind diese neuen Erkenntniswenn s, bestätigt, deuten auf eine mögliche Phänomen einer hemisphärischen Vorliebe für die Akkumulation und das Fortschreiten der Alzheimer - Pathologie oder eine Pathologie mindestens ß. Ähnliche Arten von pathologischen hemisphärischen Liebhabereien möglicherweise mit jeder spezifischen Art von neuropsychiatrischen oder neurodegenerative Erkrankung in Verbindung gebracht werden könnte. Weiterhin kann durch symmetrische bi-hemisphärischen Gehirn kombiniert Verfahren mit Methoden der genauen zellulären und Läsion Quantifizierungen (dh unvoreingenommene stereology) schneiden, könnte es möglich sein , das Verhältnis von normal zu pathologischen Bedingungen zu messen, sowie das Verhältnis von neuronalem Verlust an restaurativen / neuroplasticity Erscheinungen, die bei Menschen in Zusammenhang mit einer bestimmten Halbkugel und Funktion vorhanden sein könnten. Faszinierend, obwohl die hemisphärische Vorliebe für jede größere Art von Gehirnpathologie (β Amyloid, Tau, LB, TDP43, FUS usw.) Muss noch festgelegt werden, die funktionelle Bildgebung 34, neuropsychologische 36 p> und mikrostrukturelle anatomische Analysen 37,38 scheinen im Einklang mit unseren vorläufigen Ergebnissen. Dies verstärkt die Hypothese einer möglichen hemisphärischen Vorliebe für jede unterschiedliche Art von Gehirnpathologie und verwandten Krankheiten.
Abbildung 1. Vorläufige Gehirn Beurteilung Vor Bihemispheric Gehirn Schneiden. Diese Figur zeigt die verschiedenen oberflächlichen Aspekte eines menschlichen Gehirns nach 2 Wochen der Fixierung in 10% neutral-gepuffertes Formalin. Im Uhrzeigersinn Sequenz, die überlegene Aspekte der Gehirne (a, b) durch die Beobachtungen an der Basis des Gehirns gefolgt sind, die Kontrollen des Kleinhirns (c), Hirnstamm und Hirnnerven (d) und Riechkolben enthalten und Wege (e).02 / 54602fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Bihemispheric Human Brain Schneiden. Formalin-fixierte auf eine flache Oberfläche gelegt menschliche Gehirn für Augenuntersuchung (a). Die rote Linie zeigt die mediale Längsfissur. Die Anordnung der beiden Gehirnhälften nach einem zentralen Schnitt durch die mediale Längsfissur (b). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Bihemispheric Hirnschnittverfahren. Diese Abbildung zeigt einige der Schritte des das bihemispheric menschliche Gehirn Schneid Protokoll. Nach Beseitigung aller Hirnplatten (für beide Hemisphären) und im Anschluss an eine fronto-occipital Richtung (a), die jeweils etablierten Hirnregion (Tabelle 1) zu sammeln , wird in Gewebeblöcke Fitting Standard histocassette Dimensionen (- e b) geschnitten werden. Cerebellum Gewebeblöcke müssen größere histocassettes (siehe den grünen [rechten Kleinhirnhemisphäre] und blau [linken Kleinhirnhemisphäre]; e und f). Weiß - Kassetten sind für mittlere Strukturen, wie der Medulla oblongata, Rückenmark, etc. (E - g). Die endgültigen histocassettes nach dem bihemispheric menschliche Gehirn Schneid Protokoll gewonnen wurde und Hirngewebe Blöcke aus jeder neuroanatomischen Region in Tabelle 1 aufgelistet sind , in der gleichen Ausgangs Art der Fixierungslösung (10% neutral gepuffertem Formalin) (- g f) erneut eingetaucht.tp_upload / 54602 / 54602fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Gewebeschnitte von jedem Endhirnhälfte Stained für verschiedene Antigene von Immunhistochemie. (A) Diese Figur zeigt eine Reihe von Gewebeschnitten von beiden Hemisphären des gleichen menschlichen Gehirn. Jede Reihe von bi-hemisphärischen Schnitte wurden für β -Amyloid, phosphoryliertes tau-und phosphorylierte α-Synuclein (α-syn) immunhistochemisch, dessen Positivität zugeordnet ist gemeinsamen altersbedingte neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson. Das Bild zeigt ein repräsentatives Beispiel für die mögliche Gesamtmenge der Abschnitte mit der vorgeschlagenen bi-hemisphärische symmetrische Gehirn Schneid Protokoll zu analysieren. LH = linke Hemisphäre, RH = Right Hemisphere. ( B) Diese Bilder zeigen Proben von gemeinsamen altersbedingte Hirnläsionen, wie es nach der Verwendung von spezifischen Immunhistochemie Protokolle für β -Amyloid neuritischen Plaques, tau-Neurofibrillen unter dem Mikroskop beobachtet und α-Synuclein (α-syn) -positiven Lewy - Körperchen. In der unteren rechten Ecke jedes Bildes ist die Art des verwendeten Objektivs (5X, 20X und 40X) zu vergrößern und genau den einzelnen Schädigungsformen zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Bihemispheric Schneid Schema. Diese Tabelle zeigt die einzelnen anatomischen Bereich zu sezieren sowohl in der linken und rechten Hemisphären jedes Gehirn. Die bihemispheric symmetrische Schneiden kann auf frischen und festen Gehirn durchgeführt werden.rce.jove.com/files/ftp_upload/54602/54602table1.xlsx">Please~~MD~~aux hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.
Tabelle 2. Vorläufige Ergebnisse dieser Studie durch Bihemispheric Human Brain Schneiden. Diese Tabelle zeigt die vorläufigen Ergebnisse durch eine bihemispheric symmetrische menschliche Gehirn Schneidverfahren auf vier menschlichen Gehirnen von klinisch normal, ältere Probanden erhalten. Die Daten zeigen , dass zwei Hirnregionen (die entorhinalen Cortex und Hippocampus) werden ständig und früh in der Anhäufung von β Amyloid neuritic Plaques und Tau-NFT beteiligt. Diese Art der Läsion wird als die wahrscheinlichste pathogenetische Prozess verursacht AD zu sein. f = weiblich; m = männlich. Die Zahlen in Klammern stellen das Alter zum Zeitpunkt des Todes (in Jahren) jedes obduzierter Thema. Ein semi-quantitative kolorimetrische Code für die schnelle Visualisierung von möglichen hemissphären Unterschiede zwischen den Arten von Läsionen, Schweregrade und anatomischen Lokalisierungen unter verschiedenen älteren Probanden verwendet wurde. Neg = negativ (grün); Sparse = 1 bis 2 Läsionen (gelb); Moderate = 3 bis 6 Läsionen (orange); Häufige => 6 Läsionen (rot). Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Gehirn Schneidverfahren kann auf die spezifischen Bedürfnisse der einzelnen neuropathology Labor angepasst werden (zum Beispiel durch die Anzahl der zerebralen Regionen verringert werden für jede Hemisphäre zu bewerten), während immer noch die bihemispheric symmetrische Schneidverfahren als eines ihrer Hauptmerkmale beibehalten werden. Diese vorgeschlagene Protokoll könnte für Routineverfahren (forschungsorientierten neuropathologischen Zentren) oder nur bei Bedarf (spezifische klinisch orientierte Studien) verwendet werden. Es kann selektiv nur für bestimmte Arten von Untersuchungen (dh Immunhistochemie) oder molekulare Analysen (dh genomischen oder proteomische Analyse) verwendet werden. Aus technischer Sicht ist es sinnvoll, dass einige pathologische Unterschiede (vor allem in der Immunhistochemie) zu erwähnen, um mögliche artifactual Variationen in den Immunhistofärbung Intensitäten zurückzuführen sein könnte. Diese können durch die Verwendung von automatischen Maschinen Färbung minimiert werden, was drastisch die Möglichkeit artifactual Färbung bewirkt eine Verringerungnd Variationen. Es ist derzeit möglich, in der Tat, auf technologisch von Störfaktoren minimieren aufgrund technischer Artefakte, die durch zuverlässige Roboter Färbung Maschinen. Somit können vergleichbare Ergebnisse erhalten werden, wenn die Beurteilung, beispielsweise zwei Hemisphären aus dem gleichen Gegenstand oder mehrere Sätze von beiden Hemisphären aus mehreren Fächern.
Außerdem wird während den letzten Jahren ist die Zahl der Gehirn in menschlichen Gehirnen erkannt Läsionen wurde 39 enorm zugenommen. Diese neuen Typen von Hirnläsionen ein erhöhtes Risiko geschaffen, die frühere Gehirne als normal oder Kontrolle klassifiziert sind eigentlich nicht. Die Verbesserung der Immunhistochemie Techniken und neue neuropathologischen Entdeckungen wäre eine kluge und periodische Neubewertung aller Gehirne vorschlagen zuvor als überhöht "Kontrolle" , da Fälle von "Pseudo-control" oder "falsch-control" Gehirne sind immer möglich 40.
Die wichtigste Einschränkung derDieses Verfahren besteht in der Höhe der Zeit und Know-how (anatomischen und pathologischen Kenntnisse) erforderlich, es auszuführen. Darüber hinaus strebt Studien Genomik und Proteomik Aspekte des menschlichen Gehirns zu analysieren erfordern ein Gehirn bereit Bank-Team zu verwalten, auf schnelle Art und Weise, alle Gehirnspende Verfahren, Rechts Zustimmung Vereinbarungen, Gehirn Umzüge und sofortige Schneiden zum Einfrieren oder der Fixierung. Normalerweise sind nur diese Einrichtungen und Personal in spezialisierten akademischen oder Forschungszentren. Darüber hinaus, während detaillierte Schnittverfahren sicherlich besser helfen können, mögliche anatomische Herkunft und Verbreitung Wege von jeder Erkrankung des Gehirns zu verstehen, werden sie auch immer Verlass auf die Menge der detaillierten klinischen Informationen für jeden Fall, um eine genaue clinicopathological Korrelationsstudien durchzuführen. Eine der besten Anwendungen für dieses Protokoll, wird dann im Rahmen der klinisch-pathologischen Longitudinalstudien sein, die oft die beste Art der investigation zu sammeln detailliertere klinische Bildgebung, genetische, ökologische und andere Arten von Daten zu korrelieren Autopsie, mikroskopische und Immunhistochemie Ergebnisse mit zuvor gesammelten klinischen Daten.
Überraschenderweise sind extrem selten 41-44 neuropathologischen Untersuchungen analysiert, Klassifizieren oder das breite Spektrum der neuropathologischen Läsionen in Bezug auf hemisphärischen Funktion oder Lokalisierungs quantifizieren. Es scheint jedoch, dass sich die Zeiten und Technologien für noch nie da gewesenen Herausforderungen in der menschlichen Neuropathologie Studien bereit sind. Der Hauptgrund für eine symmetrische bi-hemisphärische Gehirnschnittverfahren vorzuschlagen, war eigentümlich funktionelle Asymmetrien (anatomische oder pathologische) des menschlichen Gehirns zu respektieren. Zu oft mehr für blind akzeptierte Tradition als wissenschaftliche Vernunft bewiesen, nur eine Hemisphäre (oft stochastisch ausgewählt) wurde für neuropathologische oder immunhistochemischen Beurteilung festgelegt, während die andere für die möglichen molekularen eingefroren worden ist,oder biochemische Analysen. Vor allem, wenn das menschliche Gehirn zu studieren, die lässige Auswahl der Hemisphäre und damit Gehirn Schneiden enthalten potenzielle Risiken in anatomischen Bedingungen und können mögliche pathophysiologische Selektionsverzerrungen verursachen. Während aus praktischen Gründen eine Hemisphäre Festsetzung und die gegenüberliegende Einfrieren in einem nicht-Forschungsumfeld sinnvoll ist, ist es nicht mehr für neuropsychiatrische Störungen im Zusammenhang mit der neuropathologischen Forschung nicht haltbar. Gerade in der heutigen Zeit, wenn konsistente Mengen von "in vivo" bildgebenden Verfahren und genetischen Informationen potenziell verfügbar sind bei der Autopsie, eine symmetrische bi-hemisphärische Gehirnschneidverfahren mit einer entsprechenden umfassenden neuropathologischen Beurteilung sollte routinemäßig durchgeführt werden. Die hemisphärische Spezialisierung des menschlichen Gehirns ist in vielen kognitiven Funktionen, wie Sprache, Geschicklichkeit und Emotionen (dh unterschiedliche Aktivierung in der linken und rechten Amygdala), zum Namen af demonstriertew. Diese hemisphärische Spezialisierung und Lateralisation in höheren kognitiven und nicht-kognitiven Funktionen, die in der Regel Menschen von anderen Säugetieren und Nichtsäugetierarten unterscheiden und zu charakterisieren, müssen sorgfältig in Bezug auf Neuropathologie in Betracht gezogen werden. Dass es eine hemisphärische Vorliebe für bestimmte pathologische Prozesse in Bezug auf die Neurodegeneration, neuroinflammatorische Reaktion beim Menschen, und neuroreparative Kapazitäten ist noch nicht bekannt, und es ist sehr selten untersucht 40-43. Obwohl Bildgebung physiologisch und klinisch hemisphärischen spezifische Merkmale bekannten unterstützt, ist es erstaunlich, wie viel weniger im Hinblick auf mögliche neuropathologische Unterschiede bekannt. Mit dem Vorschlag eines symmetrischen bi-hemisphärische Gehirnschneidverfahren oder die anspruchsvollere abwechselnd gefroren und fixiert symmetrische bi-hemisphärische Gehirnschnitt Protokoll war es unser Ziel, ein Verfahren zu beschreiben, das eigentümliche Aspekte des menschlichen Gehirns während gesunde und pathologi zu entdecken, könnte dazu beitragen,cal Bedingungen, als hemisphärische Spezialisierung und lateralization Features auf seiner einzigartigen basiert.
Einer der wichtigsten Schritte dieses Protokolls besteht in der Notwendigkeit, das Gehirn Einstellung Schneiden mit, Materialien und Werkzeuge sofort jederzeit zur Verfügung, da es sehr selten ist in der Lage zu sein, wenn ein Gehirn, insbesondere eine frische Probe zu antizipieren, ist Ankunft. Ein weiterer wichtiger Schritt dieses Protokolls besteht in der manuellen Geschicklichkeit für frische und festen Gehirn Schneiden erforderlich. Obwohl mit einem identischen Gewebe zu tun, die beiden physikalisch-chemischen Bedingungen (frisch und fixiertem Gewebe) machen den Erwerb von Know-how für Gehirn eine wesentliche und entscheidende Komponente des Protokolls zu schneiden. Darüber hinaus setzt neuroanatomische Wissen (vor allem für frische Gehirn Verfahren) spezifische akademische Ausbildungszeiten. Für frisches Gehirn Verfahren darüber hinaus ist es zwingend notwendig und kritisch, so schnell wie möglich zu bewegen und die Präzision und die Integrität des tissu zu haltene. Dadurch werden alle biologischen Informationen erhalten Sie in dem Gewebe enthalten sind , sowie die Möglichkeit , künftige Untersuchungen erfordern frisch gefrorene Material auszuführen (RNA, Proteine, etc.).
Die Doppel - gefroren und fest symmetrische Gehirn Ausarbeitungsverfahren stellt den bestmöglichen Kompromiss für beide frisch gefroren zu erhalten (nützlich für genetische, molekulare und Mikrodissektion Analysen) und festen (nützlich für Neuroanatomie, Immunhistochemie und PCR - Analysen in situ) Gehirngewebeschnitte aus zusammenhängende Bereiche von spezifischen Hirnregionen und von beiden Hemisphären. Diese Methode stellt eine Quelle für vergleichende Analysen durch verschiedene molekulare und bildgebenden Verfahren unter Verwendung genau die gleiche Gehirnregion / Bereich (Unter anatomischen Bereich, graue Substanz Kerne, Zellgruppen, dendritische / Stacheln, etc.). Ein Doppel gefroren und fixiert symmetrische Gehirn Schneidverfahren erlauben würde, einen zusammenhängenden Gehirngewebeschnitte aus dem gleichen ne zu erhaltenuroanatomical Bereich. Dies würde es ermöglichen für ihre Analyse unter Verwendung von hellem Licht, Fluoreszenz und Elektronenmikroskopie (verschiedene Verfahren für jede Art von Mikroskopie verwendet wird). RNA / DNA / Protein - Extraktionsverfahren können auch angewendet werden, durch Laser Capture Mikrodissektionen, beispielsweise auf der gleichen Region oder Gruppe von Neuronen, Zellen, Schiffe, etc. Diese alternierende gefroren und symmetrische bihemispheric Hirnschnitttechnik fixiert, gemeinsam mit EDV-Systemen für die Probenverfolgung und Kältetechnik, scheint ein enormes Potenzial für die Anwendung von laufenden und potenziellen künftigen biomolekulare Studien anbieten zu können.
Ein alternativer Ansatz dem Verfahren beschrieben Gehirn Schneiden könnte die Querschnitts Schneiden jeder gesamten hemisphärischen Oberfläche sein. Jedoch erfordert dieses Verfahren mehr spezialisierte und teure Werkzeuge (dh eine größere Mikrotom, größere Rutschen, etc.) Als die , die normalerweise in den meisten neuropathology Labors eingesetzt. Stattdessen unsere methode schlägt eine umfangreiche Sammlung von Hirnregionen aus beiden Hemisphären, diese einzelnen Hirnregionen mit Werkzeugen normalerweise verfügbar (und bezahlbar) in den meisten Forschungslabors Neuropathologie zu schneiden.
Die vorgeschlagene Gehirn Schneiden kann mit präzisen Methoden der histologischen, zellulären kombiniert werden, und subzellulärer Quantifizierung (dh für unvoreingenommene stereology) 45-47. Quantitative neuropathologische Untersuchungen sind von grundlegender Bedeutung und Notwendigkeit, da quantitative Daten über Schaltungen, Kerne, Neuronen, nicht-neuronalen Zellen, Gefäßsystem Anomalien und neuronalen Verlust an spezifischen pathologischen Veränderungen im Zusammenhang meist sind beim Menschen fehlen. Vor kurzem präzise Quantifizierungen von spezifischen neuropathologischen durch den Einsatz unvoreingenommene stereology Protokolle erhalten Läsionen begann Licht auf mögliche neue Beziehungen zwischen der Akkumulation einer bestimmten intran Läsion zu vergießen (dh Lewy - Körperchen), Verlust von Neuronen (dh nigral Verlust),und klinische Manifestationen (dh Parkinson - Symptome) bei der Analyse von menschlichen Gehirnen 48. Die Bestimmung der relativen Mengen an Rest funktionierenden Neuronen oder neuroglialen Zellen notwendig, zum Beispiel reagieren, um den Kontrast, Verzögerung oder für bestimmte neuropathologische Prozesse zu kompensieren, könnte dazu beitragen, um besser auf die reaktionsschnelle und Anpassungsfähigkeit des erwachsenen menschlichen Gehirn zu verstehen, und zwar während des Alterns. Volumetrische neuronal Veränderungen, Neuriten, Läsion Lasten, Faserlängen, Rindendicke, kortikalen Schichtdickenverhältnisse und andere mögliche morphometrische Aspekte sind von besonderem Interesse, da ihre wahrscheinlich pathophysiologische Relevanz auf zellulärer und subzellulärer Ebene im Zusammenhang mit neuropsychiatrischen Erkrankungen oder neurodegenerativen Prozessen wurde noch nicht vollständig 49 erläutert. Anzahl, Größe, Länge der Fasern oder Neuriten, grauen und weißen Substanz Volumen und Verhältnisse, Rindenschicht Analysen usw. sind alle Parameter exakt messbar Dankdie Kombination von spezifischen statistischen Formeln und geometrische Algorithmen 50. Geometrische Gleichungen und statistische Formeln elegant wurden mit hochempfindlichen, computerisierte mikrometrischer tridimensional Koordination motorisierte Systeme (stereology motorisierte Systeme) für die histologische Quantifizierung von fast jede Art von Bio-tissutal Messung integriert.
Der Satz von neuroanalyses verfügbar menschlichen Hirngewebe zu untersuchen war nicht vorstellbar vor ein paar Jahren, und es ist sehr wahrscheinlich, dass es weitere Fortschritte in der nahen Zukunft sein wird. Die detaillierte Charakterisierung der heutigen Gehirne von Patienten, klinisch asymptomatischen Probanden und normalen Individuen wird unglaublich morgen Entdeckungen und die Individuation von Therapien für die meisten neuropsychiatrischen und neurodegenerativen Erkrankungen beschleunigen. Im Zusammenhang mit komplexen Krankheiten wie neuropsychiatrische Erkrankungen, auch die aktuelle anspruchsvolle bildgebende Verfahren kann nichtbieten die höheren Ebenen der zellulären Definition und biologischen Informationen, die moderne neuropathologische Techniken können. Darüber hinaus bieten nur statische Hirngewebe Bilder die Möglichkeit unvoreingenommene quantitative Studien zu einer einzigen Gruppe von neuronalen Zellen oder Läsionen bzw. die Möglichkeit zur Durchführung einzelnen Neuronen (dh Laser Mikrodissektion) zu schneiden Materialien genetische oder Protein zu extrahieren , für die Massenspektroskopie analysiert, um 51 Beispiel .Die symmetrische bihemispheric Gehirn schneiden Methode könnte unter anderem angewendet werden, um spezielle Studien, wie jene eineiigen Zwillings Gehirne zu untersuchen. In dieser einzigartigen experimentum naturae Situation, verstehen das Potenzial besser die Möglichkeit , bestehende Beziehungen zwischen Hemisphärenspezialisierung / lateralization und Kognition / Pathologie ist beeindruckend. Die verschiedenen Ebenen der hemisphärischen bedingten pathologischen Symmetrie / Asymmetrie leichter in Bezug auf eine Natur / Erziehung Dilemma erklärt werden könnte. Zum Beispiel ist ein symmetrischesbi-hemisphärische Gehirnschnittverfahren auf den Gehirnen von eineiigen Zwillingen gegenüber zweieiigen Zwillingen 52-56 durchgeführt werden konnte.
Eine symmetrische bihemispheric Hirnschnitttechnik sollte auch für die menschliche Entwicklung des Nerven Studien 57 angewendet werden. Highly könnte informative Daten für bestimmte Aspekte der hemisphärischen bedingten neuronalen und glialen Reifungszeit, entwicklungs neuroplasticity Phänomene und neuroreparative Kapazitäten des Zentralnervensystems in der Kindheit gesammelt werden. Eine symmetrische bi-hemisphärische Gehirnschneidverfahren könnte wesentlich dazu beitragen , um besser auf die Natur / Erziehung Dilemma für Persönlichkeitsmerkmal Bildung und Verhaltensänderungen während der normalen Entwicklung, der normalen Alterung und als Teil der anfänglichen klinischen Manifestationen von "sporadischen" neurodegenerative 58 Prozesse definieren.
Der klassische Ansatz clinicopathological durch strukturierte Gehirn Schneidverfahren durchgeführt ist keinhistorische Technik, aber es ist immer noch eine gültige und nützliches Werkzeug für die Diagnose und Forschung. Gerade in der aktuellen Zeit, als beeindruckende Mengen an klinischen und biologischen Informationen sind möglicherweise bei der Autopsie zur Verfügung, wobei die Kombination von klinisch gut charakterisierten Fällen bildgebende Verfahren Daten und genetische / molekulare Informationen mit detaillierten modernen neuropathologischen / quantitative Analysen konnte eine noch nie dagewesene "repräsentieren Recht -match "in der Geschichte der Neurowissenschaften. Kombinierte Antemortem und postmortalen Untersuchungen können enorm die funktionellen und neuronalen / tissutal Basen von neuropsychiatrischen Erkrankungen zu klären und Licht auf die genaue ätiopathogenetische Mechanismen dieser Erkrankungen Schuppen, auch in Rechnung, dass hemisphärischen Faktoren nehmen, die nicht speziell vor berücksichtigt wurden. Die Autoren sind sich bewusst, dass die vorgeschlagene symmetrische bihemispheric Hirnschnitttechnik ist zeit- und Finanzierung aufwendig, aber die Bemühungen, die denen für die Weiterentwicklung der bildgebenden Verfahren durchgeführt sollteals auch in der Neuropathologie Forschungsgebiet durchgeführt werden. Mehr harmonisiert und Banking-Aktivitäten strukturierte Gehirn wird als diejenigen, die nicht teurer sein als der Bau oder MRT-Geräte zu kaufen, mit potenziellen wissenschaftlichen Ergebnisse, die nicht weniger lohnend durch bildgebende Studien erzielt würde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copy of signed informed consent allowing autopsy and brain donation for research use. | |||
| Detailed clinical history of the subject which should include a detailed description of any neurologic and psychiatric symptoms and signs. | |||
| Medical or nonmedical video-recordings when available (especially useful in movement disorders field). Next-of-kin’s consent required. | |||
| Neuroimaging, neurophysiology, neuropsychiatric and assessment or clinicometric scales. | |||
| Genetic and family history data. Genetic reports review, if neurogenetic diseases were diagnosed. | |||
| Histology Container | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64233-24 | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-142 (orange) | |
| Histology Cassettes | VWR | 18000-132 (navy) | |
| Knife Handles and Disposable Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62560-04 | |
| Long Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62561-20 | |
| Disposable Blade Knife Handles | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72040-08 | |
| Scalpel Blades | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 72049-22 | |
| Accu-Punch 2 mm | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 69038-02 | |
| Polystyrene Containers – Sterile | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 64240-12 | |
| Dissecting Board | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63307-30 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 SIGMA | |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 2 | Sigma-Aldrich | GHS280 SIGMA | |
| Eosin Y solution, aqueous | Sigma-Aldrich | HT1102128 SIGMA | |
| anti-beta-amyloid | Covance, Princeton, NJ | SIG-39220 | 1:500 |
| anti-tau | Thermo Fisher Scientific | MN1020 | 1:500 |
| anti-alpha-synuclein | Abcam | ab27766 | 1:500 |
| anti-phospho-TDP43 | Cosmo Bio Co. | TIP-PTD-P02 | 1:2000 |
| Digital Camera | Any | ||
| Head Impulse Sealing machine | Grainger | 5ZZ35 |
References
- Braun, B., Stadlober-Degwerth, M., Hajak, G., Klunemann, H. H. 100th anniversary of Perusini's second case: patient RM and his kindred. Am. J. Alzheimers Dis. Other Demen. 25, 189-192 (2010).
- Jellinger, K. A. Neuropathology of sporadic Parkinson's disease: evaluation and changes of concepts. Mov Disord. 27, 8-30 (2012).
- Head, M. W. Human prion diseases: molecular, cellular and population biology. Neuropathology. 33, 221-236 (2013).
- Hirano, A.
- Oyanagi, K., Wada, M. Neuropathology of parkinsonism-dementia complex and amyotrophic lateral sclerosis of Guam: an update. J. Neurol. 246 (Suppl 2), 19-27 (1999).
- Montine, T. J., et al. Recommendations of the Alzheimer's disease-related dementias conference. Neurology. 83, 851-860 (2014).
- Procedures for Brain Autopsy in Prion Diseases. , http://case.edu/med/pathology/centers/npdpsc/protocols-autopsy.html (2010).
- Yong-Hing, C. J., Obenaus, A., Stryker, R., Tong, K., Sarty, G. E. Magnetic resonance imaging and mathematical modeling of progressive formalin fixation of the human brain. Magn Reson Med. 54, 324-332 (2005).
- Love, S., Perry, A., Ironside, I., Budka, H. Greenfield's Neuropathology. , Ninth Edition - Two Volume Set, CRC Press. (2015).
- Davis, R. L., Robertson, D. M. Textbook of Neuropathology. , Third, Lippincott Williams and Wilkins. (1996).
- Dickson, D. W., et al. Neuropathological assessment of Parkinson's disease: refining the diagnostic criteria. Lancet Neurol. 8 (12), 1150-1157 (2009).
- Nieuwenhuys, R., Voogd, J., van Huijzen, C. The Human Central Nervous System: A Synopsis and Atlas. , 4th, Springer. (2008).
- Netter, F. H. Atlas of Human Anatomy. , Professional Edition, 6th Edition, Elsevier. (2005).
- Brown, R. W. Histologic Preparations: Common Problems and Their Solutions. , CAP Press. Northfield, Illinois. (2009).
- Durrenberger, P. F., et al. Effects of antemortem and postmortem variables on human brain mRNA quality: a BrainNet Europe study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 70-81 (2010).
- Hyman, B. T., et al. National Institute on Aging-Alzheimer's Association guidelines for the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 8, 1-13 (2012).
- Gelb, D. J., Oliver, E., Gilman, S. Diagnostic criteria for Parkinson disease. Arch Neurol. 56, 33-39 (1999).
- McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
- Cairns, N. J., et al. Neuropathologic diagnostic and nosologic criteria for frontotemporal lobar degeneration: consensus of the Consortium for Frontotemporal Lobar Degeneration. Acta Neuropathol. 114, 5-22 (2007).
- Litvan, I., et al. Validity and reliability of the preliminary NINDS neuropathologic criteria for progressive supranuclear palsy and related disorders. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55, 97-105 (1996).
- Gilman, S., et al. Second consensus statement on the diagnosis of multiple system atrophy. Neurology. 71, 670-676 (2008).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Rahimi, J., Kovacs, G. G. Prevalence of mixed pathologies in the aging brain. Alzheimer's Res Ther. 6, 82 (2014).
- Jellinger, K. A., Attems, J. Challenges of multimorbidity of the aging brain: a critical update. J. Neural. Transm. (Vienna). 122, 505-521 (2015).
- Crary, J. F., et al. Primary age-related tauopathy (PART): a common pathology associated with human aging. Acta Neuropathol. 128, 755-766 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. Aging-related tau astrogliopathy (ARTAG): harmonized evaluation strategy. Acta Neuropathol. 131, 87-102 (2016).
- Nelson, P. T., et al. 34;New Old Pathologies": AD, PART, and Cerebral Age-Related TDP-43 With Sclerosis (CARTS). J Neuropathol Exp Neurol. 75 (6), 82-98 (2016).
- Tomlinson, B. E., Blessed, G., Roth, M. Observations on the brains of non-demented old people. J. Neurol. Sci. 7, 331-356 (1968).
- Katzman, R., et al. Clinical, pathological, and neurochemical changes in dementia: A subgroup with preserved mental status and numerous neocortical plaques. Ann. Neurol. 23, 138-144 (1988).
- Crystal, H., et al. Clinicopathologic studies in dementia: Nondemented subjects with pathologically confirmed Alzheimer's disease. Neurology. 38, 1682-1687 (1988).
- Knopman, D. S., et al.
- Troncoso, J. C., et al. Neuropathology in controls and demented subjects from the Baltimore Longitudinal Study of Aging. Neurobiol. Aging. 17, 365-371 (1996).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Braak, H., Braak, E.
- Frings, L., et al. Asymmetries of amyloid-β burden and neuronal dysfunction are positively correlated in Alzheimer's disease. Brain. 138 (Pt 10), 3089-3099 (2015).
- Leroy, F., et al. New human-specific brain landmark: the depth asymmetry of superior temporal sulcus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1208-1213 (2015).
- Fink, M., et al. Lateralization of the serotonin-1A receptor distribution in language areas revealed by PET. Neuroimage. 45 (2), 598-605 (2009).
- Miller, A. K. H., Alston, R. L., Mountjoy, C. Q., Corsellis, J. A. N. Automated differential cell counting on a sector of the normal human hippocampus: the influence of age. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 10, 123-142 (1984).
- Brettschneider, J., Del Tredici, K., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Spreading of pathology in neurodegenerative diseases: a focus on human studies. Nat. Rev. Neurosci. 16 (2), 109-120 (2015).
- Nolan, M., Troakes, C., King, A., Bodi, I., Al-Sarraj, S. Control tissue in brain banking: the importance of thorough neuropathological assessment. J. Neural. Transm. (Vienna). 12, (2015).
- Wilcock, G. K., Esiri, M. M.
- Janota, I., Mountjoy, C. Q.
- Stefanits, H., Budka, H., Kovacs, G. G. Asymmetry of neurodegenerative disease related pathologies: a cautionary note. Acta Neuropathol. 123 (3), 449-452 (2012).
- King, A., Bodi, I., Nolan, M., Troakes, C., Al-Sarraj, S. Assessment of the degree of asymmetry of pathological features in neurodegenerative diseases. What is the significance for brain banks? J Neural Transm. (Vienna). 122 (10), 1499-1508 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R.
- Erskine, D., Khundakar, A. A. Stereological approaches to dementia research using human brain tissue. J Chem Neuroanat. , (2016).
- Lees, A. J. Unresolved issues relating to the shaking palsy on the celebration of James Parkinson's 250th birthday. Mov. Disord. 22 (Suppl 17), S327-S334 (2007).
- Iacono, D., et al. Parkinson disease and incidental Lewy body disease: Just a question of time? Neurology. 85, 1670-1679 (2015).
- Geuna, S., Herrera-Rincon, C. Update on stereology for light microscopy. Cell Tissue Res. 360 (1), 5-12 (2015).
- Drummond, E. S., Nayak, S., Ueberheide, B., Wisniewski, T. Proteomic analysis of neurons microdissected from formalin-fixed, paraffin-embedded Alzheimer's disease brain tissue. Sci. Rep. 5, 15456 (2015).
- Brickell, K. L., et al. Clinicopathological concordance and discordance in three monozygotic twin pairs with familial Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 78 (10), 1050-1055 (2007).
- Xiromerisiou, G., et al. Identical twins with Leucine rich repeat kinase type 2 mutations discordant for Parkinson's disease. Mov. Disord. 27 (10), 1323 (2012).
- Iacono, D., et al. Neuropathologic assessment of dementia markers in identical and fraternal twins. Brain Pathol. 24 (4), 317-333 (2014).
- Iacono, D., et al. Same Ages, Same Genes: Same Brains, Same Pathologies?: Dementia Timings, Co-Occurring Brain Pathologies ApoE Genotypes in Identical and Fraternal Age-matched Twins at Autopsy. Alzheimer Dis. Assoc. Disord. , (2015).
- Rentería, M. E. Cerebral asymmetry: a quantitative, multifactorial, and plastic brain phenotype. Twin Res. Hum. Genet. 15 (3), 401-413 (2012).
- Bishop, D. V. Cerebral asymmetry and language development: cause, correlate, or consequence? Science. 340 (6138), (2013).
- Mendez, M. F., et al. Observation of social behavior in frontotemporal dementia. Am. J. Alzheimers Dis. Other Demen. 29 (3), 215-221 (2014).
