This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Эта рукопись описывает введение функций клеток наведения с последующей прямой доставки клеток к этим функциям в гидрогеле bioink с использованием автоматизированной роботизированной системы дозирования. Частности bioink был выбран, поскольку это позволяет клеткам оседать в сторону и почувствовать особенности. Система дозирования bioprints жизнеспособных клеток в гидрогелевых bioinks используя противодавлении помощь печатающей головки. Тем не менее, путем замены печатающей головки с заостренным пером или скальпель, система дозирования может также быть использован для создания топографические сигналы путем травления поверхности. Движение стилуса может быть запрограммирован с шагом 10 мкм в X, Y и Z.. Узорчатые канавки были способны сориентировать мезенхимальные стволовые клетки, влияя на их принять удлиненную морфологию в соответствие с направлением канавок. Структурирование может быть разработан с использованием построения программного обеспечения в прямых линий, концентрических кругов и синусоидальных волн. В последующей процедуре, фиброзноВзрывы и мезенхимальные стволовые клетки суспендировали в 2% желатина bioink, для bioprinting в противодавления приводом экструзионной головки. Клетка подшипник bioink затем распечатаны с использованием тех же запрограммированным координаты, используемые для травления. В bioprinted клетки были способны воспринимать и реагировать на протравленных черты, как продемонстрировано их удлиненным ориентации вдоль направления протравленных канавок.
Преднамеренное структурирование размещения клеток способствует формированию культур , которые имитируют в естественных условиях клеточной организации 1. Действительно, исследование взаимодействия между несколькими типами клеток может быть оказана помощь путем организации их пространственного размещения 2,3. Большинство систем паттерна полагаются на процедуры модификации поверхности для содействия или предотвращения адгезии клеток с последующим пассивным осаждением клеток. Bioprinting предлагает пространственную и временную контроль над распределений клеток 1. В дополнение к этим функциям, bioprinting был описан как технически простой, быстрый и экономически эффективный способ для формирования геометрически сложных строительных лесов 4. Он использует разработки программного обеспечения компьютера и позволяет введение клеток в процессе изготовления 4.
Системы Bioprinting были отнесены к категории основаны на их принципах работы как лазер на основе, для струйной печати на основе или экструзии на основе 4, Экструзионная bioprinting был описан как наиболее перспективным , поскольку оно позволяет изготовление организованных конструкций клинически значимых размеров в реалистичные сроки 4-6. Она выполняется либо механическим или обратного давления при содействии экструзии гидрогеля bioink клеток подшипника. В способе, представленном здесь, использовали обратное давление. Как уже упоминалось, клетки доставляются в cytocompatible bioink. Такой bioink должна поддерживать доставку клеток , не вызывая вредного напряжения сдвига, и иметь достаточную вязкость , чтобы сохранить целостность печатного следа, без разрушения или распространения (упоминаемый как "чернила просачиваться") 7-10.
Взаимодействие клеток с их липкого поверхности, как известно, влияют на клеточное поведение. Рельеф поверхности может контролировать форму клеток, ориентации 11, и даже фенотип. В частности, изготовление пазов и каналов было продемонстрировано, чтобы побудитьрастянутая, удлиненная морфология на нескольких типах клеток. Применение данной морфологии было обнаружено, что влияние на фенотип мультипотентных и плюрипотентных клеток. Например, при выравнивании по канавкам, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , показывают доказательства дифференциации по отношению к кардиомиоцитов 12,13 и клеток гладкой мускулатуры сосудов принимают сократительную фенотип над синтетическим 10,14-17.
Клетка совместив каналы или канавки могут быть сформированы на полимерной поверхности с помощью ряда способов, например, глубоко реактивное ионное травление, литография электронный луч, прямой лазерной печати, фемтосекундного лазерного, фотолитографии и плазменного сухого травления 18. Эти подходы часто отнимает много времени, требует сложной аппаратуры и может быть ограничение в виде узора генерируемой. Кроме того, они не синхронизируются с bioprinting кучность и не позволяют к немедленному cellularization. Координационно контролируемое движение автоматизированнойсистема дозирования может следовать сложные шаблоны для осаждения растворов. Здесь показано, как движение микромасштабная под контролем может быть использована для создания каналов для клеточной ориентации. Заостренную стилус или скальпель прикреплен к печатающей головке вместо экструзионной шприца и оборудование может затем протравить поверхность полимера под руководством программного обеспечения черчения. Метод обеспечивает универсальность в конструкции картины и применима к полимерным материалам, обычно используемых в биоинженерии, таких как полистирол, PTFE, и поликапролактон. В качестве следующей стадии к травлению, клетки могут быть bioprinted непосредственно к поцарапанном канавками. Желатин bioink используется здесь был в состоянии поддерживать как след и позволяют осажденные клетки ощутить Протравленная черты. Мезенхимальные стволовые клетки bioprinted к протравленных канавок были продемонстрированы удлиняться вдоль них в различных линиях.
Важным шагом этой процедуры является фактическая поставка bioprinting стволовых клеток, поскольку процесс должен позволять оседания клеток с признаками, печать без bioink распространения / кровотечение, доставляют клетки без сдвига смерти стресс клеток и не вызывают дифференциацию по отноше…
The authors have nothing to disclose.
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Equipment | |||
Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
USB Microscope | |||
Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Spreadsheet | Excel | Excel | |
Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |