Introduction
Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）是一种嗜神经单链RNA病毒持续感染的鼠的中枢神经系统（CNS）。在易感小鼠中，感染TMEV导致免疫介导的慢性进行性脱髓鞘疾病，称为TMEV诱导脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）。小鼠的实验性感染发生的疾病过程类似，在多发性硬化症（MS）的渐进形式看到。 TMEV-IDD的特征在于两个不同的阶段：急性期和慢性期。急性期是一种温和的，通常亚临床性脑炎1,2。第二，慢性期，开始约一个月感染后，由一个缓慢进展残疾特征在于脱髓鞘，炎症和轴索损害1,2。在小鼠中观察到的疲软与痉挛，偶尔严重的强直性痉挛有关。
由于目前还没有medicatioNS改善逐步残疾患者，研究人员特别是TMEV，国际直拨电话，它代表了监测疾病修饰药物对疾病进展的影响，最佳的动物模型所吸引。然而，在小鼠中，以及在MS患者，残疾进展的监测需要在延长的时间周期的连续的临床观察。在小鼠中，对于残疾进展的长期监测可与旋转杆的性能测试来完成。
在转棒性能测试是一种标准的行为测试，用于评估运动相关的功能，例如协调性，平衡，和疲劳在啮齿类动物。小鼠必须保持平衡的转弯杆，这是在连续加速旋转;落入时间延迟从该杆被记录。与神经功能障碍的动物不能长留在旋转杆作为对照，他们当转速超过正常脱落的电机容量。更多的神经功能缺损动物们，他们越早脱落杆，以及更短的时间延迟。
旋转试验在传统的视觉评分系统的优点在于，它产生一个目标，可测量的可变时间延迟该最终可用于统计分析以量化疗法和实验程序3的效果。
在免疫学（LONI）中的达特茅斯实验室，将小鼠进行的适配协议，在那里它们被TMEV感染前测试，以便与机器使他们熟悉并评估其正常的“基线”平衡协调和电机控制4， 5。一旦基线建立和小鼠被感染TMEV，它们过了一段数月测定一次或每周两次。实际测试协议为期150天的平均值，从而允许进行评估平衡，协调和电机控制的降幅比脱髓鞘疾病的全过程。
几百TMEV，IDD和假治疗的小鼠迄今已测试达特茅斯神经功能障碍。这些小鼠接受了各种免疫调节治疗方法，但没有药剂已发现可有效地改善残疾进展6,7。本文章及相关协议描述了如何通过定性TMEV-IDD小鼠显示进行性神经损害。特别是，该协议提供的认为是一般适合学习使用旋转试验TMEV-IDD小鼠神经失具体的测试参数的建议。此过程提供对照评估一个基线（1）该小鼠模型来进行性MS和（2）它的实用性，用于测试旨在治疗进行性神经疾病如MS疗法的相关性。显然，转棒性能测试和当前优化测试参数和协议不仅在该TMEV-IDD小鼠模型检测进行性神经障碍是有用的，但是，可以在中神经变性疾病的其他病毒诱导的和/或遗传小鼠模型揭示损伤是有用的。
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Protocol
所有的动物利用工作的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在医学盖泽尔学院达特茅斯审查和批准协议。
1.小鼠模型
- TMEV诱导脱髓鞘疾病的诱导
- 移动包含从机架4-6周龄的雌性SJL / JHan小鼠舒适的工作空间中的笼中。标记小鼠（ 例如，用耳标或耳冲），以允许临床和组织学疾病的个体的评价。
- 绘制30微升TMEV感染库存（2×10 6噬斑形成单位; PFU）的在PBS中成29隔距胰岛素注射器和针头。
- 准备麻醉气体机：检查系统，以保证足量的氧气和异氟烷的过程期间存在。
- 打开流量计1升/分钟。放置动物进入吸气室和密封的顶部。打开VAporizer至3.5％和监视动物直到横卧。
- 从室取出的动物，捏住脚垫，保证足够的麻醉测试鼠标。缺乏应对强大的捏表示充分麻醉。
- 清洁注射部位用70％的异丙醇。
- 注入30微升TMEV感染股票的成徒手注射（ 图1）的右大脑半球。注射的部位是眼睛和耳朵线之间，只是离中线大约一半。
- 返回鼠标其控股笼一次高度警惕和移动（通常为3 - 5分钟）。
- 安乐死通过放血或心脏灌注小鼠TMEV感染后3至6个月，这取决于疾病的发展的速度。
2.转棒分析
- 该转棒仪
- 之前TMEV感染小鼠的试验与以他们熟悉机，并评估其正常基线平衡协调和电机控制。
- 开始在5日的适配协议感染后（DPI， 即 TMEV感染前5天）。
- 允许小鼠适应到测试室转棒至少30分钟前的测试，以便使它们能够适应环境。
- 确保两个旋转杆单元和计算机已经插入并彼此连接（ 图2）。
- 预先设定的旋转杆与-5 dpi的训练协议参数，如表1所述。
- 保存日期和标识信息的工作文件。
- 移动包含小队要从机架测试邻近于旋转杆的表笼。小鼠通常在4小队进行测试。
- 由尾拿起小鼠，并将其放置在杆，面向远离操作者。重复到第四鼠标的第二位。如果鼠标FALLS或跳转，将它放回到它的旋转杆车道，直到所有的小鼠在适当的位置。如果忽略任何老鼠转身面对运营商。
- 加载所有的老鼠后，按“Enter”键开始实验。观察计时器自动启动，每展出每条车道分钟（RPM）的旋转。
- 由于每个动物从杆下降时，记录在秋天时的杆的速度，以及时间的持续时间的动物保持在杆上。该杆将继续转动，直到最后动物已经从杆组件下降。
- 之后所有的老鼠都下降了，用纸巾从杆删除任何粪便勃利和尿液。尿液和粪便材料的存在可能会影响小鼠握棒的能力。
- 3分钟休息后，给小鼠第二次，然后第三个审判。每个单次试验的最大时间为240秒。在每个测试日辖共3项试验。
- 返回老鼠的笼子，并返回他们回到机架中。在实验期结束时，清洗旋转杆用肥皂和水去除所有排泄物关了机。
- 用干净的乙醇70％的底板。喷洒下来整机用二氧化氯消毒。
- 天- 4 - 3， - 2，和- 1圆周率，预先设定的旋转杆与相应的训练协议参数，如表1所述，并重复步骤2.1.2至2.1.12。
- 获得基线措施后，感染与TMEV老鼠。允许6天PI恢复期。
| 协议 | 测试日 | 频率 | 起动转速（rpm） | 马克斯转速（rpm） | 促进 | 试验 | ITI |
| （转/秒） | 为（N×秒） | （分钟） | |||||
| 训练 | - 5 DPI | 1天 | 1 | 12 | 01/03 | 3x240秒 | 3 |
| - 4 DPI | 1天 | 1 | 13 | 01/03 | 3x240秒 | 3 | |
| - 3 DPI | 1天 | 1 | 14 | 01/03 | 3x240秒 | 3 | |
| - 2; - 1 DPI | 1天 | 五 | 40 | 01/03 | 3x240秒 | 3 | |
| 试验 | 从+7至+50 DPI | 2 /周 | 五 | 40 | 05/30 | 3x240秒 | 3 |
| 从+51到+150 DPI | 1周 | 五 | 40 | 05/30 | 3x240秒 | 3 |
表1：转棒参数培训与实验方案。
- 该转棒实验协议
- +7 dpi的，预先设定的旋转杆与相应的实验协议参数，如表中所述1。重复步骤2.1.2至2.1.10。
- 在审判＃3月底，权衡每个鼠标和记体重的数据表上。清洁和消毒旋转杆按步骤2.1.11和2.1.12。
- 测试小鼠每周两次对下列6周，如上所述。 6周每周一次使用相同experimenta（其中小鼠可能已经达到了一个平台期）8,9，测试小鼠后l协议。实际测试协议持续150天的平均值，这取决于具体的疾病过程。
- 神经功能指数
- 导出原始数据到电子表格文件，并分析结果。
- 如运行时间（ 图3A）Express数据：这是在正常运行时间加上被动旋转时间减去旋转延迟时间（ 表2）10。计算每日的三次试验的平均运行时间。
- 快递数据作为神经功能指数（NFI; 图3B）。
- 计算每个鼠标的基准性能门槛。基准性能阈值确定为从天所有的运行时间的平均值±15 + 45圆周6,7。
- 计算NFI为最近的三个平均运行时间由特定的鼠标6,7的基准性能阈值除以平均值</ SUP>。
注意：如果测试运行时间的日+ 72小鼠，+ 76和+ 79圆周率是55秒，45秒和50秒，基线时间为相同的鼠标为135秒时，NFI该鼠标在+79 dpi将是[（45 + 50 + 55）/ 3] / 135或0.37。
- 快递数据作为调整NFI（adjNFI; 图3C）：由单一实验中总体值调整NFI数据。
- 除以平均NFI由假治疗组在该特定日期获得的NFI值计算adjNFI。
| 术语 | 定义 |
| 正常运行时间 | 的总时间的小鼠花费在转动杆主动运行， 即 ，等待时间下降。 |
| 被动旋转时间 | 在一个时间安装鼠标一直在被动旋转模式杆。 |
| 旋转延迟时间 | 被动旋转模式期间的时间的小鼠保持在杆的量 |
| 被动旋转模式 | 当鼠标抓住杆和无需走动旋转。 |
| 总会话时间 | 时间总量鼠标保持在会议期间旋转杆。 |
| 基准性能 | 预损伤电机性能评估，以确定该最低性能阈值。 |
| 神经功能指数（NFI） | 临床指标，其中每个小鼠电机性能进行比较， 即，运行时间，在任何时候其最佳性能。 |
| 调整后的神经功能指数（adjNFI） | 当施加正常化过程通过为人口值来调节NFI数据单一的实验。 |
| 总体值 | 在特定的一天假治疗组获得的平均NFI值。 |
表2：采用量化神经损伤转棒参数的定义。
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Representative Results
该代表性实验的目的是比较由丹尼尔斯（DA）菌株和TMEV豆应变诱导的神经学障碍。本研究的目的，一组32例女性SJL小鼠用TMEV感染脑内，无论是DA株（N = 16）或豆株（N = 16），其临床症状随着时间的推移进行了监测。 20只小鼠的另外一个组假处理（ 即生理盐水溶液注入脑内），并担任健康对照组。
在转棒性能试验来评价在TMEV感染的小鼠与假控制慢性疾病进展。小鼠单独耳标，并在一周的TMEV注射前，然后，历时125天实际测试协议，每天经受适配协议。对于每个测试日，运行时间，定义为钛的长度我将鼠标停留在杆上，被单独保存每只小鼠的3项试验的那一天的平均值。转棒数据也表示为NFI和假归adjNFI。
如图3A所示，感染TMEV小鼠的运行时间的不利影响。重复测量双向方差分析显示TMEV感染（F = 56.76，P <0.0001）的显著效应以及时间的显著效果（F = 3.26，P <0.0001）和时间处理交互作用（F = 8.065，p <0.0001）。下面Dunnett的多重比较试验表明，TMEV感染的小鼠的两组患者显著低NFI值高于假小鼠（P≤0.01; 图3B）。差异有统计学显著开始在一天61 + PI到后续的结束 （ 图3B）。有没有区别的合作mparing残疾进展在感染了豆应变和那些被感染的DA应变在所有时间点（第 > 0.5; 图3C）的小鼠。
图 1： 颅内注射要执行注射颅内，鼠标气体麻醉和抑制在固体表面。截至30微升安全地注入到小鼠大脑。注射部位大约是眼睛和耳朵线之间，并就在中线一半。 A 30摹针直接刺入颅内，和胰岛素注射器方便地用于防止针太深延伸到大脑。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 该转棒仪旋转试验是标准的神经行为测定，其中小鼠被训练在旋转杆运行和被定时为他们可以多久留在杆因为它慢慢加快。杆悬挂笼子楼以上，和老鼠自然尽量留在杆，以避免坠落到地面。从杆到仪器的底部的下降导致没有伤到小鼠A）标准转棒装置由具有恒定或加速的速度的电动机驱动的杆。B）的小组划分杆成单独的车道，每个适合于动物个体。 4只小鼠的总数目可以每个试验。℃持续进行测试）。杆是在1.18。（直径约3厘米），并在其表面被滚花，使小鼠，以获得更好的抓地力。鼠标的秋天，正是由于照片光束追踪到自动记录的时间花费在杆上的量。实验数据记录在后小老鼠就都从杆倒下的一台电脑。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：在TMEV感染小鼠和假控制旋转杆性能测试进行旋转试验来测量假，DA-感染的运动功能和豆感染小鼠。除了运行时间（秒）（A），旋转杆的数据也表现为神经功能指数（NFI）（B），和一个假规范化调整NFI（adjNFI）（C）。潜伏期从加速旋转杆倒在每天的三个试验测定。数据表示为平均值（SEM）的平均值±标准误差。 BLUE圈，N = 16豆感染小鼠;红色正方形，N = 16 DA-感染小鼠;黑色三角形，每组20只假处理的对照。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
尽管有一些限制，所述旋转杆的性能测试代表用于评估TMEV-IDD运动功能和功能障碍，以及药理干预对残疾进展中的小鼠的影响的重要工具。
旋转试验是在1957年首次描述为在啮齿类动物11测量神经功能缺损的工具。鼠害必须走在旋转的杆，随着转速，并尽量避免坠落到地面。落入延迟被记录并用作定量终点运动功能：越神经功能缺损的动物有，越早它们脱落杆。此测试在传统的视觉评分系统的明显的优点在于，它产生可用于统计目的量化疗法和实验程序对残疾进展3的影响的目标变量。视觉评分系统如扶正reflex检验可能是优选的作为一个更简单和更快速的测试，以评估在小鼠中运动的能力。然而，这些系统缺乏像转棒性能测试更加定量测试的精度，并且它们因此不应被用于监控的自然史或轻度和进行性神经损伤的小鼠的表型的改变。另一方面，视觉测试，如正位反射测试特别适合于那些太小或太受影响的要在转棒测试小鼠。
为了避免旋转试验的失真评估，测试参数（ 即，大小，速度和旋转杆的加速度;的给予动物训练量;以及最终的数据处理）必须仔细重复3。如今，旋转杆性能测试仍然是最常用的电机行为测试，尚未有对理想的测试参数很少共识，以产生最佳的效果。我们发现与已经在使用棒直径从1.18至1.6 TMEV-IDD小鼠的研究。（3至4厘米）12,13，在5至10转12,13定速率，和5至10转/分的加速度12-14。然而，这是未知的关于神经差别的结论是否会推广到其他的测试条件。本协议提供的是进行了优化，因而适合于使用旋转试验MS的TMEV-IDD小鼠模型研究进行性神经功能障碍的具体检测参数的建议。特别是，在开始对小鼠一转棒运动功能研究之前，建议了许多潜在的重要因素 - 在其他中，基准性能和被动旋转被考虑。
首先，关于基准性能：行使和未感染的小鼠随时间改进其电动机的性能，最终达到在数天或数周8,9-一个稳定的平台。这是个运动学习过程的正常进行电子的结果。然而，这种改善是不是永久性的，并且如果小鼠左未经训练数天，在旋转杆的电动机性能会下降迅速9。因此，基准性能判定为治疗干预后运动学习和实际回收区分是至关重要的，以及一个生理电动机性能下降之间并恶化由于实验过程。
我们的优化转棒协议期望从+ 15训练TMEV-IDD小鼠+ 45 dpi的（ 即，在急性脑炎，它发生之间在+ 3〜+ 12 dpi的，和已故慢性脱髓鞘疾病，其发展为+ 30〜 + 40 dpi）的15。这允许电动机性能进行性脱髓鞘的结果评估，因此排除了任何有助于赤字由于前期脑炎。理想情况下，旋转杆培训前应进行诱发疾病。然而，为了开发CNS的慢性感染，SJL小鼠必须的16岁的7 次前一周与病毒注射。由于普遍接受的是，该旋转试验可以执行上是8 26周17，一个有效的训练会话不能在TMEV感染前小鼠完成动物的年龄。
训练和基线性能评价也很重要，以排除低动力，低的基础性能，和低学习技能的影响。每个动物是不同的，并且这些不同需要在机动性能评估被考虑。这最好通过使用一个基准性能归指数，也称为NFI补救。该指数也占可能在小鼠中不同的测试会观察业绩波动较大。性能变化是在行为测试的一个常见问题，主要是由于外部的实验因素协议，如低动机和过去的动物的经验。运行时间为每个小鼠的最后三个时间点的平均提供如果性能保持稳定，预计分布的集中趋势的估计。这说明了一天到一天的个人表现的差异。严重的神经障碍，然后由小于或等于0.3 NFI值定义的，而相对不受影响小鼠拿下NFI值大于或等于0.7。不幸的是，这种策略并不能完全去除激励的变化可能会影响发动机性能的问题。进一步解决此问题，小鼠可与另外的特定激励功能，如之前训练温和食物剥夺或落入由17.5可调落下高度引起23.5恐惧增加训练。（44.5至60厘米）。
第二，关于被动旋转或循环：也许到瓦利的最重要的威胁转棒数据dity是出现当鼠标可以紧贴于和被动旋转的杆转动18被动旋转的发生。虽然在转棒观察被动旋转，尤其是在经历了小鼠运动协调的问题，这种应对行为可能会导致后期脱落杆，这会错误地指示没有运动障碍。因此，干扰运动协调的次级量度，其中应在数据分析中被考虑，是的次数的计数的鼠标转动围绕杆没有脱落。此外，被动旋转强烈由任务参数，如杆18的直径，速度和加速度度的影响。有用于减少被动旋转的风险没有完美的解决方案，但在可能的分辨率可以是具有较大直径的使用的杆（即 1.18 3.15英寸（3至8厘米））或较不显着的脊，以便稍稍减少鼠标的抓地力。</ P>
在转棒性能试验的一个限制是，电动机评估被限制为短的观测时间。此外，在该光-暗循环的不同时间点测试可能会改变行为测试19的结果。因此，为了克服这些问题，有几家公司正在开发提供全天候监控啮齿动物行为的创新家笼分析系统。这些监控系统无疑代表了啮齿类动物行为学研究提供的最新和最令人兴奋的技术，但仍然非常昂贵，并不总是研究实验室访问。
综上所述，旋转杆性能试验是在TMEV-国际直拨电话，进行性MS的鼠类模型神经失的长期评估一个相对简单，价格低廉，并充分表征测试。此测试在传统的临床症状评分系统的优点在于，它产生一个目标变量QUAntify的不同药物，条件和运动功能的程序的影响。给出的转棒性能测试的鲁棒性，通过施加一些简单的预防，如上所述，该过程提供了对照评估一个基线（1）TMEV-IDD小鼠模型的相关性进行性MS和（2）它的用处用于测试旨在治疗进行性神经疾病如MS疗法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old | Envigo | #052 | |
| TMEV virus stock | |||
| Isoflurane vaporizer | Harvard Apparatus | #340471 | |
| Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc | BD | #328203 | |
| Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software | Columbus Instruments | #0890M |
References
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