Introduction
タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）が持続的に、マウスの中枢神経系（CNS）に感染神経向性一本鎖RNAウイルスです。感受性マウスでは、TMEVによる感染はTMEV誘発性脱髄疾患（TMEV-IDD）として知られる免疫介在性、慢性進行性の脱髄疾患を引き起こします。マウスの実験的感染は、多発性硬化症（MS）の進行形で見られるものに似ている病気のコースを取ります。急性期と慢性期：TMEV-IDDは、2つの異なる相によって特徴付けられます。急性期は軽度、通常は不顕性脳炎1,2です。第二、慢性期は、感染後約一ヶ月始め、脱髄、炎症、および軸索損傷の1,2によって特徴づけゆっくりと進行する障害者で構成されています。マウスで観察された弱さは痙縮と、時折、重度の強直性痙攣に関連しています。
現在のところmedicatioはありませんので、NSは患者に進行性の障害を改善するために、研究者は、特に疾患の進行上の疾患修飾薬の影響を監視するための最適な動物モデルを表しTMEV-IDDによって引き付けられます。しかし、マウスならびにMS患者では、障害の進行のモニタリングは、長期間にわたって連続的に臨床的観察を必要とします。マウスでは、障害の進行の長期的な監視は、ロータロッド性能試験を用いて達成することができます。
ロータロッドの性能試験は、げっ歯類の調整、バランス、疲労などのモータ関連する機能を評価する標準的な行動試験です。マウスは、連続的な加速の下で回転している回転ロッド、上の彼らのバランスを維持する必要があります。このロッドから落ちるまでの時間待ち時間が記録されています。神経機能障害を有する動物は、対照限り、回転ロッド上に留まることができない、と回転速度を超えたとき、彼らは通常、ドロップオフ、それらモータ容量。動物が持っているより多くの神経学的障害は、すぐに彼らは棒から落ちる、と短い時間の待ち時間があります。
従来の視覚的スコアリングシステム上のロータロッド試験の利点は、それが目的を生成することである、測定可能な可変時間遅延の最終的療法および実験手順3の効果を定量化するために統計分析のために使用することができます。
ダートマスでの神経免疫学の研究所（LONI）では、マウスは、それらは機械でそれらを理解し、それらの通常の「ベースライン」のバランス調整とモータ制御4を評価するために、前TMEV感染にテストされ、適応プロトコルに供されています5。ベースラインが確立され、マウスはTMEVに感染していると、それらは数ヶ月の期間にわたって一回又は週二回試験します。実際の試験プロトコルは、このように評価を可能にする、150日の平均持続します脱髄疾患の全体にわたってバランス、調整、およびモータ制御の衰退。
数百TMEV-IDDおよび偽処置マウスは、ダートマスで神経機能障害のために、これまでに試験されています。これらのマウスは、様々な免疫治療を受けていたが、何の薬理学的薬剤は、障害の進行6,7を改善するのに有効であることが見出されていません。現在の記事と関連プロトコルがTMEV-IDDマウスで表示される進行性の神経障害を特徴づける方法について説明します。特に、プロトコルは、ロータロッド試験を用いてTMEV-IDDマウスにおける神経障害を研究するための一般的に適切であると考えられ、特定のテスト・パラメータの推奨を提供しています。この手順では、MSのような進行性の神経学的症状を治療することを目的とした治療法を試験するための進行型MSにこのマウスモデルの（1）関連性と（2）その有用性を評価するに対してベースラインを提供します。明らかに、ロータロッド性能試験と現在の最適化されたテスト・パラメータおよびプロトコルはTMEV-IDDマウスモデルにおいて進行性の神経障害を検出することだけでなく、有用であるが、他のウイルス誘導性および/または神経変性疾患の遺伝的マウスモデルで障害を暴くにも有用です。
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Protocol
全ての動物の作業はダートマスで医学のガイゼル学校で検討し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルを利用しています。
1.マウスモデル
- TMEV誘導性脱髄性疾患の誘導
- 快適な作業スペースにラックから4〜6週齢の雌SJL / JHanマウスを含むケージを移動します。臨床および組織学的疾患の個々の評価を可能にするために（耳タグまたは耳パンチと、例えば ）マウスをマークします。
- 29ゲージのインスリン注射器と針にPBS中、TMEV感染株式（PFU 2×10 6プラーク形成単位）の30μLを描画します。
- 麻酔ガスマシンを準備します。手順の期間中、酸素およびイソフルランの適切な量の存在を確実にするためにシステムをチェック。
- 1L /分に流量計の電源をオンにします。誘導室に動物を置き、上部を密封します。 VAをオンにします3.5％にporizerとリカンベントまで、動物を監視します。
- チャンバーから動物を削除し、適切な麻酔を確保するために、フットパッドをつまんでマウスをテストします。強いピンチへの応答の欠如は、十分な麻酔を示しています。
- 70％イソプロピルアルコールで注射部位をきれいにしてください。
- フリーハンド注射（ 図1）によって、右大脳半球にTMEV感染株式の30μLを注入します。注射部位は、ほぼ中間の目と耳のラインとの間に、ちょうど正中線から外れています。
- （ - 5分、通常3）警報や携帯一度完全にその保持ケージにマウスを返します。
- 疾患の発症の速さに応じて、3〜6ヵ月TMEV感染後放血または心臓灌流によってマウスを安楽死させます。
2.ロータロッド分析
- ロータロッド装置
- 試験マウスでそれらを理解するためにTMEV感染する前にマシンとそれらの正常なベースラインのバランス調整とモータ制御を評価します。
- -5日に適応プロトコル感染後（; すなわち、5日TMEV感染前の解像度）を起動します。
- マウスは、それらが環境に適応することを可能にするために、少なくとも30分前にロータロッドのテストのために試験室に順応することを可能にします。
- ロータロッド装置とコンピュータの両方が接続され、（ 図2）相互に接続されていることを確認します。
- 表1に記載したように、-5解像度トレーニングプロトコルパラメータでロータロッドを予め設定。
- 日付と識別情報と作業ファイルを保存します。
- ロータロッドに隣接テーブルにラックから試験しようとする部隊を含むケージを移動します。マウスは、通常、4の分隊で試験します。
- 尾によってマウスをピックアップし、棒の上に置き、オペレータから離れて直面しています。第マウスを介して第2の手順を繰り返します。マウスFAL場合すべてのマウスが定位置になるまでのlsやジャンプ、ロータロッド上の車線に戻ってそれを置きます。任意のマウスは、オペレータに直面して好転させる場合は無視します。
- すべてのマウスをロードした後、実験を開始するには、「Enter」ボタンを押してください。タイマーが各レーンのために自動的に起動し、ディスプレイ上の毎分回転数（rpm）を観察。
- 各動物がロッドから落ちるように、動物がロッド上に残って落下時のロッドの速度だけでなく、時間の長さを記録。ロッドは、最後の動物がロッドアセンブリから低下するまで回転し続けるだろう。
- すべてのマウスが落ちた後、ロッドから任意の糞便丸薬および尿を除去するための組織を使用しています。尿および糞便物質の存在が把持するマウスロッドの能力に影響を及ぼし得ます。
- 3分間の休憩の後、マウスを三裁判後、第2とを与えます。単一の試行あたりの最大時間は240秒です。各試験日の間に3試験の合計を管理します。
- 彼らのホームケージにマウスを返し、バックラックにそれらを返します。実験セッションの最後に、マシンからすべての糞便を削除するには、石鹸と水でロータロッドをきれいに。
- エタノール70％できれいにベースプレートを拭いてください。消毒するために二酸化塩素でマシン全体を下にスプレーしてください。
- 4、 - - 3、 - 2、および-日に1パイ、 表1に記載されているように、適切な訓練プロトコルパラメータでロータロッドをあらかじめ設定し、繰り返しは2.1.12に2.1.2を繰り返します。
- ベースライン測定を得た後、TMEVをマウスに感染させます。 6日間のパイの回復期間を許可します。
| プロトコル | テストデー | 周波数 | 開始数（rpm） | マックス数（rpm） | 加速度 | トライアル | ITI |
| （回転/秒） | （NのX秒） | （分） | |||||
| トレーニング | - 5解像度 | 1日 | 1 | 12 | 1月3日 | 3x240秒 | 3 |
| - 4解像度 | 1日 | 1 | 13 | 1月3日 | 3x240秒 | 3 | |
| - 3解像度 | 1日 | 1 | 14 | 1月3日 | 3x240秒 | 3 | |
| - 2; - 1解像度 | 1日 | 5 | 40 | 1月3日 | 3x240秒 | 3 | |
| 実験的 | 7から50解像度へ | 2 /週 | 5 | 40 | 5月30日 | 3x240秒 | 3 |
| 51から150 dpiのに | 1週間 | 5 | 40 | 5月30日 | 3x240秒 | 3 |
表1：トレーニングと実験プロトコールでのロータロッドのパラメータ。
- ロータロッド実験プロトコール
- 表1に記載されているように、適切な実験プロトコルのパラメータを持つ7 dpiの、予め設定されたロータロッドに。繰り返し2.1.2 2.1.10にステップ。
- トライアル＃3の終わりに、各マウスを計量し、データシートに体重をメモします。清潔でステップ2.1.11および2.1.12ごとにロータロッドを消毒。
- 前述したように、次の6週間、週2回のマウスをテストします。 （マウスはそうプラトー期に達しているに）6週8,9の後、同じエクスペリで週に一度マウスをテストしますリットルプロトコル。実際の試験プロトコルは、特定の疾患の経過に応じて、150日間の平均を持続します。
- 神経学的機能インデックス
- スプレッドシートファイルに生データをエクスポートし、結果を分析。
- 走行時間（ 図3A）のようなエクスプレスデータ：これは通常の実行時間を加えた受動回転時間マイナス回転遅延時間（ 表2）10です。一日あたり3回の試験の平均実行時間を計算します。
- 神経学的機能指数（; 図3B NFI）などのデータを表現します。
- 各個々のマウスのベースラインパフォーマンスのしきい値を計算します。ベースライン性能閾値は+ 15 + 45π6,7日目から実行中のすべての時間の平均値として決定されます。
- その特定のマウス6,7のベースラインパフォーマンスのしきい値で割った最新の3つの平均実行時間の平均としてNFIを計算します</ SUP>。
注：そのマウスのために、日+ 72上でのマウスのための試験を実行している回場合は+ 76、および+ 79 piが55秒、45秒、50秒であり、同じマウスのベースライン時間は135秒であった、NFI 79 dpiの上に[（45 + 50 + 55）/ 3] / 135または0.37になります。
- 調整後のNFI（adjNFI; 図3C）などのデータを表現する：単一の実験のための人口値によってNFIデータを調整します。
- その特定の日に偽処置グループによって得られた平均NFIによってNFI値を割ることによりadjNFIを計算します。
| 期間 | 定義 |
| 通常走行時 | マウスが積極的に回転棒上で実行されているに費やす合計時間は、 すなわち 、待ち時間が落下します。 |
| 受動回転時間 | Aマウスは受動回転モードでロッド上に留まっている時間をマウントします。 |
| 回転遅延時間 | マウスは受動回転モード時にロッド上に残っている時間の量 |
| 受動回転モード | マウスは、ロッドをつかみ、歩行することなく回転すると。 |
| 総セッション時間 | マウスは、セッション中に回転棒上に残っている時間の合計。 |
| ベースライン性能 | プリダメージモータの性能は最低性能閾値を決定するために評価します。 |
| 神経機能指数（NFI） | 各マウスの運動性能を比較した臨床指標、 すなわち、そのピーク性能にいつでも、時間を実行しています。 |
| 調整後神経機能指数（adjNFI） | 正規化処理は、母集団の値によってNFIデータを調整するために適用される場合単一の実験。 |
| 母集団値 | 特定の日で、偽処置群によって得られた平均NFI値。 |
表2：神経学的障害を定量化するために採用したロータロッドパラメータの定義。
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Representative Results
この代表的な実験の目的は、ダニエルズ（DA）株およびTMEVの豆株によって誘発される神経学的障害を比較することでした。本研究の目的のために、32雌SJLマウスの群（n = 16）、TMEVと頭蓋内DA株（N = 16）、またはマメ株のいずれかを感染させ、それらの臨床的徴候は、経時的にモニターしました。 20匹のマウスのさらなる群は、偽は、処理された（ すなわち、生理食塩液を頭蓋内注射した）と健常対照群としました。
ロータロッド性能試験はTMEV感染マウスと偽対照における慢性疾患の進行を評価するために使用しました。マウスは個別に耳マークされ、前TMEVの注入にした後、125日間続いた実際の試験プロトコルに週に毎日適応プロトコルに供しました。各試験日、走行時間については、TIの長さとして定義私ロッドにとどまったマウスは、その日の3試験の平均として各マウスについて個別に保存しました。ロータロッドデータもNFIのように偽の正規化adjNFIとして表現されます。
図3Aに示すように、TMEV感染は、負のマウスの走行時間に影響を与えました。反復測定二元配置ANOVAは、TMEV感染（F = 56.76、P <0.0001）の有意な効果だけでなく、時間の有意な効果（F = 3.26、P <0.0001）および時間治療の相互作用（Fを=明らかにしました8.065、p <0.0001）。 （; 図3B 0.01≤p）は以下のダネットの多重比較検定はTMEV感染マウスの両群は偽マウスのものより有意に低いNFI値を有していたことが明らかになりました。違いは、フォローアップの最後に+ 61パイの日に起動する統計的に有意でした （ 図3B）。差異の共同はありませんでした豆株および全ての時点でDA株に感染したもの（; 図3C のp> 0.5）に感染したマウスに障害の進行をmparing。
図1： 頭蓋内注射 、頭蓋内注射を行うために、マウスは、ガス麻酔し、固体表面上に拘束されます。最大30μlを安全にマウスの脳に注入されます。注射部位は、目と耳のラインとの間に、ちょうど正中線オフの約半分です。 30 G針を直接頭蓋を貫通し、インスリン注射器は、好都合には、脳に深く延びるの針を防止するために使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： ロータロッド装置は、ロータロッド試験は、マウスが回転棒上で実行するように訓練されて、それはゆっくりとスピードアップとして、彼らは棒に滞在することができますどのくらいのためにタイムアウトされている標準的な神経行動学的アッセイです。ロッドは、ケージの床の上に懸架され、マウスが自然に地面に転倒しないようにロッドに滞在してみてください。楽器のベースにロッドからのドロップのマウスへの損傷を引き起こさない。A）標準ロータロッド装置は、一定または加速速度でモータ駆動ロッドで構成されています。B）のパネルはそれぞれに適した、別々のレーンにロッドを分割個々の動物。 4匹のマウスの合計数は、各試験の間に試験することができる。C）ロッドで1.18である。（約3cm）の直径であり、その表面は、マウスがより良いグリップを取得することができ、ローレット加工されています。マウスの秋には、正確にその写真ビームによって追跡されます自動的にロッドに費やす時間の量を記録します。マウスはすべての棒から落ちた後に実験データをコンピュータに記録されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TMEV感染マウスおよび偽対照におけるロータロッド性能試験ロータロッド試験は、偽の運動機能を測定するために実施したDA-感染、およびBEAN感染マウス：図3。時間（秒）（A）を実行しているほかに、ロータロッドデータも神経機能指数（NFI）（B）、および偽正規化、調整NFI（adjNFI）（C）として表しました。加速ロータロッドから落下する待ち時間は、1日あたり3回の試験で測定しました。データは、平均±平均の標準誤差（SEM）として提示されています。 BLUE円、N = 16豆感染マウス。赤い四角はn = 16、DA感染マウス。黒三角、N = 20偽処理を制御します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの制限があるにもかかわらず、ロータロッド性能試験は、運動機能および機能不全TMEV-IDD中だけでなく、マウスでの障害進行に対する薬理学的介入の効果を評価するための重要なツールを表します。
ロータロッド試験は、最初にげっ歯類11で神経学的欠損を測定するためのツールとして、1957年に記載されました。げっ歯類は、回転速度の増加に伴って、回転棒の上を歩くと、地面に転倒しないようにしようとする必要があります。落下する待ち時間を記録し、運動機能の定量エンドポイントとして使用されている：動物が持っているより多くの神経学的障害は、すぐに彼らは棒から落ちます。従来の視覚的スコアリングシステムに対するこの試験の明確な利点は、障害の進行3の治療および実験手順の効果を定量化する統計目的のために使用することができる目的変数を生成することです。このような立ち直りリフレなどの視覚的スコアリングシステムXテストは、マウスにおける運動能力を評価するための、より簡単で迅速なテストであるとして優先される場合もあります。しかし、これらのシステムは、ロータロッド性能試験のような、より定量試験の精度を欠いており、従って、それらは自然史または軽度および進行性の神経学的障害を持つマウスの表現型の変化を監視するために使用すべきではありません。一方、立ち直り反射試験のような視覚的な試験は、特にロータロッド上でテストするには若すぎるか、あまりにも影響を受けているマウスに適合されています。
ロータロッド試験の歪んだ評価を避けるために、試験パラメータ（ すなわち、大きさは、回転ロッドの速度、加速度、動物に与えられたトレーニングの量と、最終的なデータ処理）を注意深く3を複製しなければなりません。今日は、ロータロッドの性能試験は、依然として最も一般的に使用されるモータ行動試験で、まだ最適な結果を生成するための理想的なテストパラメータにはほとんどコンセンサスが存在します。我々は発見しました1.6に1.18からロッド径を使用していたTMEV-IDDマウスを用いた研究。（3〜4センチ）12,13、5〜10 rpmで12,13の固定速率、及び5〜10回転/分の加速率12-14。しかし、神経学的な違いについての結論は、他の試験条件に一般化するかどうかは不明です。現在のプロトコルは、最適化され、ロータロッド試験を用いて、MSのTMEV-IDDマウスモデルにおいて進行性の神経障害を研究するために適しているし、特定のテスト・パラメータの推奨を提供しています。特に、マウスでのロータロッド運動機能の研究に着手する前に、それが潜在的に重要な要因-の中で他のもの、ベースライン性能と受動回転する考えの数ことをお勧めします。
最終的には数日または数週間8,9にわたって安定したプラトーに達し、時間をかけて彼らの運動性能を向上させる行使し、非感染マウス：まず、ベースラインの性能に関する。これは番目です運動学習の通常のプロセスの電子結果。しかし、この改善は永久的ではなく、マウスを数日間訓練を受けていない残っている場合、回転ロッド上での運動性能は急速に9をドロップします。したがって、ベースラインパフォーマンスの決意は、治療的介入の後だけでなく、生理的な運動能力の低下との間および実験手順の悪化により運動学習と実際の回復を区別することが重要です。
私たちの最適化されたロータロッドプロトコルは、+ 12解像度に+ 3内で起こる急性脳炎、およびに+ 30から発症後期慢性脱髄疾患、間に+ 45解像度（ すなわち、まで+ 15からTMEV-IDDマウスを訓練することを期待します+ 40 DPI）15。これは、進行性脱髄の結果として運動性能の評価を可能にし、したがって、早期の脳炎に起因するいかなる貢献赤字を除外します。理想的には、ロータロッドトレーニング前に行うべきです疾患誘導。しかしながら、CNSの慢性感染症を開発するために、SJLマウスは、16歳のその7 週目の前にウイルスを注射しなければなりません。それは一般的にロータロッドテストは上で実行することができ、動物の年齢は8〜26週間17であることが認められているので、効果的なトレーニングセッションは、TMEV感染前にマウスで完了することができません。
トレーニングとベースラインの性能評価も低いモチベーション、低い基底性能、低学習スキルの効果を排除するために重要です。各動物は異なり、これらの違いは、モータの性能評価において考慮される必要があります。これは最高のもNFIとして知られているベースライン性能正規化されたインデックスを使用することによって改善されます。このインデックスは、異なるテストセッション中にマウスで観察される可能性があり、性能の変動を占めます。パフォーマンスの変動は、主に実験外の要因に、行動試験における共通の課題であり、このような低動機や動物の過去の経験などのプロトコル、。各マウスの最後の3つの時点の時間を実行している平均は、性能が安定した状態で置かれた場合に予想される分布の中心傾向の推定値を提供します。これは、日々の個々の性能のばらつきを占めています。 NFIは以上0.7に等しい値に比較的影響を受けないマウスを獲得しているのに対し、重度の神経障害は、その後、以下0.3に等しいのNFI値によって定義されます。残念ながら、この戦略は完全にやる気を起こさせる変更はモータの性能に影響を与える可能性のある問題を削除しません。さらにこの問題に対処するために、マウスは、このような従来のトレーニングに軽度の絶食または23.5に17.5の調整可能な落下高さに起因する落下の増加恐怖のような特定の動機付けの機能、を添加して訓練することができる。（44.5〜60センチ）。
第二に、受動回転またはループに関して：VALIにおそらく最も重要な脅威ロータロッドデータのdityは、マウスがしがみつくと、ロッド18を回転させるように受動的に回転させることができたときに発生する受動回転の発生です。受動回転は特に運動協調の問題が発生してマウスでは、ロータロッド上で観察されていますが、この対処行動が遅く誤って運動障害が存在しないことを示すことになるロッドを、脱落する可能性があります。したがって、データ解析において考慮されるべきである乱れた運動協調の二次尺度は、マウスがオフに陥ることなく、棒を回る回数のカウントです。また、受動的な回転は、ロッド18の直径、速度、加速度度とタスクのパラメータによって強く影響されます。するように、それほど顕著で尾根にあり受動回転のリスクを低減するための完璧なソリューションではありませんが、可能な解像度は、大径のロッドを使用することができる（3.15へ、すなわち、1.18。（3〜8センチ））または少しマウスのグリップを減らします。</ P>
ロータロッド性能試験の制限は、モータ評価が短い観測時間に制限されることです。また、明暗サイクルにおける異なる時点での試験は、行動試験19の結果を変更することができます。したがって、これらの問題を克服するために、いくつかの企業は、げっ歯類の行動の24時間365日監視を提供する革新的なホームケージ解析システムを開発しています。これらの監視システムは、確実に、げっ歯類の行動研究における最新かつ最もエキサイティングな技術が利用可能で表しますが、まだ非常に高価であり、研究室に常にアクセスすることはできません。
要約すると、ロータロッドの性能試験は、TMEV-IDD、進行性MSのマウスモデルにおける神経障害の長期評価のための比較的単純で安価な、そして十分に特徴付けられたテストです。伝統的な臨床症状に対するこのテストの利点システムのスコアは、それが資格に目的変数を生成することです別の薬剤、条件、および運動機能の手順の効果をntify。前述したように、いくつかの簡単な予防措置を適用することにより、ロータロッド性能試験の堅牢性を考えると、この手順は評価するに対するベースライン（1）進行性MSおよび（2）その有用性にTMEV-IDDマウスモデルの妥当性を提供しますMSのような進行性の神経学的症状を治療することを目的とした治療法をテストするため。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old | Envigo | #052 | |
| TMEV virus stock | |||
| Isoflurane vaporizer | Harvard Apparatus | #340471 | |
| Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc | BD | #328203 | |
| Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software | Columbus Instruments | #0890M |
References
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