Abstract
Detta protokoll beskriver generering av en tredimensionell (3D) ex vivo lever modell och dess tillämpning till studier och utveckling av virala vektorsystem. Modellen erhålls genom återinplantering den extracellulära matrisen av en decellulariserad råttlever med en human hepatocyt-cellinje. Modellen tillåter studier i en vaskulariserad 3D cellsystem, som ersätter potentiellt skadliga experiment med levande djur. En annan fördel är den humaniserade karaktär av modellen, som ligger närmare människans fysiologi än djurmodeller.
I denna studie visar vi transduktion av denna levermodell med en viral vektor härledd från adenoassocierade virus (AAV vector). Perfusionskretsen som levererar 3D levermodell med media ger ett enkelt sätt att tillämpa vektorn. Systemet tillåter övervakning av de stora metaboliska parametrar i levern. För slutlig analys kan vävnadsprover tas för att bestämma omfattningen av recellularizaning av histologiska tekniker. Fördelning av virusvektor och expression av den levererade transgen kan analyseras genom kvantitativ PCR (qPCR), Western blotting och immunohistokemi. Ett stort antal tillämpningar av vektormodellen i grundforskning och utveckling av genterapeutiska applikationer kan förutses, inklusive utveckling av nya antivirala läkemedel, cancerforskning, och studiet av virala vektorer och deras potentiella biverkningar.
Protocol
OBS: RL erhållits etiskt godkännande för explantation av organ från Lande für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Lever explanterades från Wister-råttor. Vena cava inferior och portvenen i levern kanylerades med en 22 G kanyl. Metoder för decellularisering av explanterade levrar har beskrivits tidigare. 4,5 De extracellulära matriser som används här erhölls genom överdriven perfusion av en råttlever med 1% natriumdeoxikolat.
1. Recellularization av extracellulär matris (ECM) av en råttlever
- Expansion av hepatisk cellinjen HepG2
- Kultur den hepatocellulärt karcinom cellinjen HepG2 i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 2 mM glutamin, och 2 mM av penicillin och streptomycin, vardera.
- Ympa 1,5 x 10 7 celler i T175-flaskor och växa cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 CO2.
- Centrifugera ner cellerna vid 300 xg och återsuspendera dem i 4 ml PBS och räkna cellerna med en Neubauer kammare under ett mikroskop. En T175 flaska kommer att ge ungefär 4,5 x 10 7 celler.
OBS: Se till att kulturen innehåller tillräckligt cellantal för recellularization av råttlever ECM med 6 x 10 8 HepG2-celler per ECM (10 x 175 cm 2 odlingskolvar med 4-5 x 10 8 celler vardera).
Figur 1. Bioreaktor systemet. A) Denna bioreaktor systemet var skräddarsydd. Det upprätthåller organmodeller vid 37 ° C och 5% CO2. Flödeshastigheterna för de peristaltiska pumparna kan regleras individuellt. B) Levern är placerad i en tillväxtkammare och anslutaed till perfusionskretsen, som består av en peristaltisk pump, en medelreservoar, en bubbelfälla och en trycksensor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Recellularization av ECM
- Ställa in bioreaktorsystem, innehållande en leverperfusion kammare, en perfusionssystemet, en reservoar av medium och en bubbelfälla. Sterilisera bioreaktorsystem (121 ° C, 15 min).
- Anslut bioreaktorsystem med en peristaltisk pump och placera den i en inkubator att förhållandena är lämpliga (37 ° C, 5% CO2). Placera decellulariserade råttlever byggnadsställningar 8 i levern perfusion kammaren i bioreaktor systemet (Figur 1).
- Anslut kanyl portådern och hålvenen med hjälp av slangklämmor till perfusion systemet. Jämvikta byggnadsställning med 150 ml RPMI-medium (som beskrivs i 1,1)över 5 d med en flödeshastighet av 1,25 ml / min.
- Koppla bort levern scaffold från mediakrets och inokulera ställningen med 3 x 10 8 HepG2-celler (i 5 ml) via portvenen med användning av en 5 ml spruta, undvika luftbubbelbildning och tillåta cellerna att återbefolka ECM genom att inkubera dem under 1 tim i ställningen med pumpen avstängd.
- Gradvis öka flödeshastigheten genom att justera pumpen, som börjar med 1,25 ml / min under 10 min; 2,5 ml / min under 20 min och slutligen 3,75 ml / min under 30 min.
- Upprepa steg 1.2.4-1.2.5 att nå en total cellantal på 6 x 10 8.
- Köra bioreaktorn systemet vid en flödeshastighet av 3,75 ml / min. Kultur den recellularized råttlever i 2 veckor.
OBS: Byt ut en tredjedel av mediet med färskt medium (50 ml) varannan dag. Prov odlingsmediet för att mäta fysiologiska parametrar, såsom laktatdehydrogenas-aktivitet, pH hos mediumprover och koncentrationen av glukos och laktat.
2. Transduktion av den Recellularized råttlever
- Storskalig produktion av AAV-vektorer
- Producera, rena och kvantifiera AAV-vektorer som beskrivits tidigare: 11
- I korthet producerar AAV-vektorer i rullflaskor och rena dem genom iodixanol gradientcentrifugering. Avlägsna kvarvarande iodixanol genom filtrering över PD10 gelfiltreringskolonner. Bestämma AAV-vektor koncentration genom qPCR med användning av genomiskt AAV-DNA som en standard.
OBS: Den självkomplementära, pseudotypad AAV2 / 6 vektor som används i föreliggande studie kodade EmGFP som reporter för att demonstrera transduktionseffektiviteten och en shRNA expressionskassett för knockdown av ett endogent uttryckt gen (human cyklofilin B (hCycB), figur 2) . Säkerställa en tillräcklig mängd av pseudotypade scAAV vektorer för serotyp 6 (2,7 x 10 13 AAV-vektorer per lever modell).
- I korthet producerar AAV-vektorer i rullflaskor och rena dem genom iodixanol gradientcentrifugering. Avlägsna kvarvarande iodixanol genom filtrering över PD10 gelfiltreringskolonner. Bestämma AAV-vektor koncentration genom qPCR med användning av genomiskt AAV-DNA som en standard.
- Producera, rena och kvantifiera AAV-vektorer som beskrivits tidigare: 11
Figur 2. Karta över den självkomplementära, pseudotypad AAV2 / 6 vektor som används i föreliggande studie. Genomet består av de inverterade terminala upprepningar (ITR) av AAV2 och kodar EmGFP under kontroll av CMV-promotorn samt en shRNA under kontroll av en U6 promotor. klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Transduktion av lever Modell
- Justera AAV-vektor lösning till en slutlig koncentration av 2,7 x 10 13 vektorgenom i 5 ml genom tillsättning av den respektive volym PBS.
- Koppla ur levern från mediekretsen genom att avlägsna slangen från kanylen. Anslut en 5 ml spruta till kanylen i portvenen och injicera den kompletta AAV-vektor-lösning (5 ml).
OBS: Optionally, tillsätt fenolrött (5 | j, g / ml) för att följa distributionen av AAV-vektor lösning i hela levern. - Inkubera under 1 h utan pumpning. Gradvis öka flödeshastigheten, börjar med 1,25 ml / min under 10 min; 2,5 ml / min under 20 min och 3,75 ml / min under 30 min. Kultur recellularized råttlever under 6 dagar.
OBS: Byt ut en tredjedel av mediet som anges i not enligt 1.2.7
3. Bedömning av Recellularized omvandlade råttlever
- Hematoxylin och eosin (HE) färgning och Immunhistokemisk analys
- Ta prover (0,5 x 0,5 x 1,5 till 2 cm) från varje lever lob med hjälp av en skalpell.
- Inkubera prover (från 3.1.1) i 4% paraformaldehyd (PFA) + 4% sackaroslösning under 1,5 h vid 4 ° C. (Varning: PFA är giftigt och cancerframkallande hålla alltid PFA inom ett dragskåp och bära lämpliga skyddskläder..) Tvätta tre gånger med PBS (1 minut per tvättsteg) och inkubera i 8%sackaros över natt vid 4 ° C.
- Häll fixeringsmedium i plast cryomolds, placera proven i fixeringsmedium utan luftbubblor. Lägg fixeringsmedium tills provet är väl täckt. Store inbäddade proverna vid -80 ° C tills vidare användning.
- Förbered Cryo-sektioner (10 nm) med en cryotome 12. Bedöma recellularization genom hematoxylin + eosinfärgning 8. Bedöm transduktion effektivitet genom immunhistokemisk färgning för genen av intresse (här: EmGFP).
- Molekylärbiologiska provtagning
- Prov varje lever lob med en biopsistans (4 mm i diameter). Isolera totalt RNA, DNA och proteiner enligt tillverkarens anvisningar för bedömning av transgen expression av EmGFP och hCycB slå ner åtta.
Representative Results
Vid bedömningen av omfattningen av recellularization var Cryo-sektioner ställdes från varje lob av varje recellularized levermodell. Snitten analyserades därefter med hematoxylin och eosin-färgning. Såsom kan ses i figur 3, varvid varje lob av de tre levermodeller, som betecknas som TLM1, TLM2 (transduceras levermodeller 1 2) och Ctrl (kontroll lever modell som recellularized, men inte transducerade), var nyinsatta med HepG2-celler. Detta indikerar Carcinom cellinje etablerades från tumörvävnaden hos en 15-årig argentinska pojke. Vissa områden av lever modellerna mer intensivt recellularized än andra. Orsakerna till dessa variationer återstår att fastställa.
Figur 3. Hematoxylin och eosin fläck av varje lob av de tre analyserade lever modeller TLM1 + 2. Omvandlade levermodeller 1 och 2; Ctrl .: kontroll lever modell som recellularized men inte omvandlade. Skala bar: 200 nm. (Re-tryckt med tillstånd från ref. 8.) klicka god här för att se en större version av denna siffra.
I nästa steg, var transduktion av levermodeller bedömas. För detta ändamål fram DNA framställt från 28 stansbiopsier av vardera av levermodeller och vektorn titer kvantifierades genom qPCR. I genomsnitt var 55 och 90 internvektorgenom per cell (VG / cell) uppmättes för de två omvandlade levermodeller. Experiment i 2D cellodling har visat 30 VG / cell är tillräckliga för starka transgenexpression och RNAi-medierad tysta. Produktion av EmGFP analyserades genom RT-PCR och Western blotting. I själva verket var uttryck av reporter detekterades i 80-90% av biopsier på mRNA och proteinnivåer, respektive.8 För att få en heltäckande bild av omvandlingseffektiviteten, var Cryo-sektioner immunohistologically analyseras. Såsom kan ses i figur 4, delar av levern modell som med framgång recellularized, som visualiserades genom DAPI-färgning, gav också starka fluorescerande signaler i immunohistokemisk analys av EmGFP expression. Som väntat styrlevermodellen, som inte behandlats med AAV-vektorer, inte visade någon EmGFP uttryck.
Figur 4. Immunohistokemisk analys av EmGFP expression Celler som nyinsatta levermodeller visualiserades genom DAPI-färgning (blå).; EmGFP expression visualiserades genom immunokemisk färgning (röd). TLM1 + 2: omvandlade levermodeller 1 och 2; Ctrl .: kontroll lever modell som recellularized men inte omvandlade. Skala bar: 200 nm. (Re-tryckt med tillståndfrån Ref. 8.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I ett sista test, AAV-medierad knockdown av hCycB analyseras med QRT-PCR. Den knockdown av hCycB befanns vara mellan 70 och 90% i genomsnitt för alla lober de två transducerade levermodeller (Figur 5).
Figur 5. RNAi-medierad knockdown av hCycB i AAV-transducerade 3D levermodeller. Tysta hCycB bestämdes av QRT-PCR. Medelvärden och standardavvikelser (SD) beräknades för samtliga prover av varje transducerad 3D levermodell (TLM1 och 2, respektive) och normaliserades till medelvärdet av det icke-transducerade kontroll (Ctrl.). (Re-tryckt med tillstånd från Ref. 8.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De ombildade 3D lever beskrivs här ger en modell för att studera virala vektorer i en humaniserad systemet. Återplantering av ECM av en råttlever med en human hepatocellulär cancer cellinje genererar en vaskulariserad system som möjliggör studier av stora biologiska. Dessa resultat ger en proof-of-concept som den rekonstituerade levermodellen kan effektivt omvandlas med en virusvektor.
För experimenten som visas här, var varje leverloben transducerad genom AAV-vektor. Men i vissa preliminära experiment, enskilda lober inte nyinsatta med celler. Det är därför viktigt att förhindra celldebris eller andra komponenter från ockludera det vaskulära systemet. För att testa om alla lober kan perfusion, kan en giftfri färgämne, såsom fenolrött spolas genom levern modell.
En annan viktig fråga är att hålla levern ställningen steril. Även behandling med etanol eller antibiotika är disadvantageous för det vaskulära systemet, bestrålning av den extracellulära matrisen med γ-strålning bevarade kärlen och steriliserades provet.
Dessutom kommer storleken på explanterade levrar variera, så att antalet celler som används för den recellularization förfarandet och återpopulations tiden kan behöva justeras för att erhålla reproducerbara resultat.
De råttlevrar som användes i föreliggande studie är förhållandevis stora och kräver stora mängder av celler och testreagens (t.ex. AAV vektorer). Dessutom tog återplantering förfarandet mer än två veckor. Detta begränsar antalet replikat som kan göras med rimlig arbetsinsats. Vi håller på att inrätta en modell för mus lever, som är endast omkring en femtedel av volymen av råttlever, medger användning av färre celler och mindre testreagensen. Även proportionell skala ned antalet celler verkar rimligt, de exakta beloppen måste fastställas i furthennes experiment.
En annan brist med den föreliggande modellen är användningen av hepatocellulär HepG2-cellinjen. Experiment pågår för att utveckla användningen av hepatocyter differentierade från inducerade pluripotenta stamceller, som kommer att ge en fysiologiskt mer relevant modell. Vidare levern består av flera celltyper utöver de hepatocyter, t.ex., Kupffer-celler och sinosoids. Vi antar att de olika celltyper kommer återbefolka deras naturliga miljöer när en ECM recellularized med flera celltyper.
3D lever modellen kombinerar flera fördelar. En stor nackdel med konventionella in vivo-modeller är att djurfysiologi skiljer sig avsevärt från den mänskliga fysiologin. Toxiska biverkningar av behandling av en human patient kan därför förbli oupptäckt. Denna brist kan övervinnas genom beredning av den 3D lever modellen med mänskliga celler som närmare återspegla biologi human patienter.
Den andra fördelen av levern modellen är dess bidrag till djurens välbefinnande. Även om djur komponenter behövs för beredning experiment fortfarande följer den strategi målen i 3R-principen (ersättning, begränsning och förbättring), som överskottsdjur kan användas som offrades för andra djurexperiment, dvs inga ytterligare djur som krävs och tillvägagångssättet undviker helt lidande djur som ofta förknippas med in vivo experiment. Sfäroider är ett alternativt verktyg för att studera cellulära processer i ett 3D-system. Emellertid är sfäroider inte vaskulariserade så att stora ämnen och bioläkemedel inte tränger djupt in i de inre delarna av konstruktionen. Dessa problem har övervunnits med den vaskulariserade 3D levermodell.
I de experiment som beskrivs här, var AAV-vektorer som undersökts, eftersom de är bland de mest lovande kandidaterna för genterapeutiskaapplikationer. Lika många genterapeutiska tillvägagångssätt syftar till att rikta levern, t.ex., för behandling av infektioner med hepatitvirus eller av alfa-1-antitrypsinbrist, kan 3D-lever användas i förfarandet enligt dessa AAV-vektor utveckling. Det är, naturligtvis, även lämplig för studier av andra hepatotropiskt virala vektorer, till exempel, adenovirusvektorer. Dessutom kan den användas för att studera infektionshepatitvirus såsom hepatit B eller C virus. Den kan till exempel användas för att designa nya antivirala strategier. Dessutom 3D-modeller organ utgör lovande verktyg för att utveckla nya cytostatika behandlingar för cancer och att genomföra toxikologiska studier. På lång sikt, kan konstgjorda levrar användas i regenerativ medicin som transplantat. Sammantaget erbjuder 3D lever modellen ett brett spektrum av tillämpningar inom infektionsbiologi och andra områden av biomedicinsk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
