Abstract
Denne protokol beskriver dannelsen af et tredimensionalt (3D) ex vivo lever model og dens anvendelse til undersøgelse og udvikling af virale vektorsystemer. Modellen opnås ved genbefolkning den ekstracellulære matrix af en decellulariseret rottelever med en human hepatocyt cellelinie. Modellen tillader studier i en vaskulariseret 3D celle-system, der erstatter potentielt skadelige eksperimenter med levende dyr. En anden fordel er den humaniserede karakter af modellen, der er tættere på human fysiologi end dyremodeller.
I denne undersøgelse udviser vi transduktionen af denne liver model med en viral vektor afledt af adenoassocierede vira (AAV vektor). Perfusionskredsløbet der leverer 3D leveren model med medier giver en nem måde at anvende vektoren. Systemet tillader overvågning af de store metaboliske parametre i leveren. For sidste ende kan tages vævsprøver at bestemme omfanget af recellularization af histologiske teknikker. Fordeling af virusvektoren og ekspression af det leverede transgen kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR), Western blotting og immunhistokemi. Talrige anvendelser af vektoren modellen i grundforskning og i udviklingen af genterapeutiske anvendelser kan forudses, herunder udvikling af hidtil ukendte antivirale terapeutiske midler, Cancer Research, og studiet af virale vektorer og deres potentielle bivirkninger.
Protocol
BEMÆRK: RL fået etisk godkendelse til explantation af organer fra Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Levere blev eksplanteret fra Wistar rotter. Inferior vena cava og portåren af leveren blev kanyleret med en 22 G kanyle. Fremgangsmåder til decellularization af eksplanterede lever er tidligere blevet beskrevet. 4,5 De ekstracellulære matrixer der anvendes her blev opnået ved overdreven perfusion af en rottelever med 1% natriumdeoxycholat.
1. Recellularization af ekstracellulær matrix (ECM) af en rottelever
- Udvidelse af hepatisk cellelinie HepG2
- Kultur den hepatocellulært carcinom HepG2 i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin og 2 mM penicillin og streptomycin, hver.
- Seed 1,5 x 10 7 celler i T175-flasker og dyrke cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 5% CO2.
- Spin ned cellerne ved 300 xg og resuspender dem i 4 ml PBS og tælle cellerne med et Neubauer kammer under et mikroskop. En T175 flaske giver ca. 4,5 x 10 7 celler.
BEMÆRK: Sørg for kulturen indeholder tilstrækkeligt celleantal til recellularization af rottelever ECM med 6 x 10 8 HepG2 celler pr ECM (10 x 175 cm 2 dyrkningskolber med 4-5 x 10 8 celler hver).
Figur 1. bioreaktor-system. A) Denne bioreaktor systemet var skræddersyet. Den opretholder organet modeller ved 37 ° C og 5% CO2. Strømningshastighederne for de peristaltiske pumper kan reguleres individuelt. B) Leveren placeres i et vækstkammer og forbindeed til perfusionskredsløbet, som består af en peristaltisk pumpe, en medium reservoir, en boble fælde og en tryksensor. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Recellularization af ECM
- Opsætning bioreaktoren systemet, som indeholder en lever perfusion kammer, et perfusionssystem, et reservoir af medium og en boble fælde. Sterilisere bioreaktoren systemet (121 ° C, 15 min).
- Slut bioreaktor-system med en peristaltisk pumpe og placere den i en inkubator sørge for passende betingelser (37 ° C, 5% CO2). Placer decellulariserede rottelever stilladser 8 i leveren perfusion kammer i bioreaktoren (figur 1).
- Tilslut den kanylerede portal vene og vena cava ved hjælp rør klip til perfusion systemet. Ækvilibrer stillads med 150 ml RPMI-medium (som beskrevet i 1.1)over 5 d med en strømningshastighed på 1,25 ml / min.
- Afbryd leveren stillads fra medierne kredsløb og inokulere stilladset med 3 x 10 8 HepG2-celler (i 5 ml) via portåren under anvendelse af en 5 ml sprøjte, undgå luftboble dannelse og lade cellerne genbefolke ECM de inkuberes for 1 time i stilladset med pumpen slukket.
- Gradvist øge strømningshastigheden ved indstilling af pumpen, startende med 1,25 ml / min i 10 minutter; 2,5 ml / min i 20 min og endelig 3,75 ml / min i 30 min.
- Gentag trin 1.2.4-1.2.5 op til et samlet celleantal på 6 x 10 8.
- Kør bioreaktoren systemet med en strømningshastighed på 3,75 ml / min. Kultur den recellularized rottelever i 2 uger.
BEMÆRK: Erstat en tredjedel af mediet med frisk medium (50 ml) hver anden dag. Prøve dyrkningsmediet for at måle fysiologiske parametre, såsom lactatdehydrogenaseaktivitet, pH mediumprøver og koncentrationen af glucose og lactat.
2. Transduktion af Recellularized rottelever
- Storstilet produktion af AAV vektorer
- Producere, oprense og kvantificere AAV-vektorer som tidligere beskrevet: 11
- Kort fortalt producerer AAV-vektorer i rulleflasker og oprense dem ved iodixanol gradientcentrifugering. Fjerne resterende iodixanol ved filtrering over PD10 gelfiltreringssøjler. Bestem AAV-vektor-koncentration ved qPCR under anvendelse af genomisk AAV DNA som en standard.
BEMÆRK: selvkomplementære, pseudotype AAV2 / 6 vektor, der anvendes i den foreliggende undersøgelse kodet EmGFP som en reporter til at demonstrere transduktionseffektivitet og et shRNA ekspressionskassette for knockdown af en endogent udtrykt gen (human cyclophilin B (hCycB), figur 2) . Sikre en tilstrækkelig mængde pseudotype scAAV vektorer for serotype 6 (2,7 x 10 13 AAV vektorer pr lever model).
- Kort fortalt producerer AAV-vektorer i rulleflasker og oprense dem ved iodixanol gradientcentrifugering. Fjerne resterende iodixanol ved filtrering over PD10 gelfiltreringssøjler. Bestem AAV-vektor-koncentration ved qPCR under anvendelse af genomisk AAV DNA som en standard.
- Producere, oprense og kvantificere AAV-vektorer som tidligere beskrevet: 11
Figur 2. Kort over selvkomplementære, pseudotype AAV2 / 6 vektor, der anvendes i den foreliggende undersøgelse. Genomet består af de omvendte terminale gentagelser (ITR) af AAV2 og koder EmGFP under kontrol af CMV-promotoren samt en shRNA under kontrol af en U6 promotor. klik her for at se en større version af dette tal.
- Transduktion af Liver Model
- Juster AAV-vektor opløsningen til en slutkoncentration på 2,7 x 10 13 vektorgenomer i 5 ml ved tilsætning af den respektive volumen PBS.
- Afbryd leveren fra medierne kredsløbet ved at fjerne slangen fra kanylen. Tilslut en 5 ml sprøjte til kanylen af portåren og injicere den komplette AAV-vektor-opløsning (5 ml).
BEMÆRK: Optionally, tilsættes phenolrødt (5 ug / ml) for at følge fordelingen af AAV vektor opløsningen hele leveren. - Der inkuberes i 1 time uden pumpning. Gradvist øge strømningshastigheden, startende med 1,25 ml / min i 10 min; 2,5 ml / min i 20 minutter og 3,75 ml / min i 30 min. Kultur den recellularized rottelever over 6 dage.
BEMÆRK: Udskift en tredjedel af mediet som angivet i NOTE under 1.2.7
3. Vurdering af Recellularized transducerede Rat Liver
- Hematoxylin og eosin (HE) -farvning og Immunohistokemisk analyse
- Tag prøver (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) fra hver lever lap ved hjælp af en skalpel.
- Inkuber prøver (fra 3.1.1) i 4% paraformaldehyd (PFA) + 4% sucroseopløsning i 1,5 timer ved 4 ° C. (Advarsel: PFA er giftigt og kræftfremkaldende altid holde PFA inden et stinkskab og bære passende beskyttelsesbeklædning..) Vask tre gange med PBS (1 min per vask trin) og inkuberes i 8%saccharose natten over ved 4 ° C.
- Hæld fastsættelse medium i plast cryomolds, placere prøverne til fastsættelse medium uden luftbobler. Tilføj fastsættelse medium, indtil prøven er godt dækket. Opbevares indlejrede prøver ved -80 ° C indtil videre anvendelse.
- Forbered cryo-sektioner (10 um) med en cryotome 12. Vurdere recellularization ved hæmatoxylin + eosinfarvning 8. Vurdere transduktion effektivitet ved immunhistokemisk farvning for genet af interesse (her: EmGFP).
- Molekylær biologiske prøver
- Prøve hver leverlap med en biopsitang (4 mm i diameter). Isoler total RNA, DNA og proteiner i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger for vurderingen af transgen udtryk for EmGFP og hCycB vælte 8.
Representative Results
Til vurdering af omfanget af recellularization blev cryo-sektioner fremstillet af hver lap på hver recellularized lever model. Snittene blev derefter analyseret ved hematoxylin og eosin-farvning. Som det kan ses i figur 3, hver lap af de tre liver modeller, betegnet TLM1, TLM2 (transduceret liver modeller 1 +2) og Ctrl (kontrol liver model, der blev recellularized, men ikke transducerede), blev genbefolket med HepG2-celler. Denne hepatocellulært carcinom cellelinje blev etableret fra tumorvæv hos en 15-årig argentinsk dreng. Nogle områder af leveren modeller blev mere intensivt recellularized end andre. Årsagerne til disse variationer mangler at blive fastlagt.
Figur 3. Hematoxylin og eosin plet af hver lap af de tre analyserede lever modeller TLM1 + 2:. Transducerede levermodeller 1 og 2; Ctrl .: kontrol liver model, der blev recellularized men ikke transduceret. Målestok: 200 um. (Re-trykt med tilladelse fra ref. 8.) Klik her for at se en større version af dette tal.
I det næste trin blev transduktion af leveren modeller vurderes. Til dette formål blev DNA fremstillet fra 28 hudbiopsier af hver af leveren modeller og vektoren titer blev kvantificeret ved qPCR. I gennemsnit blev 55 og 90 internaliserede vektor genomer per celle (VG / celle) målt for de to transduceret lever modeller. Eksperimenter i 2D cellekultur har vist 30 VG / celle er tilstrækkelig til stærke transgen ekspression og RNAi-medieret lyddæmpning. Produktion af EmGFP blev analyseret ved RT-PCR og Western blotting. Faktisk var ekspression af reporteren påvist i 80-90% af biopsierne på mRNA og protein niveauer, hhv.8 For at få et samlet billede af transduktion effektivitet, blev immunhistologisk analyseret cryo-sektioner. Som det kan ses i figur 4, områder af leveren model, lykkedes recellularized, som visualiseret ved DAPI-farvning, gav også stærke fluorescerende signaler i immunohistokemisk analyse af EmGFP ekspression. Som forventet kontrol liver modellen, ikke behandlet med AAV-vektorer, viste ingen EmGFP ekspression.
Figur 4. Immunohistokemisk analyse af EmGFP ekspression Celler, repopulerede leveren modeller blev visualiseret ved DAPI-farvning (blå).; EmGFP ekspression blev visualiseret ved immunokemisk farvning (rød). TLM1 + 2: transducerede lever modeller 1 og 2; Ctrl .: kontrol liver model, der blev recellularized men ikke transduceret. Målestok: 200 um. (Re-trykt med tilladelsefra ref. 8.) Klik her for at se en større version af dette tal.
I en afsluttende test blev AAV-medieret knockdown af hCycB analyseret af QRT-PCR. Knockdown af hCycB blev fundet at være mellem 70 og 90% som et gennemsnit af alle kamre af de to transducerede lever modeller (figur 5).
Figur 5. RNAi-medieret knockdown af hCycB i AAV-transducerede 3D liver modeller. Silencing af hCycB blev bestemt ved QRT-PCR. Middelværdier og standardafvigelser (SD) blev beregnet for alle prøver af hver transduceret 3D lever model (TLM1 og 2, henholdsvis) og normaliseret til middelværdien af den ikke-transducerede kontrol (Ctrl.). (Re-trykt med tilladelse fra Ref. 8.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De rekonstituerede 3D lever her beskrevne giver en model til at studere virale vektorer i et humaniseret system. Repopulation af ECM af en rottelever med en human hepatocellulær carcinom-cellelinie frembringer et vaskulariseret, som muliggør studiet af store biologiske. Disse resultater giver et proof-of-concept, at den rekonstituerede leveren model kan effektivt transduceres med en viral vektor.
Til eksperimenterne vist her blev hver eneste Leverlappen transduceres af AAV vektor. Men i nogle indledende forsøg, enlige lapper blev ikke genbefolket med celler. Det er derfor vigtigt at forhindre cellerester eller andre komponenter fra okkludere det vaskulære system. For at teste, om alle lapper kan perfunderes, kan en ikke-toksisk farvestof, såsom phenolrødt skylles gennem leveren model.
En anden afgørende spørgsmål er at holde leveren stillads steril. Mens behandling med ethanol eller antibiotika er disadvantageous for det vaskulære system, bestråling af den ekstracellulære matrix med γ-stråling bevaret fartøjerne og steriliseres prøven.
Endvidere vil størrelsen af eksplanterede lever forskellige, således at antallet af celler til den recellularization proceduren og repopulation tid måske skal justeres for at opnå reproducerbare resultater.
De rottelevere anvendes i den foreliggende undersøgelse er forholdsvis store og kræver store mængder af celler og testreagenser (f.eks AAV vektorer). Desuden genoprettelse procedure tog mere end to uger. Dette begrænser antallet af replikater, der kan gøres med en rimelig indsats. Vi er i øjeblikket om modellen for muselevere, som kun tilnærmelsesvis en femtedel af volumenet af rottelevere, der tillader anvendelse af færre celler og mindre testreagenser. Selvom proportional skala-down af cellen nummer forekommer rimelig, de nøjagtige beløb skal fastsættes i furthendes eksperimenter.
En anden mangel ved den foreliggende model er brugen af den hepatocellulære HepG2-cellelinien. Eksperimenter i gang for at udvikle brugen af hepatocytter differentieret fra inducerede pluripotente stamceller, som vil give en fysiologisk mere relevant model. Endvidere leveren består af flere celletyper ud over de hepatocytter, fx, Kupffer-celler og sinosoids. Vi antager, at de forskellige celletyper vil genskabe deres naturlige miljøer, når en ECM er recellularized med flere celletyper.
3D liver model kombinerer flere fordele. En væsentlig ulempe ved konventionelle in vivo-modeller er, at animalske fysiologi adskiller sig væsentligt fra human fysiologi. Toksiske bivirkninger af behandlingen af en human patient kan derfor forblive uopdaget. Denne mangel kan overvindes ved rekonstituering af 3D liver model med humane celler, der bedre afspejler biologi humand patienter.
Den anden fordel af leveren modellen er dens bidrag til dyrevelfærd. Selvom dyr komponenter er nødvendige til rekonstituering eksperimenter, tilgangen følger stadig formålene med 3R-princippet (erstatning, begrænsning, forfining), som kan anvendes overskydende dyr, der blev aflivet for andre dyreforsøg, dvs., ikke er behov for yderligere dyr og tilgangen helt undgår lidelse for dyrene, som ofte er forbundet med in vivo forsøg. Sfæroider er et alternativt værktøj til at studere cellulære processer i et 3D-system. Imidlertid er sfæroider ikke vaskulariseret, så store stoffer og biologiske ikke trænge dybt ind i de indre dele af strukturen. Disse problemer er blevet løst med den vaskulariserede 3D leveren model.
I eksperimenterne beskrevet her, blev AAV-vektorer undersøgt, da de er blandt de mest lovende kandidater til genterapeutiskanvendelser. Så talrige genterapeutiske fremgangsmåder sigte på målretning leveren, fx til behandling af infektioner med hepatitis virus eller af alfa-1-antitrypsin-mangel, kan 3D leveren anvendes i fremgangsmåden ifølge disse AAV-vektor udvikling. Det er naturligvis også egnet til undersøgelse af andre hepatotrope virale vektorer, f.eks, adenovirusvektorer. Desuden kan den anvendes til at studere infektiøse hepatitisvirus, såsom hepatitis B eller C virus. Det kan for eksempel anvendes til at designe nye antivirale strategier. Desuden 3D orgel-modeller repræsenterer lovende værktøjer til at udvikle nye cytostatiske lægemidler til behandling af kræft og at gennemføre toksikologiske undersøgelser. På lang sigt kan kunstige levere anvendes i regenerativ medicin som transplantationer. Tilsammen 3D leveren model tilbyder en bred vifte af applikationer i infektion biologi og andre områder af biomedicinsk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
