Summary
Protein interaksjoner er i hjertet av en celle funksjon. Kalorimetriske og spektroskopiske teknikker blir ofte brukt for å karakterisere dem. Her beskriver vi fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere samspillet mellom protein mutert i Shwachman-Diamond syndrom (SBDS) og Forlengelse faktor-lignende en GTPase (EFL1).
Abstract
Protein-protein-interaksjoner spiller en viktig rolle i funksjonen av en levende organisme. Når en interaksjon har blitt identifisert og validert er det nødvendig å karakterisere den på det strukturelle og mekanistiske nivå. Mange biokjemiske og biofysiske metoder finnes for slike formål. Blant dem, er fluorescens anisotrofien en kraftfull teknikk spesielt anvendes når fluorescensintensiteten av en fluorofor-merket protein forblir konstant ved protein-protein-interaksjon. I denne teknikken er en fluorofor-merket protein eksiteres med vertikalt polarisert lys av en passende bølgelengde som selektivt eksiterer en undergruppe av fluoroforene i henhold til deres relative orientering i den innkommende strålen. Den resulterende utslipp har også en retnings hvis forhold i de vertikale og horisontale plan definerer anisotropi (r) som følger: r = (jeg VV -I VH) / (I VV + 2I VH), hvor jeg vv og jeg
Introduction
Celler inneholder et mangfold av biomacromolecules som hele tiden kommuniserer med hverandre. Denne assosiasjonen gir opphav til komplekser som deltar i de cellulære veier som er ansvarlige for deres funksjon i signaltransduksjon, regulering av genekspresjon og cellevandring blant andre. Alt protein-protein interaksjoner som forekommer i en celle omfatter et nettverk kjent som interactome. I Saccharomyces cerevisiae mer enn 70% av sitt protein har vist seg å ha samvirkende partnerne 1. Forstå interactome av en celle og deres funksjoner gi relevant informasjon om kompleksiteten og mangfoldet av levende organismer. Flere metoder har blitt beskrevet å identifisere og karakterisere protein-protein interaksjoner. Forskjellig høy gjennom benyttet metoder som gjær to-hybrid 2, protein-fragment komplemente assays 3, affinitetsrensing 4 koblet til massespektrometri og protein microarrays brukes til å identifisere en interaksjon 5,6. Når identifisert, er det nødvendig å validere det, og dette kan variere fra sak til sak. Vanligvis disse eksperimentene involverer forstyrre samspillet selv på nivå med de enkelte medlemmer av samspillet paret, for eksempel ved genet sletting eller overekspresjon av en av proteiner, og deretter se etter endringer i egenskaper eller funksjon av den andre medlemmet på cellenivå. Deretter blir biofysiske teknikker 7 som brukes til å karakterisere protein-protein interaksjon på molekylært nivå. For dette formål, er strukturen av proteinkomplekser bestemt ved røntgen-krystallografi, kjernemagnetisk resonans og kryo-elektronmikroskopi mens kalorimetri og fluorescens-spektroskopi blir brukt for å kvantitativt og mekanistisk beskrive dem.
I dette arbeidet ble fluorescens anisotropi brukt som en teknikk for å karakterisere samspillet mellom GTPase EFL1 og SBDS-proteinet. Disse proteinene deltar i syntesen av ribosomer ved å fremme frigivelse av eukaryotisk initiering faktor 6 fra overflaten av den 60S ribosomale subenhet 8. Den SBDS proteinet er mutert på en sykdom som er kjent som den Shwachman-Diamond syndrom 9 og virker som et guanin nukleotid utveksling faktor for EFL1 avtagende dets affinitet for guanosin difosfat 10,11. Sykdoms mutasjoner i SBDS avskaffe samspillet med EFL1 og dermed hindre aktivering.
Fluorescens anisotropi er ofte brukt i biologiske anvendelser for å studere protein-peptid eller protein-nukleinsyre-interaksjoner. Den er basert på det prinsipp at en fluoroforen eksiteres med polarisert lys resulterer i en delvis polarisert utslipp. Fluorescens anisotropi er definert ved ligning 1:
der jeg vv og jeg VH erfluorescensstyrkene den vertikalt (VV) og horisontalt (VH) polarisert utslipp når prøven er spent med vertikalt polarisert lys 12. Fluorescens anisotropi er følsom for faktorer som påvirker frekvensen av rotasjons diffusjon av fluoroforen og således avhenger av temperaturen, viskositeten av løsningen og den tilsynelatende molekylstørrelse av fluoroforen. Den tilsynelatende størrelse av et protein inneholdende en fluorofor øker når den kommuniserer med et annet protein og en slik endring kan deretter evalueres som en endring i anisotropi. Nærmere bestemt vil en fluorofor som roterer langsomt i oppløsning i forhold til dets fluoriserende levetid vil ha en stor I VV verdi og liten jeg VH verdi, og derfor vil oppvise en forholdsvis stor anisotropi. For fluorophores som tørkes raskt i forhold til deres fluorescerende levetid, jeg vv og jeg VH vil være like og deres anisotropi verdien vil være liten 12 (Figur 1). I tillegg, for en god anisotropi signal til støymåling, er det nødvendig å ha en fluorofor med en fluorescens levetid lik den rotasjonskorrelasjonstiden til molekylet av interesse. Ellers er det ikke mulig å nøyaktig registrere forskjellen i anisotrofien mellom den frie protein, og at i komplekset. For eksempel, anisotropien av en fluorescerende probe med en levetid nær 4 nsek som for eksempel fluorescein eller rhodamin festet til en lavmolekylær forbindelse med 100 Da er 0,05. Binding til et molekyl av 160 kDa vil øke dens anisotropi verdien til 0,29; en forskjell som kan måles nøyaktig. I motsetning til dette, vil det samme fluorescerende probe som er involvert i en bindingsreaksjon, som plutselig økning i molekylstørrelse varierer fra 65 til 1000 kDa bare resultere i en endring anisotropi på 0,28 til 0,3, noe som er for små til å måles nøyaktig. I dette scenariet vil en sonde med en levetid på 400 ns være mer egnet 12.
Figur 1. Skjematisk representasjon av utstyret som brukes til å måle fluorescens anisotropi og prosedyren. Skjematisk representasjon av utstyret som brukes til å utføre en protein-protein interaksjon eksperiment som måler fluorescensen anisotropi. Fluoroforer som ristes rask visnings liten anisotropi som øker ved binding til et samspill partner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fluorescensanvendelser krever tilstedeværelse av en fluorofor i hvilket som helst av molekylene studert. For å undersøke protein-protein interaksjoner er det tre typer fluoroforer: 1) tryptofanrester som er tilstede i proteiner, 2) kjemisk festet fluoroforer og 3) fluoriserende fusjonspartnere som grønt fluorescerende protein (GFP) og dens derivatanter. De fleste proteiner har tryptofanrester på sin struktur, og dermed den enkleste måten for å måle en interaksjon er ved å overvåke endringene i den tilsvarende fluorescensspektra eller ved å overvåke endringer i fluorescens-intensiteten av tryptofanrester. Imidlertid kan tryptofanrester være til stede i begge proteiner kompliserer analysen. På den annen side, for en fluorofor til å endre sin fluoriserende egenskaper på grunn av en interaksjon det er behov for å være plassert på eller nær bindingssetet og det kunne interferere med interaksjonen selv. Dette trenger spesiell oppmerksomhet når du bruker store fluoroforer som GFP. Hvis ingen av disse fluoroforer kan brukes til bindingsstudier er det nødvendig, da, å innføre ytre fluoroforer til den ene av de involverte proteiner. Mange kjemisk syntetiserte fluoroforer eksistere og kan være kovalent bundet til proteiner via sine reaktive grupper slik som aminogrupper (sidekjede av lysin eller N-terminus) og tiol- grupper i cystein. Fluorophore derivater med isothiocyanate og suksinimidyl estere reagere med amidgrupper mens iodoacetamide og maleimide er tiol-reaktive grupper 13. De mest vanlige fargestoffer som brukes i fluorescensanvendelser er derivater av fluorescein og rhodamin grønne farvestoffer, koumariner, BODIPY fluoroforer og Alexa Fluor fargestoffer. En detaljert liste over kommersielt tilgjengelige fluoroforer og deres anvendelse kan finnes i referanser 14,15. For vellykket merking, må den reaktive gruppe være eksponert på overflaten av proteinet, men på grunn av det store antall reaktive funksjonelle grupper som typisk er tilstede i polypeptidene det er svært vanskelig å få sete-spesifikk modifisering. Proteinet av interesse i denne studien, SBDS, inneholder 5 gratis cysteiner og 33 lysines som kan resultere i flere språk merking. Ikke-uniform merking kan påvirke binding og vil komplisere dataanalyse som ulike fluoroformolekyler kan lokke fram ulike fluorescerende intensitet signaler ved binding. Overcome dette problemet, brukte vi Flash fluorophore, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein til nettstedet Direkt label SBDS protein. Dette er en arsenoxide fargestoff med en høy affinitet for fire adskilte cysteiner i et motiv kjent som flash-kode som består av sekvensen CCXXCC hvor X er hvilken som helst aminosyre annen enn cystein 16,17. Dette tetracysteine motiv tilsettes til N- eller C-terminale enden av proteinet ved hjelp av genteknologi sammen med en egnet linker for å forhindre forstyrrelse av den samlede fold av proteinet. Paret består av Flash fargestoff og Flash-koden ble opprinnelig utviklet for å stedsspesifikke label proteiner i levende celler 17, men det kan også brukes til å merke rensede proteiner in vitro som det er eksemplifisert her. I tillegg har enzymatiske strategier også blitt utviklet for å muliggjøre stedsspesifikke funksjonalisering av proteiner 18.
I dette manuskriptet beskriver vi nytten av fluorescens anisotropi enet verktøy for å studere protein-protein interaksjoner. Binding kan vurderes ved enkel inspeksjon av bindingen kurveformen mens kvantitativ informasjon kan fås fra tilpasning av de eksperimentelle data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBDS-Blits tag Protein Expression og rensing
MERK: For anisotropi eksperimenter, en flash-tag tilsvarende sekvensen Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys ble satt til C-terminalen av de menneskelige SBDS kodende sekvens av PCR. Denne konstruksjonen ble subklonet inn i ekspresjonsvektoren pRSET-A og transformert inn i Escherichia coli-C41-celler til å uttrykke et protein som koder for en N-terminal hexahistidine tag (His-tag), de humane SBDS kodende sekvens og en C-terminus flash-tag 10.
- SBDS-FLASH protein uttrykk
- Transform kompetente E. coli C41 celler med plasmidet pRSET-HisSBDS-flash ved hjelp av en standard heat shock protokoll 19. Plate cellene i faste Luria-Bertani (LB) medier supplert med 100 ug / ml ampicillin. LB faste medier sammensetning består av 10 g NaCl, 5 g gjærekstrakt, 10 g trypton og 20 g agar i 1 L volum.
- Kultur transformerte bakterier ved 37 ° C inntilabsorbans ved 600 nm (A 600) når 0,5-0,7 i 1 liter LB-væskemedium supplert med 100 ug / ml ampicillin.
- Indusere proteinekspresjon ved tilsetning av 0,5 mM isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid til kulturen og inkubasjonen fortsatt i ytterligere 5 timer.
- Samle bakteriesuspensjonen ved sentrifugering ved 3800 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten. På dette punktet, enten lagre cellepelleten ved -20 ° C eller brukes umiddelbart for proteinrensing.
- SBDS-FLASH protein rensing
MERK: Alle kromatografiske trinn blir utført ved hjelp av en hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) system eller en peristaltisk pumpe. Ni 2+ -affinity kromatografi bruker en 5 ml rask flyt kolonne. Anionbyttende kromatografi bruker en 5 ml sterk sulfopropyl kationveksler kolonne. En strømningshastighet på 3 ml / min ble anvendt for alle de kromatografiske trinn.- Resuspender cellene i 35 ml SBDS Lysis bUffer (50 mM fosfatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) supplementert med 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og lyse ved sonikering i en total tid på 4 min ved bruk av sykluser med 10 sekunder på og 30 sekunder av, ved 4 ° C.
- Sentrifuger prøven ved 9000 xg i 50 min ved 4 ° C.
- Hold supernatanten og kasser pelleten for å fjerne cellulært avfall.
- Ekvilibrere Ni 2+ affinitetskolonnen med 3 kolonnevolumer (CV) av SBDS Lysis buffer og innføre hele klar supernatanten på kolonnen.
- Fjerne ubundet protein ved vasking med 3 CV av SBDS Lysis-buffer og elueres med 3 CV av SBDS elueringsbuffer (50 mM fosfatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).
- Fortynn det eluerte protein seks ganger med 50 mM fosfatbuffer pH 6,5, og fjerne eventuelle aggregater ved filtrering gjennom et 0,22 um cellulosemembran.
- Balanser sulfopropyl kationbytter kolonne med tre CV av lav salt S kolonne-buffer (50 mM fosfatbuffer pH 6,5, 50 mM NaCl) og innføre proteinprøven fra det foregående trinnet.
- Vask ubundet material med 3 CV av lav saltbuffer S-kolonne og eluere proteinet i ett trinn med 50 mM fosfatbuffer pH 6,5, 1 M NaCl.
- Fortynn det eluerte proteinet 3,3 ganger med 50 mM fosfatbuffer, pH 6,5. Konsentrer proteinet med ultrafiltreringsenheter ved sentrifugering ved 3800 x g i 15 min. Flash fryse proteinet i flytende nitrogen og lagres ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
- Bekrefte renheten av protein ved hjelp av SDS-PAGE-analyse og Coomassie-farging 20.
2. EFL1 Protein Expression og rensing
MERK: EFL1 ble uttrykt under regulering av Gal 1/10 divergerende promoteren 21 og Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR i vektoren pRS426. Det rekombinante protein som koder for det humane EFL1 isoformen en kondensert til en Tobacco Etch virus protease (TEV) anerkjennelse området og en hexahistidine kode på C-terminalen.
- EFL1 protein uttrykk
- Transform S. cerevisiae BCY123 celler med plasmidet pRS426-EFL1TevHis hjelp av en standard Lithium acetate protokoll 22. Plate alle de transformerte cellene i syntetisk slippe ut media uten uracil (SD-ura) supplert med 2% (w / v) glukose. Sammensetningen av SD-ura media består av 8 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 11 g kasaminosyrer, 55 mg adenin sulfat, 55 mg tyrosin, 60 mg leucin og 60 mg tryptofan i 1 L volum.
- Kultur transformert gjær ved 30 ° C inntil A 600 strekker 1,8 i 1 liter av SD-ura media supplert med 0,5% (w / v) glukose.
- Indusere proteinekspresjon ved tilsetning av 2,8% (vekt / volum) galaktose til kulturen og fortsette inkubering i ytterligere 18 timer ved 30 ° C.
- Samle gjærsuspensjonen ved sentrifugering ved 3800 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten.På dette punktet, enten lagre cellepelleten ved -20 ° C eller brukes umiddelbart for proteinrensing.
- EFL1 protein rensing
MERK: Alle kromatografiske trinn blir utført ved hjelp av et FPLC-system eller en peristaltisk pumpe. Ni 2+ -affinity kromatografi bruker en 5 ml Fast Flow-kolonne ved en strømningshastighet på 3 ml / min. størrelseseksklusjon kromatografi benytter en 125 ml kolonne pre-pakket med Superdex 200-harpiks ved en strømningshastighet på 1 ml / min.- Resuspender cellene i 50 ml EFL1 Lysis-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) supplementert med 1 mM PMSF og 1 mM benzamidin og forstyrre cellene etter friksjon på en vulst beater ved hjelp av glassperler (Ø = 0,5 mm) for en total tid på 6 min ved anvendelse av sykluser av 2 min ON og OFF 15 min, ved 4 ° C.
- Sentrifuger prøven ved 9000 xg i 50 min ved 4 ° C.
- Hold supernatanten og kasser pelleten for å fjerne cellulært avfall. Ekvilibrere Ni 2+ affinitetskolonnen med 3 CV av EFL1 Lysis-buffer og innføre all den klarede supernatant på kolonnen.
- Fjerne ubundet protein ved vasking med 3 CV av EFL1 Lysis-buffer og elueres med 3 CV av EFL1 elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, 5 mM MgCl2, 10% glycerol).
- Ekvilibrere størrelseseksklusjonskolonne med 1,5 CV av Anisotropi-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 5 mM β-merkaptoetanol).
- Konsentrer til 1 ml av EFL1 protein eluert fra Ni2 + affinitetskolonnen med ultrafiltreringsenheter ved sentrifugering ved 3800 xg til det ønskede volum. Innføre prøven i størrelseseksklusjonskolonne.
- Samle det eluerte protein og konsentrer ved ultrafiltrering til en sluttkonsentrasjon på omtrent 30 pM. Flash fryse proteinet i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Bekreft the renhet av proteinet ved SDS-PAGE-analyse og Coomassie-farging 20.
3. Merking av SBDS-blitsen når blits Fluorescent Dye 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) Fluorescein
- Bland 3 nmol av den SBDS-flash-protein med 3 nmol av 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein fargestoff i 5 ul volum av Anisotropy buffer.
- La reaksjonen fortsette i 8 timer ved 4 ° C. Dialyser prøven mot anisotropi buffer over natten for å fjerne den frie fargestoff.
- Bruk Lambert-Beer lov å kvantifisere% av merket protein. Mål absorbansen ved 280 nm og 508 nm i et spektrofotometer ved hjelp av en kvartskuvette av passende volum. MERK: Vurder følgende molare absorpsjonskoeffisienter (M -1 cm -1):
- Beregn konsentrasjonen av merket SBDS-flash protein ved bruk av ligning 2.
- Beregn konsentrasjonen av total SBDS protein ved bruk av ligning 3 ved å erstatte det beregnede C SBDS-flash fra forrige trinn.
- Beregn prosentandelen av merket protein ved bruk av ligning 4.
4. Fluorescens anisotropi Experiments
MERK: anisotropi eksperimenter ble utført i et spektrofluorometer utstyrt med en polarisasjon verktøykasse og datainnsamling ble utført ved anvendelse av anisotropi programmet gitt i programvaren av utstyret. Eksitasjonsbølgelengden ble innstilt på 494 nm med en spektral båndbredde på 8 nm og emisjonen ble registrert ved hjelp av et båndpassfilter på 530 ± 25 nm. Målinger ble utført ved 25 ° C i en 200 pl kyvette med en 5 mm banelengde 10.
- I en fluorescens kyvette, plasser 200 ul 30 nM SBDS-blits i anisotropi buffer og titrere 2 pl av 30 mikrometer EFL1. Bland godt og la reaksjonsblandingen stå i 3 minutter før måling av anisotropi verdi.
- Gjenta trinn 4,1 inntil et totalvolum på 40 ul EFL1 har blitt lagt til.
5. Data Analysis
- Monter data til riktig innbindings modellen ved hjelp av en ikke-lineær minste kvadraters regresjon algoritme. Ligningene for de vanligste bindingsmodeller er presentert i tabell 1.
- Vurdere den beste modellen som beskriver samspillet mellom proteiner ved å inspisere restene av passform 23. Støtt valgte modellen med flere eksperimenter.
Tabell 1. Felles protein-protein interaksjon bindingsmodellene og de matematiske ligningene som beskriver dem.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å utføre en hvilken som helst anisotropi eksperiment er det viktig å utelukke store endringer i fluorescensintensitet av fluoroforen siden den observerte anisotropi i en blanding av arter er representert ved ligning 5:
hvor F i representerer den fraksjons fluorescens av hver komponent og risert er den tilsvarende anisotropi. Den fraksjonelle fluorescens av hver komponent er avhengig av begge, dens konsentrasjon og dens relative fluorescens, som er definert ved ligning 6:
hvor X i representerer molfraksjonen av the jeg th art og Ø i er kvanteutbytte av i'te art.
Dermed, hvis fluorescens-intensiteten endres dramatisk langs titreringen er det bedre å enten måle kompleksdannelse som en funksjon av endringen i fluorescens-signal og ikke av anisotropien signal, eller korrigere observerte anisotropien verdi ved å anbringe både fluorescens intensitet og anisotropien data. Fluorescens SBDS-blitsen vil ikke merkbar endring ved binding til EFL1 (figur 2) som tyder på at fluorescens anisotropi er tilstrekkelig for å måle bindingen mellom de to proteiner.
Figur 2. Fluorescens utslipp av SBDS blits ved titrering av økende konsentrasjoner av EFL1. Endringer i fluorescens utslipp av fluoroforen er negligible og tilfeldig langs titrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Et eksempel på fluorescensen anisotropi bindingskurve oppnådd fra titrering av EFL1 til SBDS-Flash er vist i figur 3. Kvalitativt formen av diagrammet viser tydelig at de to proteinene samvirke som vist ved en økning i anisotrofien signal ved tilsetning av EFL1. Videre anisotropi verdiene nådde et platå som tyder på at ved slutten av titreringen alle SBDS-flash-protein var til stede i et kompleks med EFL1. Det er mulig da, for å kvantitativt beskrive samspillet mellom disse proteinene og passe dataene ved hjelp av ikke-lineær regresjon til en antatt bindende modell og få tilsvarende dissosiasjon likevektskonstant. Montering til en ett bindingssete modell ikke hensiktsmesbart beskrive de eksperimentelle data (figur 3A). Dette fremgår ikke bare fra beslaget trase i bindingskurve, men også fra de avvik av rester av tilpasningen (forskjellen mellom de teoretiske og eksperimentelle data) som er vesentlig og ikke-tilfeldig. Dette stemmer godt overens med det faktum at et enkelt bindingssete modellen er beskrevet matematisk ved hjelp av en hyperbolsk kurve i stedet for en sigmoidal kurve som den som ble observert for de eksperimentelle data presentert i figur 3. På den annen side, modeller som to like eller to forskjellige bindings sider beskrive bedre eksperimentelle data og restene av passform viser ingen systematisk avviks støtter en to-site forening modell (figur 3B-C). I fravær av en hvilken som helst annen eksperimentell informasjon er vanskelig å fastslå hvilken av de to modellene tilsvarer bindingsmekanismen mellom EFL1 og SBDS. Likevel SBDS og EFL1 er både monomere proteiner, så det er difficult å se for seg en to identiske bindingsseter modell.
. Figur 3. fluorescens anisotropi bindende isotermen av samspillet mellom EFL1 og SBDS-FLASH Den heltrukne linjen i hver av de øvre tomter tilsvarer tilpasning av data til forskjellige bindingsmodeller: (A) enkelt område, (B) to identiske nettsider og (C) to ikke-identiske områder. Lavere tomter representerer rester av tilpasning til tilsvarende modell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste biokjemiske forsøk med proteiner krever ikke bare rent protein, men også store mengder av dem, uavhengig av hvilken teknikk som brukes. Av denne grunn er de proteinene som benyttes for denne type forsøk erholdt ved heterolog ekspresjon, slik det var tilfellet presentert her. Florescence spektroskopi krever tilstedeværelse av en fluorofor i den studerte molekylet. Aromatiske rester utgjør den iboende fluoroforene av et protein, men ved hjelp av sitt signal for å studere protein-protein interaksjoner kompliserer analyse siden de er felles for de fleste proteiner og som ville være til stede i både den reseptorprotein og liganden. I tillegg, er levetiden av tryptofan er for kort for fluorescens anisotropi eksperimenter. Av denne grunn er det vanlig å legge til ytre fluoroforer til en av de studerte proteiner. For dette formål ble en fluorofor tilsatt til den C-terminale ende av SBDS gjennom en koordineringsbinding mellom fargestoffet 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein med en tetracysteine motiv innført i proteinet ved genetisk engineering. Velge protein som bares fluoroforen er ikke en tilfeldig sak. På grunn av størrelsen på proteinene studert her (SBDS 29 kDa og EFL1 127 kDa), vi forventet en større endring i anisotropi mellom fri merket-SBDS og at det i kompleks med EFL1, sammenlignet med endringen forventes mellom gratis merket-EFL1 og at bundet til SBDS. Med dette i tankene, ble en Flash tag innført i SBDS snarere enn å EFL1. En annen parameter viktig å vurdere når du setter opp en fluorescens anisotropi eksperiment er opptaket av de løsninger som brukes. Den optiske tettheten av oppløsningen i kyvetten bør ikke være større enn 0,1 ved eksitasjon og emisjonsbølgelengden, og bør forbli konstant langs hele titrering. Ellers kan indre filtereffekt interferere i målingen og må korrigeres for. I forsøket presentert her, gjør proteinene studerte ikke absorberer ved bølgelengden excitation eller utslipp av 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein fargestoff; dermed indre filter effekten ikke utgjøre et problem.
Når det gjelder datainnsamling, og til deretter på riktig plass til alle data, er det nødvendig å ha veldefinerte nedre og øvre grunnlinjer med flere datapunkter gjennom overgangen langs bindingskurve. Ellers montering av data er unøyaktig og informasjon om bindingen modus kan gå tapt. For å beskrive en skikkelig binding kurve er det nødvendig at konsentrasjonen av fri ligand forskjellig ved to logaritmiske enheter under og over dissosiasjonskonstanten imidlertid eksperimentelt dette kan være vanskelig å oppnå. I den nedre grense, kan det oppstå problemer med følsomheten av utstyr særlig når affiniteten mellom proteinene er meget høy, mens store konsentrasjoner ikke kan være mulig på grunn av løselighetsproblemer med liganden. Dette ble tydelig eksemplifisert ved testing samspillet mellom SBDSS143L sykdom mutant og EFL1. Denne mutant forstyrret binding til EFL1 i en slik grad at det ikke var mulig å oppnå en skikkelig binding kurve siden EFL1 bare kan konsentreres opp til 70 uM, og proteinet blir utvannet ≈ fem ganger i løpet av titreringen 10. Således er det nødvendig å ha et grovt estimat av affiniteten for å optimalisere titrering ordningen og sørge for at hopper i ligandkonsentrasjonen ikke forekommer ved posisjoner som ville føre til en mindre nøyaktig passform. For eksempel vil mangler de første punktene i bindingskurve presentert i figur 3 at den ser ut som en hyperbel misvisende forskeren mot en enkelt bindingssete modell.
Når oppsamlet, ble data montert på en antatt bindingsmodell. I forhold til fluorescens data, kan anisotropi data anvendes uten ytterligere manipulering og ikke trenger korreksjon for fortynning effekter. Likningene som er presentert i tabell 1 anser at [L] ≈[L] 0 på hvert punkt av titrering. Dette kan ikke skje når affiniteten mellom proteinene er svært høy, slik at i de første punktene i titreringen ligand uttømming finner sted. I dette scenariet, mer komplekse kvadratiske likninger beskrevet andre steder 23 for å passe dataene. I forsøket beskrevet her, liganden EFL1 var alltid i stort overskudd i forhold til konsentrasjonen av SBDS-blits og endringen i EFL1 konsentrasjon på hvert punkt av titreringen kan ses bort fra. Som omtalt i resultatdelen, en to ikke-identiske bindingsmodell best beskrives eksperimentelle data (Figur 3C). Ytterligere biokjemisk informasjon innhentet i gruppen støtter ideen om at dette er den korrekte modell for å beskrive samspillet mellom EFL1 og SBDS (data ikke vist). Denne modusen for interaksjonen er vanlig i multi-domene proteiner, så som EFL1 og SBDS er, og flere eksempler finnes i litteraturen 24-26. Det er imidlertid enLSO viktig å utelukke en uspesifikk interaksjon som kan fremstå som et samspill modell av forskjellige bindingssteder med forskjellige affinitet for sin ligand. For dette formål er et Scatchard-plott meget nyttig. Sammenlignet med andre teknikker, rapporterer fluorescens anisotrofien signal mengden av dannede kompleks, og dermed er det mulig å bygge et Scatchard-plott med dataene. En konveks Scatchard-kurve antyder en to forskjellig bindingsmodell med negativ cooperativity eller ikke-spesifikk binding, mens en konkav Scatchard plott innebærer en to forskjellig bindingsmodell med positiv cooperativity eller ligand ustabilitet (figur 4). Analyse av eksperimentelle data viste en Scatchard tomt med en konkav form som støtter modellen av to uavhengige bindingssteder for EFL1 og SBDS (figur 4D). Videre ble positivt cooperativity bekreftet etter å ha utført en Hill-analyse som resulterte i en Hill koeffisient verdi på 1,8 ± 0,02 (data ikke vist).
Figur 4. Scatchard tomter for ulike protein-protein bindende modeller. (A) Enkeltbindingssetet eller flere identiske nettsteder som ikke kommuniserer. (B) flere forskjellige bindingsseter med negativ cooperativity eller ikke-spesifikk binding. (C) Flere forskjellige bindingsseter med positiv cooperativity eller ligand ustabilitet. (D) Scatchard tomten som følge av analyse av eksperimentelle anisotropi data innhentet fra titrering av EFL1 til SBDS-blits. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fluorescens anisotropi er en løsning basert, sann-likevekt teknikk som krever den undersøkte molekyler til å forbli i oppløsning ved de betingelser som ble testet. Den kan brukes til å studere ikke viderely interaksjonen mellom full-lengde proteiner, men også interaksjonen mellom proteindomener, mutante proteiner eller peptider med post-translasjonelle modifikasjoner. Videre kan fluorescens anisotropi også benyttes for å måle binding av proteiner til lipidmembraner ved hjelp av fluorescerende prober følsomme membraner. Denne fremgangsmåten har blitt brukt for å studere effekten som a-synuclein har på synaptisk vesikkel pakking 27. En av de viktigste fordelene med fluorescens anisotropi er at den gir kvantitativ informasjon om den binding av de undersøkte molekyler, slik at ekte dissosiasjonskonstanter kan oppnås sammen med mekanistisk informasjon. Selv om andre biofysiske teknikker kan også anvendes for å oppnå slik informasjon, krever fluorescens anisotrofien små mengder av prøven, og kan utføres ikke bare i likevekt, som vist her, men også ved hjelp av rask kinetikk, slik som sluttet strømning fluorometri, for å oppnå foreningen og dissosiasjon rentekonstanter (k på og k av, henholdsvis) 28. En sammenlignende tabell med fordelene og ulempene ved fluorescens anisotropi med hensyn til andre biofysiske teknikker er presentert i tabell 2. Alle fremgangsmåtene beskrevet er sanne likevekts-teknikker, siden ingen av dem inkluderer en prosess for mekanisk separasjon av de frie og bundne fraksjoner. Som nevnt i resultatdelen, hvis fluorescensintensiteten av et merket protein i stor grad endres ved interaksjon, denne egenskapen kan deretter brukes til å kvantifisere affinitet av bindingen. Imidlertid, endringer i fluorescens intensitet som følge av vekselvirkningen antyder en mulig forstyrrelse av den ytre fluoroforen på den molekylære interaksjonen i seg selv; nemlig en mulig endring av dissosiasjonskonstanten (K d) verdien av de tilsvarende ikke-merkede proteiner. Som sådan kan fluorescens anisotropi betraktes som en mindre invasiv teknikk enn changes i fluorescens intensitet ettersom førstnevnte bør benyttes ved fluorescens-intensiteten ikke forandrer seg ved interaksjon. På denne måten, selv om store mengder av proteinet kreves, Isoterm Titrering kalorimetri (ITC) kan tilveiebringe en sann Kd verdi av den molekylære interaksjonen siden det er en etikett fri metode. På den annen side er mekanistisk informasjonen ikke oppnås fordi forskjeller i varmen bare rapportere om entalpien av prosessen og ikke mengden av komplekset som dannes 29.
Til sammenligning, in vivo metoder som gjær to-hybrid eller fragment komplemente analyser ikke krever rensede proteiner, men de gir bare semi-kvantitativ informasjon om modusen for bindingen. Til tross for det faktum at i gjær to-hybrid teknikken er mulig å uttrykke styrken av binding ved hjelp av Miller-enheter, er dette ikke en reell konstant likevekt og mange faktorer ut av kontroll av forskeren kan endre den.
Tabell 2. Fordeler og ulemper ved vanlig brukte biofysiske teknikker som brukes for å studere protein-protein interaksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al.
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
- Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
- Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
