Introduction
Der einzelliger Parasit, Trypanosoma brucei, ist ein Erreger von Krankheiten , die Menschen (über Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense) und Tiere (über Trypanosoma brucei brucei) in ganz Afrika südlich der Sahara beeinflussen. Es ist dem Säugetierwirt durch den Speichel der Tsetse-Fliege Vektor übertragen. Mensch und Tier afrikanischen Trypanosomiasis eine schwere wirtschaftliche Belastung in Endemiegebieten verursachen, und nur wenige Medikamente zur Verfügung stehen oder in der Entwicklung entweder Krankheit zu behandeln. Mechanismen der Immunumgehung zu verstehen, ist für die Entwicklung von Medikamenten für Trypanosomiasis kritisch. Antigenic Variation der dichten, Variant Oberflächen Glycoprotein (VSG) Mantel, der den Parasiten abdeckt , ist eine der wichtigsten Mittel , durch die T. brucei ausweicht die Säugetier-Antikörper - Reaktion. Ca. 2.000 Varianten des Gens VSG bestehen in Trypanosomen Genom, aber nur einer wird zu einem gegebenen Zeitpunkt transkribiert von einer ~ 15 Expression Websites. 'Switching' des exprimierten VSG kann entweder durch Kopieren eines VSG - Gens in den aktiven Expressionsstelle oder durch die Transkriptionsaktivierung eines zuvor stillen Expressionsstelle ( beschrieben in 1) auftreten.
Obwohl viel Arbeit zum Verständnis der Antigenvariation in T. gewidmet brucei, die Faktoren, die Frequenzeinfluss Schalt sind noch kaum verstanden. Bisherige Untersuchungen wurden durch die Tatsache erschwert , dass , während Schalt stochastisch in vitro auftritt, Schaltfrequenzen sehr niedrig sind, in der Größenordnung von 1 in etwa 10 6 Zellen 2. Dies macht es schwierig zu messen, ob ein gegebener Faktor erhöht oder Schaltfrequenz abnimmt, da Schalt hart ist in erster Linie zu detektieren. Vor 2009 Methoden für Switcher in einer bestimmten Population zu isolieren waren langwierig und arbeitsintensiv. Dazu gehörten Passagierung Trypanosomen durch immunisierten Mäuse gegen die herrschende VSG und dann erntet Zelleneinen Tag später 3 oder Hunderte von Zellen durch Immunofluoreszenz 4,5 zu zählen. Eine andere Strategie stützt sich auf Auswahl für Medikamentenresistenz zu Switcher 6 isolieren. Da African in vitro gezüchtet Trypanosomen typischerweise aus einer großen Population gemacht werden eine wichtige Variante ausdrückt, und eine viel kleinere Population von Switcher ausdrücken alternative Varianten, verweisen wir auf die Hauptvariante in diesem Papier als dominant, beginnend VSG. Dabei wir in keiner Weise andeuten wollen, dass diese wichtige Variante mehr Fitness als andere Varianten in der Bevölkerung hat.
Hier beschreiben wir eine Methode, die die Anzahl der Trypanosomen Expression eines nicht-dominanten VSG in einer bestimmten Population in 3 zuverlässig messen kann - 4 Std. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn man will, ob eine bestimmte genetische Manipulation oder medikamentöse Behandlung zu ermitteln, die Anzahl von geschalteten Zellen in einer Population erhöht. Anstatt die Population von Zellen zu befreien, die do ausdrückenminante, beginnend VSG durch Drogen oder durch immunologische Mittel werden diese Zellen durch diese zuerst mit magnetischen Kügelchen Beschichtung eliminiert gekoppelt Antikörper gegen das dominante VSG und dann auf einem Magnet Säule isoliert. Die geschaltete Population wird dann in der Durchströmungs gesammelt und wieder gefärbt mit einem Fluorophor anti-VSG markierten Antikörper Kontaminanten zu identifizieren. Die Quantifizierung erfolgt durch Zugabe einer definierten Anzahl von absolute Zählung beads zu jeder Probe erreicht , so daß das Verhältnis der Kügelchen zu den Zellen bestimmt und verwendet werden können , um die Anzahl von Umschaltern in der Population 7 zu quantifizieren.
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Protocol
ANMERKUNG: In dem Verfahren ist es notwendig, Zellen auf Eis zu halten. Kalte Medien sollten auch überall eingesetzt werden.
1. Probenernte
- Wachsen Lister-Stamm 427 Blutstrom Trypanosomen zu einer Dichte von 0,5 bis 1.000.000 / ml. Es ist am besten Kulturen mit einer kleinen Anzahl von Parasiten zu starten. Spin down 50 x 10 6 Zellen / Probe für 10 min bei 1500 x g. Achten Sie darauf , 1 x 10 6 Zellen in Kultur zu verlassen , für später als positive und negative Antikörper - Steuerelemente verwenden.
Hinweis: Dieses Protokoll kann auch auf aus Tierblut (siehe Diskussion für weitere Details) isoliert Trypanosomen verwendet werden. - Pipette oder schütten die meisten Überstand aus (lassen Sie etwa 750 & mgr; l). Transfer der Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Spin-Zellen bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg in einer Mikrozentrifuge und entfernen Überstand.
2. Magnetische Labeling
- Die Zellen in 150 & mgr; l Kulturmedium (HMI-9 with Serum zum Beispiel) + primäre anti-VSG-Antikörper in der entsprechenden Verdünnung.
HINWEIS: Die Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Es ist wichtig, eine primäre anti-VSG-Antikörper zu verwenden, die nicht mit einem Fluorophor markiert ist. - Vortex-Zellen einen Wirbel-Adapter-60 bei der Geschwindigkeit 6 unter Verwendung von - 10 min 8 in einem kalten Raum bei 4 ° C. Waschen mit 800 - 1000 ul kalten HMI-9 mit Serum.
- Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und den Überstand absaugen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und wie oben drehen. Den Überstand aspirieren. Pellet in 100 ul HMI-9 mit Serum.
- Hinzufügen, 110 & mgr; l magnetischen aktivierte Zellsortierung (MSC) Mikrokügelchen. Verwenden Sie Anti-Maus, anti-Kaninchen oder Anti-Biotin-Perlen als geeignet für den primären anti-Antikörper VSG. Gut mischen. Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min.
- Während Zellen werden verwirbelt, stellen eine Magnet-aktivierte Trennsäule / Probe auf einem Trennmagneten auf. Achten Sie darauf, eine erneute habenceptacle (wir verwenden, um eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen) unter der Spalte, die den Durchfluss zu sammeln. Stellen Sie das Gerät in einem kalten Raum.
- 2 ml HMI-9 mit Serum zu grundieren Spalte. Nach der Grundierung Ort ein 15 ml Zentrifugenröhrchen unter dem Säulendurchfluss von jeder Probe zu sammeln.
- Nach der 10-minütigen Inkubation in Schritt 2.4, fügen 800-1000 ul kalten HMI-9 mit Serum. Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und repeat 100 ul des Überstands zu verlassen.
- Flick das Zentrifugenröhrchen kräftig und visuell inspizieren das Rohr, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig suspendiert. 1 ml der HMI-9 mit Serum und Pipette auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen sind gut suspendiert.
3. Magnetische Trennung
- Stellen Sie sicher, dass die Spalten grundiert werden, wie oben beschrieben. Anwenden Zellen Spalte. Sammeln der Durchströmung mit Zellen, die die nicht-dominante VS exprimierenG. 1 ml Medium + Trypanosomen dauert in der Regel 6 bis 7 min durch die Säule zu fließen.
- Wasch 2x mit 1 ml HMI-9 mit Serum und zu sammeln, wie in Schritt 3.1 in dem gleichen Rohrdurchströmung.
- Divide Durchfluss (3 ml) in zwei 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Diese später kombiniert werden können , oder die Hälfte kann verwendet werden , um RNA zu isolieren, usw. - Entfernen Sie Spalte von Magneten. 3 ml HMI-9 mit Serum-Säule und tauchen Sie Säule in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen Zellen zu erhalten, die die Ausgangs, dominant VSG auszudrücken. Entfernen 300 ul eluierte Material für eine spätere Analyse. Bewahren Sie diese Zellen auf Eis.
- Zur Verwendung als positive und negative Kontrolle nehmen etwa 1 Million Zellen aus der Ausgangskultur von Kontrollzellen bei 37 ° C wachsen und Pipetten sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (die nicht zu wechseln häufig erwartet).
HINWEIS: Positive Kontrollzellen werden mit Fluorophor-markierten Antikörper in Schritt 4.1 gefärbt werden. Negative Kontrollzellen REMAin für den Rest des Protokolls ungefärbt. - Spin Durchflussproben und positive Kontrollprobe Antikörper bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen.
HINWEIS: Weitere 300 & mgr; l Aliquot von eluierten Zellen können als positive Kontrolle für die Anti-VSG-Färbung verwendet werden.
4. Die Färbung zu identifizieren Fremd- und Switcher
- Resuspendieren Durchflussproben und positive Kontrollzellen in 100 ul HMI-9 mit Serum + primären, Fluorophor-markiertem, anti-VSG Antikörper bei der geeigneten Verdünnung.
HINWEIS: Die markierten Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1: 1000. Der Fluorophor-markierten, anti-VSG können aus der gleichen Quelle wie die unmarkierten Antikörper in der Trenn MACS step.There 3 ml Durchfluss Probe in zwei Mikrozentrifugenröhrchen folgenden Schritt 3.5 sein sollte. - Um alle Durchfluss mittels Durchflusszytometrie, vereinige die Pellets in den beiden Mikrozentrifugenröhrchen analysieren, während erneut susdie Proben in 100 ul anhängiger HMI-9 mit Serum + anti-VSG-Antikörper. Gut mischen.
- Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min. In 800 - 1000 ul kalt HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen.
- Wasche die Zellen mit 1 ml von HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen. Während dieser letzten Spin, drehen die eluierten-Proben aus Schritt 3.4 nach unten und der negativen Kontrollprobe.
- Resuspendieren alle Flow-Through und eluierten Proben in: 148,5 ul HMI-9 mit Serum, 25 & mgr; l absolute Zählen Perlen und 1,5 ul Propidiumiodidfärbung Lösung (175 ul insgesamt). Resuspendieren positive und negative Antikörper Kontrollproben in 175 & mgr; l HMI-9 mit Serum. Achten Sie darauf, die Zahl der absoluten Zählen Perlen / 25 & mgr; l für die jeweilige Menge zur Aufzeichnung.
- Führen Sie alle Proben durch einen Durchflusszytometer und sammeln Daten. Tote Zellen anfärben als PI
- Berechnen Schaltfrequenzen mit Hilfe der Durchflusszytometrie Daten.
HINWEIS: Für Anweisungen, wie Schaltfrequenzen zu berechnen, finden Sie in der Zusatzdatei Flow Cytometry Calculations.docx und Tabelle 1.
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Representative Results
Die hier beschriebene Methode wurde verwendet , die Doppelstrangbrüche in der VSG Ausdruck Website zu demonstrieren stieg die Zahl der Switcher in einer Population 8. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus einer Population von Trypanosomen, die einen Doppelstrangbruch an der Expressionsstelle ähnlich induziert zu erzeugen wurden. Wir vergleichen diese Trypanosomen zu denen , die einen Doppelstrangbruch zu erzeugen , wurden nicht induziert. Abbildung 1 zeigt repräsentative Durchflusscytometrie Plots aus un-induzierten und induzierten gesammelten Zellen in Durchströmrichtung von der Magnet aktivierte Zellsortierung Spalte. Für dieses spezielle Experiment war die dominierende Ausgangs VSG Vsg2. Die linke Platten aus 1A zeigen nach vorn und Seitenstreuung, die Tore ermöglicht rund um die absolute Zählen Perlen und Zellen gezogen werden , die eine Vorwärts- und Seitenstreu Unterschrift zeigen , die charakteristisch für lebende Zellen ist. Beachten Sie, dass Gates könnengezogen werden, um mehr Zellen, weil tote Zellen umfassen kann mit PI-Färbung beseitigt werden; jedoch muss die Gate die gleiche für alle Proben gehalten werden. Die rechten Platten aus 1A zeigen nur jene Zellen, die auf den linken Platten innerhalb der "Live" Tor fallen. Zellen, die positiv für die PI (Q1 und Q2) sind tote Zellen färben. Zellen, die positiv für die dominante VSG und negativ für PI in Q3 Fleck sind Verunreinigungen. Die Zellen, die sich negativ sowohl für PI und der dominanten VSG in Q4 sind lebende Zellen anfärben, die eingeschaltet haben. Man kann beobachten, dass der prozentuale Anteil der Verunreinigungen in Q3 niedriger für diese Zellen ist, wenn ein Doppelstrangbruch induziert wurde. Jedoch können die Prozentsätze in Q3 nicht verwendet werden, zu folgern, ob es mehr Umschaltern in einer gegebenen Population sind. Es ist nur durch das Verhältnis der Anzahl der Zellen in Q4 zu der Anzahl der Perlen zu vergleichen gesammelt , dass eine Schaltfrequenzen berechnen kann. Tabelle 1 zeigt die Zahlen aus der flo erhaltenw-Zytometrie Plots und das Verfahren die Prozent-Switcher in diesen Populationen zu berechnen. Diese Berechnungen wurden auf drei biologische Proben durchgeführt , um die beobachteten Schaltfrequenzen in 1B angezeigt zu erhalten. Die Höhe der stochastischen Schalt in vitro ist sehr gering, da hier berechnet bei einem Durchschnitt von 9,53 × 10 -5, während eine Pause Ergebnisse in 1 induzieren - 6 x 10 -3 Zellen, die mit dem nicht-dominanten VSG eingeschaltet haben.
Abbildung 1. Isolierung und Quantifizierung von Switched Trypanosomenpopulationen. (A) Die Durchflusszytometrie Fraktionen von Trypanosomen in der Durchflussfraktion folgende Auswahl von nicht-Switcher auf einem Magnet aktivierte Zellsortierung Säule zeigt. Eine Population von Zellen mit einer induzierten I-SCEI Doppelstrangbruch wird ohne eine induzierte bre auf eine Population von Zellen im Vergleichak. (B) berechneten Frequenzen für Schaltzellen , die haben oder nicht mit einem I-SCEI Doppelstrangbruch induziert worden. Die Zahl auf dem Grundstück stellt die Ergebnisse einer zweiseitigen, ungepaarten T-Test. Die Fehlerbalken stellen SD. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Supplemental - Datei 1. Flow Cytometry Berechnungen. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Tabelle 1. Berechnung der Schaltfrequenzen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
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Discussion
In Bezug auf experimentelle Technik, die kritischste Komponente des Protokolls hält alle Proben kalt. Trypanosomen internalisieren sehr rasch Antikörper an ihre Oberfläche gebunden 9, aber dieser Prozess ist Motilität abhängig und beeinflussen nicht den Test, solange die Zellen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Alle Proben sollten immer auf Eis gehalten werden, und Pipettieren sollte schnell Exposition zu minimieren, um die 25 ° C Laborumgebung durchgeführt werden. Kalt HMI-9 mit Serum sollte zu Beginn des Experiments verfügbar sein und sollten während auf Eis gehalten werden. Die Isolierung der Trypanosomen, indem sie über die Säule läuft, muss in einem kalten Raum durchgeführt werden, wie es dauert 5 bis 7 min eine 1 ml Probe durch die Säule laufen. Wenn es mehr Proben als magnetische Trennung Einheiten zur Verfügung, magnetische Trennung sind, können in der Reihenfolge durchgeführt werden, solange Proben nicht aktiv getrennt werden auf Eis gehalten werden.
Es ist auch wichtig, dass die Proben sehr gut gemischt af seinter der letzten Waschung nach der Inkubation mit den Mikrokügelchen und vor der Isolierung auf dem Magneten. Dies kann durch aggressive Schnippen des Zentrifugenröhrchens oder leichte Verwirbelung erreicht werden. Keine Pellets oder Klumpen von Zellen sollten vor der Zugabe der Probe in die Trennsäule sichtbar sein, was durch einen Blick auf die Lichtmikroskopie Ebene überprüft werden kann. Wenn Klumpen vorhanden sind, ist das Niveau der Verunreinigung in der Durchfluss Probe von Zellen, die dominant VSG exprimierenden Regel deutlich höher als wünschenswert. Wenn für die Anzahl von Umschaltern in der Probe am Ende des Protokolls, die Berechnung durchgeführt wird, ist es wichtig, zu berücksichtigen, ob alle Durchfluss für die durchflusszytometrische Analyse verwendet wurde oder ob die Hälfte verwendet. Wenn nur die Hälfte verwendet wurde, sollte die Gesamtzahl der Umschaltern berechnet mit 2 multipliziert werden.
Wenn der Überstand während der Waschschritte entfernt wird, ist es nicht notwendig, den letzten Tropfen zu pipettieren ab, und in der Regel 15 bis 25 & mgr; l sindlinks des Pellets von Zellen umgibt. Dies ist besonders kritisch während der Endphase der Färbung und Waschen, weil an dieser Stelle Pellets selten in den Strömungsdurch Proben gesehen werden, weil es so wenige geschalteten Zellen sind.
Während die endgültige Anti VSG Fleck typischerweise mit gereinigtem, Fluorophor-markierten Anti-Antikörper VSG, das erste Anti-VSG Fleck vor der magnetischen Trennung kann getan werden, mit gereinigter Antikörper oder Serum durchgeführt wird. Wir haben auch Bioreaktor Überstand, abgeleitet von Hybridomen exprimiert anti-VSG Antikörper verwendet. Egal, das Material für den ersten Fleck verwendet wird, muss titriert werden gute Trennung der Zellen zu gewährleisten, die tun oder nicht äußern die dominant, beginnend VSG.
Es ist typisch für die Population von Zellen in der Durchfluss mit Zellen kontaminiert werden, um die dominante VSG ausdrückt. Während diese Kontamination sollte minimal sein, in unserer Erfahrung ist es selten, dass die Bevölkerung völlig von Zellen frei zu sein, zum Ausdruck bringening die dominante VSG. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Zellen, die durch das Isolationsverfahren gegangen sind nicht so hell mit Anti-Antikörper VSG als diejenigen Fleck, der nicht durch das Verfahren gewesen. Wir vermuten, dass zwei Dinge für diesen Unterschied erklären könnte. Der erste ist, dass Trypanosomen führt zu vergießen von VSG, und es gibt viele Spins, die an der Isolationsverfahren Spinnen. Dies würde erwartet werden, um die Intensität des Signals für den letzten anti-VSG stain zu verringern. Die zweite ist, dass der erste Schritt des Protokolls Anfärbung mit einem primären anti-VSG-Antikörper beinhaltet. Wenn die durch den Antikörper erkannten Epitope in diesem ersten Schritt gleich oder okkludieren die erkannten Epitope durch den Antikörper in der endgültigen stain werden verwendet, würde man die Intensität des Signals erwarten, daß sie niedriger ist als wenn nur ein Antikörper verwendet wurden. Aus diesem Grund ist es wichtig, den Antikörper zu titrieren, die in dem letzten Schritt verwendet wird, so dass das Signal von einem positiv gefärbte Zelle ungefähr zwei istGrößenordnungen höher als bei einem negativ gefärbten Zelle. Auf diese Weise, selbst wenn die Intensität des Signals von einer positiv Anfärben Zelle wird in Zellen verringert, die das Isolierungsverfahren unterzogen wurden, werden diese positiven Zellen noch gut von den negativen Zellen auf der Durchflusszytometrie Stück getrennt werden. Wenn die automatische Kompensation verwendet wird, sollte einzelne Fleck Kontrollproben hergestellt werden. Antikörper, die wir erzeugt haben, sind für den Kauf von Memorial Sloan Cancer Center monocolonal Antikörper-Anlage zur Verfügung. Wir haben mit der Verwendung von unmarkierten monoklonalen IgG-Antikörper den besten Erfolg hatte. Wir haben das Protokoll mit polyklonalen Antikörpern VSG durchgeführt, jedoch polyklonale Antikörper können gelegentlich andere VSGs erkennen, um monoklonale Antikörper bevorzugt sind. VSG Identität kann aus der Amplifikation von konservierten Sequenzen in der VSG 3'UTR und die gespleißten Leiter erzeugt durch Sequenzierung VSG cDNA bestimmt werden. Ein besonderer Antikörper kann auf zuvor isolierten geschaltet Spezifität getestet werdenZellen, die VSG Identität wurde, wie gerade beschrieben bestimmt.
Das Protokoll hier vorgestellte hat eine Reihe von Vorteilen auf. Es kann sowohl zu isolieren Umschaltern für die spätere Analyse verwendet werden, und die Anzahl von Umschaltern in einer gegebenen Population zu quantifizieren. Es kann auch eine spezielle Variante von Interesse, solange ein Antikörper verfügbar ist für diese Variante zu isolieren, verwendet werden. Es ist auch möglich, dieses Protokoll Trypanosomen auszuführen isoliert von Tieren, mit der Maßgabe, dass rote Blutzellen Anti Ter119 eliminiert unter Verwendung unter Verwendung von beschichteten magnetischen Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers. Wir haben nicht die untere Grenze für die Zahl der Trypanosomen erforderlich getestet, aber wir haben erfolgreich das Protokoll unter Verwendung von 2,5 durchgeführt - 10 Millionen Trypanosomen von 250 ul Blut. Schließlich kann das Protokoll in Verbindung mit der Fluktuationsanalyse verwendet werden, um die Frequenz des Schaltens in einer gegebenen Population zu erhalten.
Das Isolierungsverfahren ist ziemlich fast, wobei 3 bis 4 Stunden vom Start in Abhängigkeit von der Anzahl von Proben zu beenden, und somit ist effizienter als frühere Verfahren, die vor der Immunisierung von Mäusen oder spezielle Stämme enthaltenden Arzneimittelresistenzmarker erforderlich. Das Verfahren ist durch die Tatsache begrenzt, dass Antikörper gegen das Ausgangs VSG erforderlich sind, jedoch. Ohne eine solche Reagenzien, ein alternatives Verfahren wie beispielsweise VSG-seq könnte eine geeignetere Wahl zu messen sein , die VSGs in einer gegebenen Population 10 ausgedrückt werden.
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Acknowledgments
Wir möchten, dass George Cross für allgemeine Hinweise auf Trypanosomen Biologie anzuerkennen. Diese Arbeit wurde auch durch eine Bill and Melinda Gates Foundation GCE Zuschuss DS, ein NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) zu MRM und ein NIH / NIAID (Erteilungs # AI085973) zu FNP unterstützt. Wir danken Galadriel Hovel-Miner für die Verwendung des Stammes der I-SCEI-Gen und Erkennungsstelle enthält.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
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