Introduction
प्रोटोजोआ परजीवी, Trypanosoma ब्रुसे, रोगों कि मनुष्यों और जानवरों (Trypanosoma ब्रुसे ब्रुसे के माध्यम से) उप-सहारा अफ्रीका में (Trypanosoma ब्रुसे gambiense और Trypanosoma ब्रुसे रोडेसिएंस के माध्यम से) को प्रभावित की एक प्रेरणा का एजेंट है। यह ट्सेत्सी मक्खी वेक्टर के लार के माध्यम से स्तनधारी मेजबान को प्रेषित किया है। दोनों मानव और पशुओं अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस स्थानिक क्षेत्रों में एक गंभीर आर्थिक बोझ का कारण है, और कुछ दवाओं के उपलब्ध या विकास या तो बीमारी का इलाज करने के लिए कर रहे हैं। प्रतिरक्षा चोरी के तंत्र को समझना trypanosomiasis के लिए दवाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। घने, variant सतह ग्लाइकोप्रोटीन (VSG) कोट कि परजीवी शामिल किया गया है की प्रतिजनी बदलाव प्राथमिक साधन है जिसके द्वारा टी ब्रुसे स्तनधारी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया बचाव किया। VSG जीन के लगभग 2,000 वेरिएंट trypanosome जीनोम में मौजूद हैं, लेकिन केवल एक में से एक से किसी भी समय पर लिखित है ~ 15 एक्सप्रेशंससायन साइटों। व्यक्त VSG की 'स्विचिंग' या तो सक्रिय अभिव्यक्ति साइट में एक VSG जीन को कॉपी करके, या एक पहले से मूक अभिव्यक्ति साइट (1 में समीक्षा) के transcriptional सक्रियण द्वारा हो सकता है।
हालांकि बहुत काम में टी समझने प्रतिजनी बदलाव के लिए समर्पित किया गया है ब्रुसे, कारक है कि आवृत्ति स्विचन प्रभाव अभी भी खराब समझ रहे हैं। तारीख के अध्ययन इस तथ्य यह है कि जब स्विचिंग इन विट्रो में प्रसंभात्य होता है, स्विचिंग आवृत्तियों, बहुत कम हैं लगभग 10 6 कोशिकाओं 2 में 1 के आदेश पर द्वारा बाधा उत्पन्न की है। इस उपाय को एक दिया कारक बढ़ जाती है या, स्विचिंग आवृत्ति कम हो जाती है कि क्या के बाद से स्विचिंग पहली जगह में पता लगाने के लिए मुश्किल है, यह कठिन बना देता है। 2009 से पहले, एक दिया आबादी में switchers को अलग-थलग करने के लिए तरीके लंबा थे और श्रम गहन। इनमें प्रमुख VSG के खिलाफ प्रतिरक्षित चूहों के माध्यम से Trypanosomes passaging और फिर कटाई कोशिकाओंएक दिन बाद 3, या immunofluorescence 4,5 द्वारा कोशिकाओं के सैकड़ों की गिनती। एक और रणनीति के चयन पर निर्भर करता है दवा प्रतिरोध switchers 6 अलग-थलग करने के लिए। क्योंकि अफ्रीकी विट्रो में उगाया Trypanosomes आम तौर पर एक बड़ी आबादी के एक प्रमुख संस्करण है, और वैकल्पिक वेरिएंट व्यक्त switchers के एक बहुत छोटे आबादी को व्यक्त करने के बने होते हैं, हम प्रमुख, शुरू VSG के रूप में इस पत्र भर में प्रमुख संस्करण को देखें। ऐसा करने में, हम कोई रास्ता नहीं में इस प्रमुख संस्करण जनसंख्या में अन्य वेरिएंट की तुलना में अधिक से अधिक फिटनेस है कि संकेत करने के लिए चाहते हैं।
4 घंटा - यहाँ हम एक तरीका है कि मज़बूती से 3 में एक भी आबादी में एक गैर प्रमुख VSG व्यक्त Trypanosomes की संख्या उपाय कर सकते हैं का वर्णन है। इस विधि जब एक पता लगाने के लिए एक दिया आनुवंशिक हेरफेर या नशीली दवाओं के उपचार की आबादी में बंद कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है कि क्या चाहता है के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। बजाय करना व्यक्त कोशिकाओं की आबादी को मुक्त करने कीminant, दवाओं के माध्यम से VSG शुरू करने या प्रतिरक्षा तरह से, इन कोशिकाओं को पहली बार उन्हें प्रमुख VSG के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए युग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ कोटिंग और फिर एक चुंबकीय स्तंभ पर उन्हें अलग से समाप्त हो जाते हैं। स्विच्ड आबादी तो प्रवाह के माध्यम से एकत्र की है और एक fluorophore लेबल विरोधी VSG एंटीबॉडी contaminants की पहचान करने के साथ फिर से सना हुआ है। मात्रा का ठहराव प्रत्येक नमूने के लिए पूर्ण गिनती मोतियों की एक निर्धारित संख्या को जोड़ने इतना है कि कोशिकाओं के लिए मोती के अनुपात निर्धारित किया है और जनसंख्या 7 में switchers की संख्या यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा हासिल की है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: प्रक्रिया के दौरान, यह बर्फ पर कोशिकाओं को रखने के लिए आवश्यक है। शीत मीडिया भी भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
1. नमूना कटाई
- 1 लाख / मिलीलीटर - 0.5 के घनत्व को लिस्टर 427 तनाव खून Trypanosomes आगे बढ़ें। यह परजीवी की एक छोटी संख्या के साथ संस्कृतियों शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है। 50 x 10 6 कोशिकाओं / नमूना स्पिन पर 1,500 x जी 10 मिनट के लिए। संस्कृति में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं को छोड़ने के लिए बाद में के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक एंटीबॉडी नियंत्रण का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल भी पशुओं के रक्त (विवरण के लिए चर्चा देखें) से अलग Trypanosomes पर इस्तेमाल किया जा सकता है। - पिपेट या सतह पर तैरनेवाला के सबसे टपकना (750 के बारे में μl छोड़)। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
- कोशिकाओं को एक microcentrifuge में 5,200 XG पर 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
2. चुंबकीय लेबलिंग
- Resuspend कोशिकाओं 150 μl संस्कृति के माध्यम में (एचएमआई -9 वाईउचित कमजोर पड़ने पर उदाहरण के लिए वीं सीरम) + प्राथमिक विरोधी VSG एंटीबॉडी।
नोट: विरोधी VSG एंटीबॉडी घर में बनाया और 1:50 के कमजोर पड़ने पर प्रयोग किया जाता है। यह एक प्राथमिक विरोधी VSG एंटीबॉडी कि एक fluorophore के साथ लेबल नहीं है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। - भंवर कोशिकाओं की गति 6 पर एक भंवर एडाप्टर -60 का उपयोग कर - 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में 8। 1,000 μl ठंड एचएमआई-9 सीरम के साथ - 800 से धो लें।
- 5200 XG पर 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला aspirate। सीरम के साथ 1 मिलीलीटर एचएमआई-9 से धो लें और ऊपर के रूप में स्पिन। सतह पर तैरनेवाला aspirate। सीरम के साथ एचएमआई-9 के 100 μl में resuspend गोली।
- छँटाई (एमएससी) microbeads चुंबकीय सक्रिय सेल के 110 μl जोड़ें। प्राथमिक विरोधी VSG एंटीबॉडी के लिए उचित रूप में विरोधी माउस, विरोधी खरगोश, या विरोधी बायोटिन मोती का प्रयोग करें। अच्छी तरह मिलाएं। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में भंवर कोशिकाओं।
- कोशिकाओं vortexing कर रहे हैं, एक चुंबक जुदाई पर एक चुंबकीय सक्रिय जुदाई स्तंभ / नमूना की स्थापना की। एक फिर से है, ज़रूरceptacle (हम एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग करें) कॉलम के तहत प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए। एक ठंडे कमरे में तंत्र की स्थापना की।
- प्रधानमंत्री स्तंभ के लिए सीरम के साथ एचएमआई-9 के 2 मिलीलीटर जोड़ें। स्तंभ के तहत जगह एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब भड़काना प्रवाह के माध्यम से प्रत्येक नमूने से एकत्र करने के बाद।
- 2.4 चरण में 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, 800-1000 μl ठंड एचएमआई-9 सीरम के साथ जोड़ें। 5200 XG पर 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटाने अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने के लिए। सीरम और दोहराने सतह पर तैरनेवाला के 100 μl छोड़ने के साथ एचएमआई-9 के 1 मिलीलीटर के साथ धोएं।
- अपकेंद्रित्र ट्यूब झटका सख्ती और नेत्रहीन ट्यूब का निरीक्षण सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से resuspended है बनाने के लिए। कोशिकाओं में अच्छी तरह से resuspended हैं यकीन है कि बनाने के लिए सीरम और पिपेट ऊपर और नीचे के साथ एचएमआई-9 के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
3. चुंबकीय जुदाई
- सुनिश्चित करें कि स्तंभों के रूप में ऊपर वर्णित primed रहे हैं। स्तंभ के लिए कोशिकाओं को लागू करें। कोशिकाओं गैर प्रमुख वी एस व्यक्त के साथ प्रवाह के माध्यम से ले लीजिएस्तंभ के माध्यम से प्रवाह के लिए 7 मिनट - माध्यम के जी 1 मिलीलीटर + Trypanosomes आमतौर पर 6 लेता है।
- के 1 मिलीलीटर एचएमआई-9 सीरम के साथ साथ धो 2x और 3.1 कदम के रूप में प्रवाह के माध्यम से ही ट्यूब में इकट्ठा।
- फूट डालो प्रवाह के माध्यम से (3 एमएल) के दो 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में।
नोट: ये बाद में जोड़ा जा सकता है या आधा, आदि शाही सेना को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता - चुंबक से स्तंभ निकालें। स्तंभ के लिए सीरम के साथ एचएमआई-9 के 3 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं है कि शुरुआती, प्रमुख VSG को व्यक्त प्राप्त करने के लिए एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्तंभ उतर रही है। बाद में विश्लेषण के लिए eluted सामग्री के 300 μl निकालें। बर्फ पर इन कोशिकाओं रखें।
- एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ रही नियंत्रण कक्षों के शुरू संस्कृति से लगभग 1 मिलियन कोशिकाओं लेते हैं और उन्हें पिपेट एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में (उन अक्सर स्विच करने की उम्मीद नहीं)।
नोट: सकारात्मक नियंत्रण कक्षों 4.1 चरण में fluorophore लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जाएगा। नकारात्मक नियंत्रण कक्षों Remaप्रोटोकॉल के बाकी भर में बेदाग में। - स्पिन प्रवाह के माध्यम से नमूने और 5,200 XG पर 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सकारात्मक एंटीबॉडी नियंत्रण नमूना और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
नोट: eluted कोशिकाओं की एक और 300 μl विभाज्य विरोधी VSG धुंधला के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
4. धुंधला contaminants और Switchers पहचानें
- Resuspend प्रवाह के माध्यम से नमूने और के 100 μl एचएमआई-9 सीरम + प्राथमिक, fluorophore लेबल, विरोधी VSG उचित कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी के साथ में सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं।
नोट: लेबल विरोधी VSG एंटीबॉडी घर में की गई और 1 के एक कमजोर पड़ने पर प्रयोग किया जाता है: 1,000। fluorophore लेबल, विरोधी VSG एक ही स्रोत एमएसीएस जुदाई में लेबल हटाया गया एंटीबॉडी के रूप में step.There 3.5 चरण के बाद दो microcentrifuge ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से नमूने के 3 मिलीग्राम होना चाहिए से हो सकता है। - प्रवाह के माध्यम से प्रवाह से सभी को cytometry का विश्लेषण करने के लिए, दो microcentrifuge ट्यूबों में छर्रों गठबंधन जबकि फिर से SUSके 100 μl एचएमआई-9 सीरम + विरोधी VSG एंटीबॉडी के साथ में नमूने लंबित है। अच्छी तरह मिलाएं।
- 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में भंवर कोशिकाओं। 1,000 μl ठंड एचएमआई-9 सीरम के साथ - 800 जोड़े। 5200 XG पर और सतह पर तैरनेवाला हटाने 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन नमूने अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने के लिए।
- सीरम के साथ एचएमआई-9 के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। 5200 XG पर और सतह पर तैरनेवाला हटाने 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन नमूने हैं। यह पिछले स्पिन के दौरान, 3.4 कदम और नकारात्मक नियंत्रण के नमूने से eluted नमूने नीचे स्पिन।
- 148.5 μl एचएमआई-9 सीरम के साथ, 25 μl पूर्ण गिनती माला और 1.5 μl propidium आयोडाइड धुंधला समाधान (175 μl कुल): सभी प्रवाह के माध्यम से और eluted नमूने Resuspend। सीरम के साथ 175 μl में सकारात्मक और नकारात्मक एंटीबॉडी नियंत्रण नमूने Resuspend एचएमआई-9। पूर्ण गिनती के मोती / इस्तेमाल विशेष रूप से बहुत कुछ के लिए 25 μl की संख्या रिकॉर्ड करने के लिए सुनिश्चित करें।
- कोशिकामापी एक प्रवाह के माध्यम से सभी नमूनों चलाने के लिए और डेटा इकट्ठा। मृत पीआई के रूप में दाग कोशिकाओं
- डेटा प्रवाह cytometry का उपयोग आवृत्तियों स्विचन की गणना।
नोट: कैसे स्विचन आवृत्तियों की गणना करने के निर्देशों के लिए, कृपया पूरक फ़ाइल को संदर्भित से फ्लो Calculations.docx और तालिका 1।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहाँ वर्णित विधि का प्रदर्शन करने के VSG अभिव्यक्ति साइट के भीतर है कि डबल भूग्रस्त टूटता इस्तेमाल किया गया था आबादी 8 में switchers की संख्या में वृद्धि हुई। यहाँ, हम Trypanosomes है कि इसी तरह की अभिव्यक्ति स्थल पर एक डबल कतरा तोड़ उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया गया की आबादी से प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं। हम जानते हैं कि एक डबल कतरा तोड़ उत्पन्न करने के लिए प्रेरित नहीं किया गया है उन लोगों के लिए इन Trypanosomes की तुलना करें। चित्रा 1 प्रवाह के माध्यम से चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई स्तंभ से में एकत्र संयुक्त राष्ट्र प्रेरित और प्रेरित कोशिकाओं से भूखंडों cytometry प्रतिनिधि प्रवाह को दर्शाता है। यह विशेष रूप से प्रयोग के लिए प्रभावी शुरू VSG VSG2 था। चित्रा 1 ए के बाएं हाथ के पैनल आगे दिखाने के लिए और पक्ष बिखराव है, जो फाटक पूर्ण गिनती माला और कोशिकाओं है कि एक आगे और पक्ष बिखराव हस्ताक्षर है कि जीवित कोशिकाओं की विशेषता है दिखाने के चारों ओर खींचा जा सकता है। ध्यान दें कि फाटक कर सकते हैंक्योंकि मृत कोशिकाओं पीआई धुंधला के साथ समाप्त किया जा सकता और अधिक कोशिकाओं को शामिल करने के लिए तैयार हो; हालांकि, गेट सभी नमूनों के लिए ही रखा जाना चाहिए। चित्रा 1 ए के दाएँ हाथ पैनलों केवल उन कोशिकाओं है कि बाएं हाथ के पैनल पर 'लाइव' गेट के भीतर गिर दिखा। प्रकोष्ठों कि पीआई (Q1 और Q2) के लिए सकारात्मक दाग मृत कोशिकाओं रहे हैं। प्रकोष्ठों कि Q3 में गड़बड़ी के लिए प्रमुख VSG के लिए सकारात्मक और नकारात्मक contaminants दाग रहे हैं। प्रकोष्ठों कि दोनों पीआई और Q4 में प्रमुख VSG के लिए नकारात्मक दाग जीवित कोशिकाओं है कि बंद कर दिया है। एक देख सकते हैं कि Q3 में contaminants के प्रतिशत जहां एक डबल कतरा तोड़ प्रेरित किया गया है उन कोशिकाओं के लिए कम है। हालांकि, Q3 में प्रतिशत के अनुमान करने के लिए एक दिया आबादी में अधिक switchers देखते हैं कि क्या इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। यह केवल एकत्र कि एक स्विचन आवृत्तियों की गणना कर सकते मोतियों की संख्या के Q4 में कोशिकाओं की संख्या के अनुपात की तुलना कर रहा है। तालिका 1 फ़्लो से प्राप्त संख्या से पता चलता हैw cytometry भूखंडों और विधि इन आबादियों में प्रतिशत switchers गणना करने के लिए। इन गणनाओं मनाया स्विचिंग आवृत्तियों चित्रा 1 बी में दिखाया प्राप्त करने के लिए 3 जैविक नमूने पर प्रदर्शन किया गया। 6 x 10 -3 कोशिकाओं है कि गैर प्रमुख VSG के लिए बंद कर दिया है - इन विट्रो में स्टोकेस्टिक स्विचिंग का स्तर काफी कम के रूप में 9.53 x 10 -5 की औसत से यहाँ गणना की है, जबकि 1 में एक को तोड़ने के परिणाम उत्प्रेरण है।
चित्रा 1. अलगाव और स्विचड trypanosome आबादी की मात्रा। (ए) के माध्यम से प्रवाह अंश एक चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई स्तंभ पर गैर switchers का चयन निम्नलिखित में Trypanosomes के भागों दिखा प्रवाह cytometry। एक प्रेरित मैं-SCEI डबल कतरा तोड़ साथ कोशिकाओं की आबादी एक प्रेरित BRE बिना कोशिकाओं की आबादी की तुलना में हैएके। (बी) कोशिकाओं है या एक मैं SCEI डबल असहाय तोड़ने के साथ प्रेरित नहीं किया गया है कि के लिए आवृत्तियों स्विचन गणना की थी। भूखंड पर नंबर एक दो पूंछ, unpaired टी परीक्षण के परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करते हैं SD। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1. से फ्लो गणना। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1 स्विचिंग आवृत्तियों की गणना। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्रयोगात्मक तकनीक के लिए सम्मान के साथ, प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण घटक ठंड सभी नमूनों रखे हुए है। Trypanosomes बहुत तेजी से उनकी सतह 9 के लिए बाध्य एंटीबॉडी भली, लेकिन इस प्रक्रिया गतिशीलता निर्भर है, और जब तक परख प्रभावित नहीं करता है के रूप में कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। सभी नमूनों हमेशा बर्फ पर रखा जाना चाहिए, और pipetting जल्दी से किया जाना चाहिए 25 डिग्री सेल्सियस प्रयोगशाला पर्यावरण के लिए जोखिम को कम करने के लिए। शीत एचएमआई-9 सीरम के साथ प्रयोग के शुरू में उपलब्ध होना चाहिए और भर बर्फ पर रखा जाना चाहिए। उन्हें स्तंभ पर चलाने के द्वारा Trypanosomes के अलगाव, एक ठंडे कमरे में किया जाना चाहिए, क्योंकि यह 5 लेता है - कॉलम के माध्यम से 1 मिलीलीटर नमूना चलाने के लिए 7 मिनट। अगर वहाँ उपलब्ध चुंबकीय जुदाई इकाइयों की तुलना में अधिक नमूने हैं, चुंबकीय अलगाव अनुक्रम में किया जा सकता है, के रूप में लंबे समय के रूप में सक्रिय रूप से अलग नहीं किया जा रहा नमूने बर्फ पर रखा जाता है।
यह भी महत्वपूर्ण है कि नमूने बहुत अच्छी तरह से मिश्रित वायुसेना होचुंबक पर microbeads और अलगाव से पहले साथ ऊष्मायन के बाद पिछले धोने आतंकवाद। इस अपकेंद्रित्र ट्यूब या प्रकाश vortexing के आक्रामक flicking द्वारा पूरा किया जा सकता है। कोई गोली या कोशिकाओं के झुरमुटों जुदाई स्तंभ के लिए नमूना है, जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी स्तर पर देख द्वारा जाँच की जा सकती है, के अलावा करने से पहले दिखाई जानी चाहिए। झुरमुटों मौजूद हैं, प्रमुख VSG व्यक्त कोशिकाओं के प्रवाह के माध्यम से नमूने में प्रदूषण का स्तर आम तौर पर वांछनीय से काफी ज्यादा है। जब प्रोटोकॉल के अंत में नमूने में switchers की संख्या के लिए गणना प्रदर्शन, यह है कि क्या सभी प्रवाह के माध्यम से प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था खाते में लेने के लिए महत्वपूर्ण है, या कि क्या आधा इस्तेमाल किया गया था। अगर केवल आधा इस्तेमाल किया गया था, गणना switchers की कुल संख्या 2 से गुणा किया जाना चाहिए।
जब धोने चरणों के दौरान सतह पर तैरनेवाला हटाने, यह हर पिछले ड्रॉप बंद पिपेट करने के लिए आवश्यक नहीं है, और आम तौर पर 15 - 25 μl हैंकक्षों की गोली आसपास छोड़ दिया है। क्योंकि इस बिंदु पर शायद ही कभी छर्रों प्रवाह के माध्यम से नमूनों में देखा जाता है तो कुछ देखते हैं बंद कर कोशिकाओं क्योंकि यह धुंधला और कपड़े धोने के अंतिम चरण के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
अंतिम विरोधी VSG दाग आमतौर पर शुद्ध, fluorophore लेबल विरोधी VSG एंटीबॉडी के साथ किया जाता है, वहीं चुंबकीय अलगाव से पहले पहले विरोधी VSG दाग शुद्ध एंटीबॉडी या सीरम के साथ किया जा सकता है। हम यह भी बायोरिएक्टर सतह पर तैरनेवाला विरोधी VSG एंटीबॉडी व्यक्त हाइब्रिडोमास से निकाली गई इस्तेमाल किया है। भले ही, प्रारंभिक दाग के लिए इस्तेमाल सामग्री कोशिकाओं है कि क्या करना है या प्रमुख, शुरू VSG व्यक्त नहीं करते की अच्छी जुदाई सुनिश्चित करने के लिए titrated किया जाना चाहिए।
यह प्रवाह के माध्यम से में कोशिकाओं की आबादी के लिए ठेठ प्रमुख VSG व्यक्त कोशिकाओं के साथ दूषित किया जा रहा है। इस प्रदूषण को कम किया जाना चाहिए, वहीं हमारे अनुभव में यह दुर्लभ है आबादी कोशिकाओं के पूरी तरह से रहित अभिव्यक्त होने के लिएप्रमुख VSG हैैं। यह भी ध्यान दें कि कोशिकाओं है कि अलगाव की प्रक्रिया के माध्यम से चले गए उन है कि प्रक्रिया के माध्यम से नहीं किया गया के रूप में विरोधी VSG एंटीबॉडी के साथ के रूप में चमकते दाग नहीं है महत्वपूर्ण है। हम जानते हैं कि दो बातें इस अंतर के लिए खाते सकता है परिकल्पना। पहला यह है कि Trypanosomes कताई VSG का बहा की ओर जाता है, और वहाँ कई स्पिन अलगाव की प्रक्रिया में शामिल कर रहे हैं। यह अंतिम विरोधी VSG दाग के लिए संकेत की तीव्रता में कमी करने की उम्मीद होगी। दूसरा यह है कि प्रोटोकॉल के पहले कदम के लिए एक प्राथमिक विरोधी VSG एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना शामिल है। epitopes इस पहले चरण में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त के रूप में वही कर रहे हैं या epitopes अंतिम दाग में एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त रोक देना है, एक संकेत की तीव्रता अगर एक ही एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया तुलना में कम होने की उम्मीद है। इस कारण से यह एंटीबॉडी कि अंतिम चरण में इस्तेमाल किया जाता है, कि इस तरह के एक सकारात्मक दाग सेल से संकेत मोटे तौर पर दो है titrate के लिए महत्वपूर्ण हैपरिमाण एक नकारात्मक दाग सेल के लिए की तुलना में अधिक के आदेश। इस तरह, भले ही एक सकारात्मक धुंधला हो जाना सेल से संकेत की तीव्रता कोशिकाओं है कि अलगाव की प्रक्रिया से गुजरा है में कमी आई है, इन सकारात्मक कोशिकाओं को अभी भी अच्छी तरह से फ्लो भूखंड पर नकारात्मक कोशिकाओं से अलग कर दिया जाएगा। ऑटो मुआवजा इस्तेमाल किया जा रहा है, तो एकल दाग नियंत्रण नमूने तैयार रहना चाहिए। एंटीबॉडी कि हम उत्पन्न किया है मेमोरियल स्लोअन कैंसर केंद्र monocolonal एंटीबॉडी सुविधा से खरीद के लिए उपलब्ध हैं। हम लेबल हटाया गया मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग आईजीजी के साथ सबसे अच्छा सफलता मिली है। हम पॉलीक्लोनल VSG एंटीबॉडी के साथ प्रोटोकॉल बाहर किया है, लेकिन पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी कभी कभी अन्य VSGs इसलिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पसंद कर रहे हैं पहचान सकते हैं। VSG पहचान VSG 3'UTR और spliced नेता में संरक्षित दृश्यों के प्रवर्धन से उत्पन्न अनुक्रमण VSG सीडीएनए द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। एक विशेष एंटीबॉडी पर पहले से पृथक बंद कर विशिष्टता के लिए परीक्षण किया जा सकताकोशिकाओं जो VSG पहचान के रूप में सिर्फ वर्णित निर्धारित किया गया है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल लाभ का एक नंबर है। यह दोनों में इस्तेमाल किया जा सकता है बाद में विश्लेषण के लिए switchers को अलग-थलग करने के लिए और एक निश्चित आबादी में switchers की संख्या यों। यह भी ब्याज की एक विशेष संस्करण को अलग करने के रूप में लंबे समय के रूप में एक एंटीबॉडी कि संस्करण के लिए उपलब्ध है इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रदान की है कि लाल रक्त कोशिकाओं निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार विरोधी Ter119 लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर रहे हैं सफाया भी इस प्रोटोकॉल जानवरों से अलग Trypanosomes का उपयोग कर बाहर ले जाने के लिए संभव है। हम आवश्यक Trypanosomes की संख्या के लिए निचली सीमा परीक्षण नहीं किया है, लेकिन हम सफलतापूर्वक प्रोटोकॉल 2.5 का उपयोग किया जाता है - रक्त के 250 μl से 10 लाख Trypanosomes। अंत में, प्रोटोकॉल एक दिया आबादी में स्विचन की आवृत्ति प्राप्त करने के लिए उतार-चढ़ाव के विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
अलगाव की प्रक्रिया काफी चएएसटी, 3 ले - शुरू से 4 घंटा नमूनों की संख्या के आधार पर खत्म करने के लिए, और इस तरह पिछले विधियों कि चूहों या दवा प्रतिरोध मार्कर युक्त विशेष उपभेदों की पूर्व टीकाकरण की आवश्यकता की तुलना में अधिक कुशल है। विधि तथ्य यह है कि शुरू VSG के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हैं तथापि, द्वारा सीमित है। ऐसे अभिकर्मकों के बिना, इस तरह के VSG-सेक के रूप में एक वैकल्पिक विधि गेज करने के लिए जो VSGs एक दिया आबादी 10 में व्यक्त किया जा रहा है एक अधिक उपयुक्त विकल्प हो सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम trypanosome जीव विज्ञान पर सामान्य सलाह के लिए जॉर्ज क्रॉस स्वीकार करना चाहते हैं। यह काम भी डी एस, एम आर एम के लिए एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (डीजीई-1325261) और एक एनआईएच / NIAID (अनुदान # AI085973) FNP करने के लिए एक बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन GCE अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। हम मैं-SCEI जीन और मान्यता साइट युक्त तनाव के उपयोग के लिए Galadriel झोंपड़ी-खान धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
- Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
- Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
- Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
- Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
- Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).
- Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).
- Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).
- Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).
