Introduction
Le parasite protozoaire, Trypanosoma brucei, est un agent causal de maladies qui affectent les humains (via Trypanosoma brucei gambiense et Trypanosoma brucei rhodesiense) et les animaux (via Trypanosoma brucei brucei) dans toute l' Afrique sub-saharienne. Elle est transmise à l'hôte de mammifère par la salive du vecteur de la mouche tsé-tsé. Les deux humains et de la trypanosomiase animale africaine causent un fardeau économique sévère dans les régions endémiques, et peu de médicaments sont disponibles ou en développement pour traiter soit la maladie. mécanismes d'évasion immunitaire Comprendre est critique pour le développement de médicaments pour la trypanosomiase. La variation antigénique du dense, la variante glycoprotéine de surface (VSG) manteau qui couvre le parasite est l' un des principaux moyens par lesquels T. brucei soustrait la réponse d'anticorps de mammifère. Environ 2,000 variants du gène de VSG existent dans le génome du trypanosome, mais un seul est transcrit à un moment donné de l' une des ~ 15 expressites sion. «Switching» de la VSG exprimée peut se produire soit par copie d' un gène de VSG dans le site actif d'expression, soit par activation de la transcription d'un site d'expression précédemment silencieux (passé en revue dans 1).
Bien que beaucoup de travail a été consacrée à la compréhension de la variation antigénique de T. brucei, les facteurs qui influent sur la fréquence de commutation sont encore mal compris. Les études menées à ce jour ont été entravés par le fait que , bien que la commutation se produit stochastiquement in vitro, des fréquences de commutation sont très faibles, de l'ordre de 1 à environ 10 6 cellules 2. Cela rend difficile de mesurer si une augmentation de facteurs donnés ou diminue la fréquence de commutation, étant donné que la commutation est difficile à détecter en premier lieu. Avant 2009, les méthodes d'isolement switchers dans une population donnée étaient longues et de main-d'œuvre. Ces cellules repiquage trypanosomes par des souris immunisées contre la VSG dominante et récolte inclusun jour plus tard 3, ou de compter des centaines de cellules par immunofluorescence 4,5. Une autre stratégie repose sur la sélection pour la résistance aux médicaments pour isoler switchers 6. Parce que les trypanosomes africains cultivées in vitro sont généralement constitués d'une grande population exprimant une variante importante, et une population beaucoup plus petite de switchers exprimant des variantes alternatives, nous nous référons à la principale variante dans le présent document comme, VSG à partir dominante. Ce faisant, nous voulons en aucun cas impliquer que cette variante majeure a une plus grande remise en forme que d'autres variantes dans la population.
Nous décrivons ici une méthode qui peut mesurer de manière fiable le nombre de trypanosomes exprimant une VSG non dominante dans une population donnée dans 3 - 4 h. Cette méthode est particulièrement utile lorsque l'on veut déterminer si une manipulation génétique donnée ou un traitement médicamenteux augmente le nombre de cellules commutées dans une population. Au lieu de se débarrasser de la population de cellules exprimant le dominant, à partir VSG par des médicaments ou par des moyens immunologiques, ces cellules sont éliminées en premier les enrobant avec des billes magnétiques couplées à un anticorps dirigé contre la VSG dominante, puis de les isoler dans une colonne magnétique. La population commuté est ensuite recueillie dans le flux continu et coloré à nouveau avec un anticorps marqué anti-VSG fluorophore pour identifier les contaminants. La quantification est obtenue en ajoutant un nombre défini de billes de comptage absolu de chaque échantillon de telle sorte que le rapport des billes aux cellules peut être déterminée et utilisée pour quantifier le nombre de commutateurs dans la population 7.
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Protocol
NOTE: Tout au long de la procédure, il est nécessaire de garder les cellules sur la glace. les médias froids doivent également être utilisés tout au long.
1. Récolte de l'échantillon
- Cultivez Lister 427 trypanosomes souche de la circulation sanguine à une densité de 0,5 - 1 million / ml. Il est préférable de commencer les cultures avec un petit nombre de parasites. Isoler 50 x 10 6 cellules / échantillon pendant 10 min à 1500 x g. Assurez - vous de laisser 1 x 10 6 cellules en culture pour une utilisation ultérieure des contrôles d' anticorps positifs et négatifs.
NOTE: Ce protocole peut également être utilisé sur les trypanosomes isolés à partir du sang d'animal (voir la discussion pour plus de détails). - Pipette ou videz la majeure partie du surnageant (laisser environ 750 pi). Transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml.
- Spin cellules à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg dans une microcentrifugeuse et retirer le surnageant.
2. Étiquetage magnétique
- Resuspendre les cellules dans 150 ul du milieu de culture (HMI-9 wie sérum par exemple) + anticorps anti-VSG primaire à la dilution appropriée.
NOTE: L'anticorps anti-VSG est faite dans la maison et utilisé à une dilution de 1:50. Il est important d'utiliser un anticorps primaire anti-VSG qui ne sont pas marqués avec un fluorophore. - les cellules de vortex en utilisant un vortex adaptateur 60 à la vitesse de 6 - 8 dans une chambre froide à 4 ° C pendant 10 min. Laver avec 800 - 1000 pi HMI-9 à froid avec du sérum.
- Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et aspirer le surnageant. Laver avec 1 ml HMI-9 avec du sérum et de spin comme ci-dessus. Aspirer le surnageant. Resuspendre le culot dans 100 ul de HMI-9 avec du sérum.
- Ajouter 110 ul de cellules magnétique activé tri (MSC) microbilles. Utiliser anti-souris et anti-lapin ou des billes anti-biotine comme il convient pour l'anticorps anti-VSG primaire. Bien mélanger. les cellules de vortex dans une chambre froide à 4 ° C pendant 10 min.
- Alors que les cellules sont vortex, mis en place une colonne de séparation / échantillon magnétique activé sur un aimant de séparation. Assurez-vous d'avoir un reréceptacle (on utilise un tube de centrifugation de 15 ml) dans la colonne pour recueillir l'écoulement. Mettre en place l'appareil dans une chambre froide.
- Ajouter 2 ml de HMI-9 avec du sérum à la colonne principale. Après amorçage place un tube de centrifugation de 15 ml dans la colonne pour recueillir l'écoulement à travers chaque échantillon.
- Après 10 minutes d'incubation à l'étape 2.4, ajouter 800-1000 ul HMI-9 à froid avec du sérum. Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant pour éliminer l'anticorps non lié. Laver avec 1 ml de HMI-9 avec du sérum et répétez laissant 100 pi du surnageant.
- Flick le tube de centrifugation vigoureusement et inspecter visuellement le tube pour faire en sorte que la pastille est complètement remis en suspension. Ajouter 1 ml de HMI-9 avec du sérum et la pipette de haut en bas pour vous assurer que les cellules sont bien remises en suspension.
3. Séparation magnétique
- Faire en sorte que les colonnes sont amorcées, comme décrit ci-dessus. Appliquer les cellules à la colonne. Collecter accréditives avec des cellules exprimant la VS non-dominanteG. 1 ml de milieu + trypanosomes prend généralement de 6 - 7 min à circuler à travers la colonne.
- Laver 2x avec 1 ml de HMI-9 avec du sérum et de recueillir accréditives dans le même tube que dans l'étape 3.1.
- Diviser écoulement (3 ml) dans deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation.
REMARQUE: Ceux - ci peuvent être combinés ou plus tard moitié peuvent être utilisées pour isoler l' ARN, etc. - Retirer la colonne de l'aimant. Ajouter 3 ml de HMI-9 avec du sérum à la colonne et plonger colonne dans un tube de 15 ml de centrifugeuse pour obtenir des cellules qui expriment le départ, dominante VSG. Retirer 300 pi de matériel élue pour une analyse ultérieure. Gardez ces cellules sur la glace.
- Pour une utilisation comme un positif et un contrôle négatif, prendre environ 1 million de cellules provenant de la culture à partir de cellules de contrôle de plus en plus à 37 ° C (ceux qui ne devraient changer fréquemment) et la pipette eux dans un tube de 1,5 ml.
REMARQUE: Les cellules témoins positives seront colorées avec un anticorps marqué par un fluorophore à l'étape 4.1. Négatif cellules témoins remadans souillures dans le reste du protocole. - Des échantillons de Spin accréditives et positif échantillon témoin d'anticorps à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant.
Remarque: une autre partie aliquote de 300 ul de cellules éluées peut être utilisé comme témoin positif pour l'anti-coloration VSG.
4. Coloration pour identifier les contaminants et les Switchers
- échantillons accréditives Resuspendre et des cellules de contrôle positif dans 100 pi de HMI-9 avec du sérum + primaire, marqué par un fluorophore, un anticorps anti-VSG à la dilution appropriée.
NOTE: L'anticorps anti-VSG marqué est fait maison et utilisé à une dilution de 1: 1000. Le fluorophore marqué, anti-VSG peut être de la même source que l'anticorps non marqué dans la séparation MACS step.There devrait être de 3 ml d'échantillon d'écoulement dans deux tubes à centrifuger suivants étape 3.5. - Pour analyser l'ensemble de l'écoulement par cytométrie en flux, combiner les pastilles dans les deux tubes de microcentrifugation tout re-susen attendant les échantillons dans 100 pi de HMI-9 avec du sérum d'anticorps + anti-VSG. Bien mélanger.
- les cellules de vortex dans une chambre froide à 4 ° C pendant 10 min. Ajouter 800 - 1000 pi HMI-9 à froid avec du sérum. Des échantillons de Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant pour éliminer l'anticorps non lié.
- Laver les cellules avec 1 ml de HMI-9 avec du sérum. Des échantillons de Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant. Au cours de cette dernière rotation, centrifuger les échantillons élues de l'étape 3.4 et l'échantillon de contrôle négatif.
- Resuspendre tous accréditive et échantillons élues dans: solution (175 pl au total) 148,5 pi HMI-9 avec du sérum, 25 pi de comptage absolue perles et 1,5 pi l'iodure de propidium. La remise en suspension des échantillons de contrôle positifs et négatifs anticorps dans 175 pi de HMI 9 avec du sérum. Assurez-vous d'enregistrer le nombre de comptage absolu des perles / 25 pi pour le lot particulier utilisé.
- Exécutez tous les échantillons au moyen d'un cytomètre de flux et de recueillir des données. Les cellules mortes tacher comme PI
- Calculer les fréquences de commutation en utilisant la cytométrie de flux de données.
REMARQUE: Pour obtenir des instructions sur la façon de calculer les fréquences de commutation, s'il vous plaît se référer au fichier supplémentaire cytométrie de flux Calculations.docx et le tableau 1.
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Representative Results
La méthode décrite ici a été utilisé pour démontrer que les cassures double brin dans le site d'expression de VSG augmenté le nombre de switchers dans une population 8. Ici, nous montrons des résultats représentatifs d'une population de trypanosomes qui ont été induites de manière similaire pour générer une cassure double brin au niveau du site d'expression. Nous comparons ces trypanosomes à ceux qui ne l' ont pas été amené à générer une cassure double brin. La figure 1 montre l' écoulement représentant cytométrie parcelles à partir de cellules ONU-induites et induites recueillies dans le flux continu de la cellule activée colonne de tri magnétique. Pour cette expérience particulière de la VSG à partir dominante était VSG2. Les panneaux de gauche de la figure 1A montrent l' avant et la diffusion latérale, qui permet aux portes à tirer autour des perles de comptage absolu et les cellules qui montrent une signature avant et diffusion latérale qui est caractéristique des cellules vivantes. Notez que les portes peuventêtre établi pour inclure plus de cellules, car les cellules mortes peuvent être éliminées avec coloration PI; Cependant, la porte doit rester la même pour tous les échantillons. Les panneaux de droite de la figure 1A montrent que les cellules qui entrent dans la porte 'Live' sur les panneaux de gauche. Les cellules qui se colorent positivement pour PI (Q1 et Q2) sont des cellules mortes. Les cellules qui se colorent positivement pour la VSG dominante et négativement pour PI en Q3 sont des contaminants. Les cellules qui se colorent négativement pour les PI et le VSG dominant dans Q4 sont des cellules vivantes qui sont passés. On peut observer que le pour cent des contaminants dans Q3 est plus faible pour les cellules où une cassure double brin a été induite. Cependant, les pourcentages en Q3 ne peuvent pas être utilisées pour déduire s'il y a plus de switchers dans une population donnée. Il est seulement en comparant le rapport entre le nombre de cellules T4 au nombre de billes recueillies que l' on peut calculer les fréquences de commutation. Le tableau 1 présente les nombres obtenus à partir de la floparcelles cytométrie w et la méthode pour calculer les switchers pour cent dans ces populations. Ces calculs ont été effectués sur 3 échantillons biologiques pour obtenir les fréquences de commutation observées affichées dans la figure 1B. Le niveau de commutation stochastique in vitro est assez faible, tel que calculé ici à une moyenne de 9,53 x 10 -5, tout en induisant un résultat de break dans 1 - 6 x 10 -3 cellules qui sont passés au VSG non-dominante.
Figure 1. Isolement et quantification des populations de trypanosomes commutés. (A) par cytométrie en flux montrant des fractions de trypanosomes dans la fraction d'écoulement après la sélection des non-switchers sur une cellule activée colonne de tri magnétique. Une population de cellules avec un I-SCEI cassure double brin induite est comparée à une population de cellules sans rep induiteak. (B) Calculé fréquences de commutation pour les cellules qui ont ou ne l' ont pas été induites avec un I-SCEI coupure double-brin. Le nombre sur la parcelle représente les résultats d'un test T apparié bilatéral. Les barres d'erreur représentent SD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Fichier supplémentaire 1. Calculs cytométrie de flux. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau 1. Calcul des fréquences de commutation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
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Discussion
En ce qui concerne la technique expérimentale, le composant le plus critique du protocole est de garder tous les échantillons froids. Les trypanosomes intérioriser très rapidement anticorps lié à leur surface 9, mais ce processus dépend de la motilité, et n'a pas d' influence l'essai aussi longtemps que les cellules sont maintenues à 4 ° C. Tous les échantillons doivent toujours être sur la glace, et pipetage devraient être effectués rapidement pour minimiser l'exposition à l'environnement C de laboratoire de 25 °. Froid HMI-9 avec du sérum devrait être disponible au début de l'expérience et doit être conservé dans la glace tout au long. Isolement des trypanosomes en les exécutant sur la colonne doit être fait dans une chambre froide, car il faut 5 - 7 min pour exécuter un échantillon de 1 ml à travers la colonne. S'il y a plus d'échantillons que les unités de séparation magnétique disponibles, l'isolement magnétique peut se faire dans l'ordre, aussi longtemps que les échantillons ne sont pas séparés activement sont conservés sur la glace.
Il est également essentiel que les échantillons soient très bien af mixteter le dernier lavage après incubation avec les microbilles et avant l'isolement sur l'aimant. Ceci peut être accompli par pichenette agressive du tube de centrifugeuse ou tourbillonnement lumière. Aucune pastille ou amas de cellules doivent être visibles avant l'addition de l'échantillon à la colonne de séparation, qui peut être vérifié en regardant au niveau de la microscopie optique. Si bouquets sont présents, le niveau de contamination de l'échantillon de cellules accréditives exprimant la VSG dominante est généralement beaucoup plus élevé que souhaitable. Lors du calcul du nombre de commutateurs dans l'échantillon à la fin du protocole, il est important de tenir compte du fait que la totalité du flux traversant a été utilisé pour l'analyse cytométrique de flux, ou si la moitié a été utilisée. Si seulement la moitié a été utilisée, le nombre total de switchers calculé doit être multiplié par 2.
Lors du retrait du surnageant au cours des étapes de lavage, il est nécessaire de la pipette hors la dernière goutte, et typiquement 15 - 25 ul sontgauche entourant le culot de cellules. Cela est particulièrement important au cours des dernières étapes de la coloration et le lavage, car à ce stade pellets sont rarement vus dans les échantillons accréditives parce qu'il ya si peu de cellules activées.
Alors que la coloration finale anti VSG est typiquement réalisée avec un anticorps purifié marqué par un fluorophore anti VSG, le premier colorant anti VSG avant l'isolement magnétique peut être réalisé avec l'anticorps purifié ou du sérum. Nous avons également utilisé bioréacteur surnageant dérivé de hybridomes exprimant des anticorps anti-VSG. Quoiqu'il en soit, le matériau utilisé pour la coloration initiale doit être ajustée pour assurer une bonne séparation des cellules qui ne sont pas ou n'expriment le, à partir VSG dominante.
Il est typique pour la population de cellules dans le flux continu d'être contaminé par des cellules exprimant le VSG dominant. Bien que cette contamination devrait être minime, dans notre expérience, il est rare que la population soit complètement dépourvue de cellules exprimenting l'VSG dominant. Il est également important de noter que les cellules qui sont passés par la procédure d'isolement ne se colorent pas aussi brillamment avec l'anticorps anti-VSG que ceux qui ne l'ont pas été par le biais de la procédure. Nous émettons l'hypothèse que deux choses pourraient expliquer cette différence. La première est que la filature trypanosomes conduit à l'excrétion de VSG, et il y a beaucoup de spins impliqués dans la procédure d'isolement. Cela devrait diminuer l'intensité du signal de la tache finale anti VSG. La seconde est que la première étape du protocole implique la coloration avec un anticorps anti-VSG primaire. Si les épitopes reconnus par l'anticorps utilisé dans cette première étape sont les mêmes que ou obstruent les épitopes reconnus par les anticorps dans la tache finale, on pourrait attendre à l'intensité du signal soit plus faible que si un seul anticorps ont été utilisés. Pour cette raison, il est important de mesurer l'anticorps qui est utilisé dans l'étape finale, de telle sorte que le signal provenant d'une cellule positive est à peu près deux tachéedes ordres de grandeur supérieure à celle d'une cellule colorée négativement. De cette façon, même si l'intensité du signal provenant d'une cellule de coloration positive est diminuée dans les cellules qui ont subi la procédure d'isolement, ces cellules positives sera toujours bien séparé des cellules négatives sur le tracé de la cytométrie de flux. Si l'auto-compensation est utilisé, les échantillons de contrôle des taches simples doivent être préparés. Les anticorps que nous avons générés sont disponibles à l'achat depuis l'installation d'anticorps Cancer Center Sloan Memorial. Nous avons eu le meilleur succès avec l'aide de l'anticorps IgG monoclonal non marqué. Nous avons effectué le protocole avec des anticorps polyclonaux VSG, mais des anticorps polyclonaux peut parfois reconnaître d'autres VSG anticorps monoclonaux sont donc préférés. VSG identité peut être déterminée par séquençage d'ADNc généré à partir VSG amplification des séquences conservées dans la VSG 3'UTR et le leader épissé. Un anticorps particulier peut être testé pour la spécificité sur isolé précédemment commutécellules qui identité VSG a été déterminée comme décrit ci.
Le protocole présenté ici a un certain nombre d'avantages. Il peut être utilisé aussi bien pour isoler switchers pour une analyse ultérieure et de quantifier le nombre de switchers dans une population donnée. Il peut également être utilisé pour isoler une variante particulière de l'intérêt, tant qu'un anticorps est disponible pour cette variante. Il est également possible de réaliser ce protocole à l'aide trypanosomes isolés à partir d'animaux, à condition que les globules rouges sont éliminés en utilisant des billes anti Ter119 magnétiques revêtues selon le protocole du fabricant. On n'a pas testé la limite inférieure du nombre de trypanosomes requises, mais nous avons réalisé avec succès en utilisant le protocole 2.5 - 10000000 trypanosomes à partir de 250 ul de sang. Enfin, le protocole peut être utilisé en conjonction avec l'analyse de fluctuation pour obtenir la fréquence de commutation dans une population donnée.
La procédure d'isolement est assez fast, en 3 - 4 h de début à la fin en fonction du nombre d'échantillons, et est donc plus efficace que les méthodes antérieures qui nécessitaient une immunisation préalable des souris ou des souches spécialisées contenant des marqueurs de résistance aux médicaments. La méthode est limitée par le fait que les anticorps contre la VSG de départ sont cependant nécessaires. Sans ces réactifs, une autre méthode telle que VSG-seq pourrait être un choix plus approprié pour évaluer ce qui VSG sont exprimées dans une population donnée 10.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier George Cross pour des conseils généraux sur la biologie des trypanosomes. Ce travail a également été soutenue par une subvention GCE Fondation Bill et Melinda Gates pour DS, un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) pour MRM et une NIH / NIAID (subvention # AI085973) à FNP. Nous remercions Galadriel Masure-Miner pour l'utilisation de la souche contenant le site de gène et de reconnaissance I-SCEI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
- Horn, D.
- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
- Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
- Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
- Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
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