Introduction
De protozoa parasiet, Trypanosoma brucei, is een verwekker van ziekten die de mens beïnvloeden (via Trypanosoma brucei gambiense en Trypanosoma brucei rhodesiense) en dieren (via Trypanosoma brucei brucei) gehele Sub-Sahara Afrika. Het is aan de zoogdiergastheer overgedragen via het speeksel van de tseetseevlieg vector. Zowel mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis leiden tot een ernstige economische last in endemische gebieden, en weinig drugs zijn beschikbaar of in ontwikkeling voor de behandeling van beide ziekten. Inzicht in de mechanismen van immune fraude is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor trypanosomiasis. Antigene variatie van het dichte, variant oppervlakte glycoproteïne (VSG) jas die de parasiet bedekt, is een van de belangrijkste manieren waarop T. brucei ontwijkt de zoogdier antilichaam respons. Ongeveer 2000 varianten van de VSG-gen aanwezig in het genoom trypanosoom, maar slechts één wordt getranscribeerd op een bepaald moment uit een van ~ 15 expresSion sites. Switching van de VSG expressie kan plaatsvinden hetzij door het kopiëren van een VSG gen in de actieve expressie plaatsen of door transcriptionele activering van een eerder stille expressieplaats (besproken in 1).
Hoewel veel werk is besteed aan het begrip van antigene variatie in T. brucei, de factoren die van invloed schakelfrequentie zijn nog steeds slecht begrepen. Studies tot op heden belemmerd door het feit dat hoewel omschakelen gebeurt stochastisch in vitro schakelfrequenties zeer laag, in de orde van 1 op ongeveer 10 6 cellen 2. Dit maakt het moeilijk te meten of een bepaalde factor verhoogt of verlaagt schakelfrequentie, omdat schakelen moeilijk te detecteren in de eerste plaats. Voorafgaand aan 2009, werkwijzen voor het isoleren overstappers in een bepaalde populatie waren langdurig en arbeidsintensief. Deze omvatten passeren van trypanosomen door de muizen ingeënt tegen de dominante VSG en dan oogsten van celleneen dag later 3, en tellen honderden cellen door immunofluorescentie 4,5. Een andere strategie is gebaseerd op selectie voor drug resistentie tegen switchers 6 isoleren. Omdat Afrikaanse trypanosomen gekweekt in vitro gewoonlijk bestaan uit een grote populatie expressie één belangrijke variant, en een veel kleinere populatie overstappers expressie alternatieve varianten wordt verwezen naar de belangrijkste variant in dit document als dominante vanaf VSG. Daarbij we geenszins willen impliceren dat deze belangrijke variant een grotere geschiktheid dan andere varianten in de populatie.
Hier beschrijven we een werkwijze die betrouwbaar het aantal trypanosomen expressie een niet-dominante VSG in een bepaalde populatie te meten 3 - 4 uur. Deze werkwijze is bijzonder bruikbaar wanneer men wil nagaan of een bepaalde genetische manipulatie of medicatie verhoogt het aantal geschakelde cellen in een populatie. In plaats van bevrijden de populatie van cellen die de dominant Neem VSG door middel van drugs of immunologische middelen, worden deze cellen geëlimineerd door eerst te coaten met magnetische korrels gekoppelde antilichaam tegen de dominante VSG en isoleren ze op een magnetische kolom. De geschakelde populatie wordt vervolgens verzameld in de doorstroom en opnieuw gekleurd met een fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG verontreinigingen identificeren. Kwantificering wordt bereikt door een bepaald aantal absolute tellen van kralen toevoegen aan elk monster zodat de verhouding van kralen cellen kan worden bepaald en gebruikt om het aantal overstappers kwantificeren de bevolking 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Gedurende de procedure moet worden cellen op ijs bewaren. Koude media moeten ook overal worden gebruikt.
1. Sample Oogsten
- Lister stam groeien 427 bloedstroom trypanosomen tot een dichtheid van 0,5-1.000.000 / ml. Het beste is om culturen te starten met een klein aantal parasieten. Spin down 50 x 10 6 cellen / monster gedurende 10 min bij 1500 x g. Zorg ervoor dat u 1 x 10 6 cellen te laten in de cultuur voor later te gebruiken als positieve en negatieve antilichaam controles.
LET OP: Dit protocol kan ook gebruikt worden op trypanosomen geïsoleerd uit dierlijk bloed (zie bespreking voor details). - Pipet of giet het grootste deel van de bovenstaande vloeistof (laat ongeveer 750 ui). Overdracht van de cellen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Spin cellen bij 4 ° C gedurende 4 min bij 5200 xg in een microcentrifuge en verwijder supernatant.
2. Magnetische Labeling
- Resuspendeer cellen in 150 pi kweekmedium (HMI-9 with serum bijvoorbeeld) + primaire anti-VSG-antilichaam op de juiste verdunning.
LET OP: De anti-VSG-antilichaam is in huis en worden gebruikt bij een verdunning van 1:50. Het is belangrijk om een primair anti-VSG antilichaam dat niet is gelabeld met een fluorofoor gebruiken. - Vortex cellen met behulp van een vortex-adapter 60 op snelheid 6-8 in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Wassen met 800 - 1000 ul koud HMI-9 met serum.
- Centrifugeren op 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 xg en zuig de supernatant. Wassen met 1 ml HMI-9 met serum en draaien zoals hierboven. Zuig het supernatant. Resuspendeer pellet in 100 pl HMI-9 met serum.
- Voeg 110 ul van magnetische-geactiveerde celsortering (MSC) microkralen. Met anti-muis anti-konijn of anti-biotine kralen afhankelijk van de primaire anti-VSG antilichaam. Goed mengen. Vortex cellen in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Terwijl de cellen worden vortexen, het opzetten van een magnetische-geactiveerde kolom voor de scheiding / monster op een scheiding magneet. Zorg ervoor dat u een re hebbenceptacle (we een 15 ml centrifugebuis) onder de kolom doorstroom verzamelen. De proefopstelling in een koude kamer.
- Voeg 2 ml van HMI-9 met serum aan premier kolom. Na priming plaats een 15 ml centrifugebuis onder de kolom doorstroom van elk monster te verzamelen.
- Na 10 minuten incubatie in stap 2,4, voeg 800-1000 pl koud HMI-9 met serum. Centrifugeren op 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant om ongebonden antilichaam te verwijderen. Wassen met 1 ml HMI-9 met serum en herhaal verlaten 100 pi van het supernatant.
- Flick de centrifugebuis krachtig en visueel te inspecteren de buis om ervoor te zorgen dat de pellet volledig geresuspendeerd. Voeg 1 ml van HMI-9 met serum en pipet op en neer om ervoor te zorgen dat cellen goed worden opnieuw gesuspendeerd.
3. Magnetische scheiding
- Controleer of de kolommen worden voorbereid zoals boven beschreven. Toepassen cellen kolom. Verzamel doorstroming met cellen die de niet-dominante VSG. 1 ml medium + trypanosomen duurt meestal 6-7 min door de kolom stromen.
- Wassen met 2 x 1 ml HMI-9 met serum en laat doorstroming in dezelfde buis als in stap 3,1.
- Verdeel doorstroom (3 ml) in twee 1,5 ml microcentrifugebuizen.
Opmerking: Deze kunnen later worden gecombineerd of half kunnen worden gebruikt om RNA te isoleren, etc. - Kolom verwijderen uit magneet. Voeg 3 ml HMI-9 met serum kolom en kolom dompelen in een 15 ml centrifugebuis met cellen die het uitgangspunt, hooggelegen VSG expressie te verkrijgen. Verwijder 300 ui geëlueerde materiaal voor latere analyse. Houd deze cellen op ijs.
- Voor gebruik als een positieve en een negatieve controle, duurt ongeveer 1.000.000 cellen van het uitgangsmateriaal controlecultuur cellen groeien bij 37 ° C (die naar verwachting niet vaak wisselt) en pipet ze in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
OPMERKING: Positieve controle cellen zullen worden gekleurd met fluorofoor gemerkte antilichaam in stap 4,1. Negatieve controlecellen remain onbesmet in de rest van het protocol. - Spin doorstroom monsters en positieve controles zonder antilichaam bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant.
Opmerking: Een 300 pl aliquot van geëlueerde cellen kan worden gebruikt als een positieve controle voor anti-VSG kleuring.
4. kleuring om verontreinigingen en switchers identificeren
- Resuspendeer doorstroom monsters en de controle cellen in 100 pl HMI-9 met serum + primair-fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG op het juiste verdunning.
Opmerking: Het gemerkte anti-VSG-antilichaam is in huis en gebruikt bij een verdunning van 1: 1000. De fluorofoor gemerkt, kan anti-VSG uit dezelfde bron als het ongelabelde antilichaam in de MACS scheiding step.There moet 3 ml doorstroming monster in twee microcentrifugebuizen volgende stap 3,5. - Om alle doorstroming door flow cytometrie analyse, combineren de pellets in twee microcentrifugebuizen terwijl re-susafwachting van de monsters in 100 ui HMI-9 met serum + anti-VSG antilichaam. Goed mengen.
- Vortex cellen in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Voeg 800 - 1.000 III koud HMI-9 met serum. Spin monsters bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant om ongebonden antilichaam te verwijderen.
- Was de cellen met 1 ml HMI-9 met serum. Spin monsters bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant. Tijdens deze laatste rotatie, spin down de geëlueerde-monsters uit stap 3.4 en de negatieve controle monster.
- Resuspendeer alle doorstroming en geëlueerd monsters: 148,5 ul HMI-9 met serum, 25 ul absolute tellen van kralen en 1,5 ul propidiumjodide kleuring oplossing (175 ui totaal). Resuspendeer positieve en negatieve controle antilichaam monsters in 175 ul HMI-9 met serum. Zorg ervoor dat het aantal absolute tellen van kralen / 25 ul voor de specifieke gebruikte partij op te nemen.
- Ren alle monsters door middel van een flowcytometer en het verzamelen van gegevens. Dode cellen vlek als PI
- Bereken schakelfrequenties met behulp van flowcytometrie data.
LET OP: Voor instructies over hoe om te schakelen frequenties te berekenen, wordt verwezen naar de aanvullende bestand Flowcytometrie Calculations.docx en tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven methode werd gebruikt om aan te tonen dat dubbelstrengs breuken in de VSG expressieplaats verhoogde het aantal overstappers in een populatie 8. Hier tonen we representatieve resultaten uit een populatie van trypanosomen die op soortgelijke wijze zijn opgewekt om een dubbele breuken aan de uitdrukking website te genereren. Vergelijken we deze trypanosomen die die niet zijn geïnduceerd om een dubbelstrengs breuken gegenereerd. Figuur 1 toont representatieve doorstroomcytometrie plots van niet-geïnduceerde en geïnduceerde cellen verzameld in de doorstroom van de magnetische geactiveerde celsortering kolom. Voor deze specifieke experiment was de dominante start VSG VSG2. De linker panelen van figuur 1A tonen voorwaartse en zijwaartse verstrooiing, waardoor poorten rond de absolute telling korrels en cellen die een voorwaartse en zijwaartse verstrooiing signatuur dat kenmerkend levende cellen vertonen worden getrokken. Merk op dat de poorten kanworden getrokken om meer cellen omvatten, omdat dode cellen kunnen worden geëlimineerd met PI kleuring; echter, moet de poort gelijk voor alle monsters bewaard. De rechter panelen van figuur 1A tonen slechts die cellen die in de "live" poort aan de linker panelen vallen. Cellen die positief vlek voor PI (Q1 en Q2) zijn dode cellen. Cellen die positief voor de dominante VSG en negatief vlek PI in Q3 verontreinigingen. Cellen die negatief vlek voor zowel PI en de dominante VSG in Q4 zijn levende cellen die zijn overgestapt. Men kan zien dat het percentage van de verontreinigingen in Q3 is lager voor die cellen, waar een dubbel-breuken heeft veroorzaakt. Echter, de percentages in Q3 niet worden afgeleid of er meer overstappers in een bepaalde populatie. Alleen door het vergelijken van de verhouding van het aantal cellen in Q4 het aantal korrels die verzameld schakelfrequenties kunnen berekenen. Tabel 1 geeft de cijfers verkregen uit de flow cytometrie percelen en de werkwijze om het percentage overstappers bij deze populaties berekenen. Deze berekeningen werden uitgevoerd op biologische monsters 3 de waargenomen schakelfrequenties weergegeven in figuur 1B te verkrijgen. Het niveau van stochastische schakelen in vitro is zeer laag, als hier berekend op gemiddeld 9,53 x 10 -5, terwijl het induceren van een breuk leidt tot 1-6 x 10 -3 cellen die zijn overgeschakeld op de niet-dominante VSG.
Figuur 1. Isolatie en kwantificering van Switched Trypanosoom populaties. (A) Flowcytometrie toont fracties van trypanosomen in de doorstroomfractie volgende selectie van non-switchers op een magnetisch geactiveerde celsortering kolom. Een populatie van cellen met een geïnduceerde I-SCEI dubbelstrengs breuken wordt vergeleken met een populatie van cellen zonder een geïnduceerde break. (B) Berekend schakelfrequenties voor cellen die al dan niet zijn geïnduceerd met een I-SCEI dubbelstrengs breuk. Het nummer van de grafiek geeft de resultaten van een tweezijdige ongepaarde t-test. Error bars vertegenwoordigt SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende File 1. Flowcytometrie Berekeningen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 1. Berekening van schakelfrequenties. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wat experimentele techniek, is de meest kritische component van het protocol houden alle monsters koude. Trypanosomen zeer snel internaliseren antilichaam gebonden aan hun oppervlak 9, maar dit proces is afhankelijk motiliteit, en heeft geen invloed op de bepaling zolang de cellen bij 4 ° C gehouden. Alle monsters moeten altijd worden bewaard op ijs, en pipetteren moet snel worden gedaan om de blootstelling aan de 25 ° C lab milieu te minimaliseren. Koud HMI-9 met serum moet beschikbaar zijn bij het begin van het experiment en moeten gedurende op ijs bewaard. Isolatie van de trypanosomen door ze over de kolom moet worden gedaan in een koude kamer, het duurt 5-7 minuten op een 1 ml monster door de kolom. Als er meer dan samples magnetische scheiding aantal beschikbaar, kan magnetische isolatie worden uitgevoerd in volgorde, zolang als monsters niet actief gescheiden op ijs worden bewaard.
Ook is het van cruciaal belang dat de monsters zijn zeer goed gemengd after de laatste wassen na incubatie met de microbolletjes en voorafgaand aan isolatie op de magneet. Dit kan worden bereikt door agressieve tikken van de centrifugebuis of licht vortexen. Geen pellet of klompjes cellen moeten toegankelijk voorafgaand aan de toevoeging van het monster aan de scheidingskolom, die kan worden gecontroleerd door naar de lichtmicroscoop niveau. Wanneer klontjes aanwezig zijn, de mate van verontreiniging in het doorstroomkanaal monster van cellen die de dominante VSG gewoonlijk veel hoger is dan wenselijk. Bij de berekening van het aantal overstappers in het monster aan het einde van het protocol, is het belangrijk rekening te houden of de doorstroom werd gebruikt voor flowcytometrische analyse, of dat helft werd gebruikt. Als slechts de helft werd gebruikt, moet het totale aantal overstappers berekend worden vermenigvuldigd met 2.
Bij het verwijderen van het supernatant gedurende de wasstappen is het niet noodzakelijk af pipet laatste druppel, en typisch 15 - 25 gl zijnlinks rond de pellet van de cellen. Dit is bijzonder kritisch in het laatste stadium van kleuring en wassen, omdat op dit moment pellets zelden in het doorstroomkanaal monsters omdat er zo weinig geschakelde cellen.
Terwijl de definitieve anti-VSG vlek typisch uitgevoerd met gezuiverd, fluorofoor-gelabeld anti-antilichaam VSG, kan de eerste anti-VSG vlek vóór magnetische isolatie worden uitgevoerd met gezuiverde antilichamen of serum. We hebben ook bioreactor supernatant afkomstig van hybridomen expressie anti-VSG antilichamen. Ongeacht, moet de bij de aanvankelijke vlek materiaal worden getitreerd om een goede scheiding van cellen die al dan niet het dominante vanaf VSG express waarborgen.
Het is typisch voor de populatie van cellen in het doorstroomkanaal zijn verontreinigd met cellen die de dominante VSG. Hoewel deze verontreiniging minimaal zijn, in onze ervaring is zelden de bevolking volledig verstoken van cellen tot expressie wordening de dominante VSG. Het is ook belangrijk op te merken dat cellen die door de isolatiewerkwijze gegaan niet zo helder kleuren met anti-antilichaam zoals VSG die niet door zijn gekomen. Onze hypothese is dat twee dingen zou kunnen zijn voor dit verschil. De eerste is dat roterende trypanosomen leidt tot uitstoting van VSG, en er zijn vele spins betrokken bij de isolatiewerkwijze. Dit zou worden verwacht dat de intensiteit van het signaal af voor de laatste anti-VSG vlek. De tweede is dat de eerste stap van het protocol betreft kleuring met een primair anti-VSG antilichaam. Als de epitopen herkend door het antilichaam dat in deze eerste stap zijn hetzelfde of occluderen de epitopen herkend door het antilichaam in de laatste vlek, zou men verwachten dat de intensiteit van het signaal lager dan wanneer één antilichaam gebruikt worden. Daarom is het belangrijk om het antilichaam dat wordt gebruikt in de laatste stap, zodat het signaal van een positief gekleurde cel is ongeveer twee titreerorden van grootte hoger dan bij een negatief gekleurde cel. Zo ook wanneer de intensiteit van het signaal van een cel die positief kleuren verlaagd in cellen die de isolatie hebben ondergaan, deze positieve cellen nog goed gescheiden van de negatieve cellen op de flowcytometrie plot. Als auto-compensatie wordt gebruikt, moeten enkele controle vlek monsters worden voorbereid. Antilichamen die we hebben gegenereerd zijn beschikbaar voor aankoop van de Memorial Sloan Cancer Center monoklonale antilichaam faciliteit. We hebben de beste succes met het gebruik van niet-gemerkte monoklonale antilichaam IgG gehad. We hebben het protocol uitgevoerd met polyklonale VSG antilichamen, maar polyklonale antilichamen kan soms herkennen andere VSGs dus monoklonale antilichamen de voorkeur. VSG identiteit kan worden bepaald door sequentiebepaling VSG cDNA gegenereerd uit amplificatie van geconserveerde sequenties in het 3'UTR VSG en het gekoppelde leider. Een specifiek antilichaam kan worden getest op specificiteit van eerder geïsoleerde ingeschakeldcellen die is VSG identiteit is vastgesteld zoals hierboven beschreven.
Het protocol hier gepresenteerde heeft een aantal voordelen. Het kan zowel om switchers voor latere analyse isoleren en het aantal overstappers in een bepaalde populatie te kwantificeren. Het kan ook worden gebruikt om een bepaalde variant van belang te isoleren, zolang een antilichaam beschikbaar is voor die variant. Het is ook mogelijk dit protocol via trypanosomen die uit dieren uit te voeren, op voorwaarde dat rode bloedcellen worden verwijderd met behulp van anti-TER119 beklede magnetische parels volgens het protocol van de fabrikant. We hebben niet de ondergrens voor het aantal trypanosomen nodig getest, maar we hebben met succes het protocol met behulp van 2,5 uitgevoerd - 10 miljoen trypanosomen van 250 ul van bloed. Tenslotte kan het protocol worden gebruikt in combinatie met fluctuatie analyse om de frequentie te schakelen in een bepaalde populatie te verkrijgen.
De isolatie moet vrij fast, waarbij 3-4 uur van begin tot eind, afhankelijk van het aantal monsters, en is dus efficiënter dan eerdere methoden voorafgaande immunisatie van muizen of gespecialiseerde stammen die resistentie markers vereist. Deze methode wordt beperkt door het feit dat antilichamen tegen het uitgangsmateriaal VSG zijn echter noodzakelijk. Zonder dergelijke reagentia, kan een alternatieve werkwijze zoals VSG-seq een geschikte keuze om te bepalen welke VSGs worden uitgedrukt in een bepaalde populatie 10 zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag George Cross erkennen voor algemeen advies over trypanosome biologie. Dit werk werd ook gesteund door een Bill en Melinda Gates Foundation GCE subsidie aan DS, een NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.325.261) naar MRM en een NIH / NIAID (subsidie # AI085973) naar FNP. Wij danken Galadriel Hovel-Miner voor het gebruik van de stam die de I-SCEI gen en erkenning ter plaatse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
- Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
- Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
- Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
- Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
- Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).
- Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).
- Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).
- Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).
