Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Algılama doi: 10.3791/54715 Published: October 19, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protozoon parazit, Trypanosoma brucei, Sahra-altı Afrika boyunca (Trypanosoma brucei brucei aracılığıyla) ve hayvanlar (Trypanosoma brucei gambience ve Trypanosoma brucei rhodesiense aracılığıyla) insanları etkileyen bir hastalık etkenidir. Bu çeçe sineği vektörünün tükürük yoluyla memeli konakçıda iletilir. İnsan ve Hayvan Afrika tripanosomyası Hem endemik bölgelerde ciddi bir ekonomik yük getiren ve birkaç ilaç mevcuttur ya da iki hastalığın tedavisi için geliştirilmektedir. Bağışıklık kaçırma mekanizmalarının anlaşılması trypanosomiasis için ilaçların geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Parazit kapsayan yoğun Variant Yüzey Glikoprotein (VSG) kat antijenik varyasyon birincil aracı biri olan T. brucei, memeli antikor tepkisini kaçınır. ~ 15 Expres VSG geninin yaklaşık olarak 2.000 varyantları tripanosom genomuna vardır, ama sadece bir birinden belirli bir zamanda transkripsiyonusion siteleri. Ifade VSG 'geçiş' aktif ifadesi sitesine bir VSG genini kopyalayarak, veya (1 gözden) daha önce sessiz ifade sitenin transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla gerçekleşebilir.

Çok iş T. anlamak antijenik varyasyon ayrılmış olmasına rağmen brucei, anahtarlama frekansı etkileyen faktörler hala tam olarak anlaşılamamıştır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar anahtarlama in vitro davranışsal oluşurken, anahtarlama frekansları yaklaşık 10 6 hücre 2 içinde 1 mertebesinde, çok düşük olduğu gerçeği ile engellenmiştir. Bu anahtarlama ilk etapta tespit etmek zor olduğundan, belirli bir faktör artar veya anahtarlama frekansını azaltır olmadığını ölçmek zor hale getirir. 2009 öncesinde, belirli bir nüfusta anahtarlayıcıları izole etmek için yöntemler uzun ve emek yoğun. Bunlar arasında baskın VSG karşı aşılanmış farelerde ile tripanozomlarına pasaj ve daha sonra hücreler toplandıBir gün sonra 3 veya immünofloresan 4,5 ile hücrelerin yüzlerce sayma. Ilaç direnci anahtarlayıcıları 6 izole etmek için başka bir strateji seçimi dayanmaktadır. In vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomlar tipik bir büyük varyant ve alternatif varyantları ifade switcherlar çok daha küçük bir nüfusa ifade büyük bir nüfus oluşuyor, çünkü biz baskın, başlangıç VSG olarak bu yazıda boyunca büyük varyantı bakın. Bunu yaparken, biz hiçbir şekilde bu önemli varyant popülasyonda diğer varyantları daha fazla uygunluk olduğunu ima etmek istiyoruz.

4 saat - Burada güvenilir 3 belirli bir nüfusta bir dominant olmayan VSG ifade tripanozomlann sayısını ölçebilen bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir belirli bir genetik manipülasyon ya da ilaç tedavisi popülasyonda açık hücrelerin sayısını artırır olmadığını belirlemek istediğinde için özellikle yararlıdır. Bunun yerine do ifade hücrelerinin nüfusu riddingminant ilaç ile VSG başlayan ya da immünolojik vasıtasıyla, bu hücreler önce, bir manyetik sütun üzerinde izole hâkim VSG karşı antikora bağlanmış manyetik boncuk ile kaplanması ve ortadan kaldırılmıştır. anahtarlamalı nüfus daha sonra akış yoluyla toplanan ve kirletici tanımlamak için bir fluorofor etiketli anti-VSG antikoru ile tekrar lekeli. Niceleme hücrelere tanelerin oranı belirlenir ve nüfus 7 anahtarlama sayısını ölçmek için kullanılabilir, böylece her bir örnek için, mutlak sayaç boncuk belirli sayıda ekleyerek elde edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: süreci boyunca, o buz üzerinde hücreleri tutmak için gereklidir. Soğuk ortam ayrıca boyunca kullanılmalıdır.

1. Numune Hasat

  1. 1.000.000 / ml - 0.5 bir yoğunluğa Lister 427 suşu kan dolaşımı tripanozomlann büyütün. Bu parazit az sayıda kültürleri başlamak en iyisidir. 1.500 x g'de 10 dakika boyunca 50 x 10 6 hücre / örnek aşağı doğru döndürün. Daha sonra pozitif ve negatif antikor denetimlerini kullanın için kültüründe 1 x 10 6 hücre bırakın emin olun.
    NOT: Bu protokol ayrıca, hayvan kanı (detaylar için tartışmaya bakınız) izole tripanozomlann kullanılabilir.
  2. Pipet veya yüzer maddenin en dökün (yaklaşık 750 ul bırakın). 1.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri aktarın.
  3. bir mikrosantrifüj içinde 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de hücreler Spin ve supernatant çıkarın.

2. Manyetik Etiketleme

  1. Tekrar süspansiyon hücreleri 150 ul kültür ortamında (HMI-9 wiUygun seyreltme örneğin inci serumu) + primer anti-VSG antikoru.
    Not: Anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1:50 seyreltmede kullanılmıştır. Bir florofor ile işaretlenmiş bir birincil anti-VSG antikor kullanılması önemlidir.
  2. 10 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk bir odada 8 - hız 6 bir girdap adaptör 60 kullanılarak vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ile yıkayın.
  3. 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de spin ve süpernatant aspire. serum ile 1 ml HMI-9 ile yıkayın ve yukarıdaki gibi döndürün. süpernatant aspire. serumu HMI-9, 100 ul içinde süspanse pelet.
  4. (MSC) mikroboncuklar ayırma Manyetik aktive hücre 110 ul ekle. birincil anti-VSG antikor uygun olarak, anti-fare anti-tavşan veya anti-biyotin boncuk kullanın. İyice karıştırın. 10 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk bir odada Vorteks hücreleri.
  5. Hücreler vorteks olsa da, bir ayırma mıknatıs üzerinde bir manyetik aktive ayırma kolonu / örnek oluşturdu. Bir yeniden var emin olunsütununda ceptacle (biz bir 15 ml santrifüj tüpü kullanın) flow-through toplamak için. Soğuk bir odada aparatı ayarlayın.
  6. Başbakan sütuna serum ile HMI-9 2 ml ekleyin. akış her bir örnek toplamak için sütunu altında bir 15 ml santrifüj tüp yeri emişli sonra.
  7. Adım 2.4 10 dakika inkübasyondan sonra, 800-1000 civarında ul soğuk HMI-9 serumu ile ekleyin. 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de dönel çıkartıldı ve süpernatan bağlanmamış antikorların çıkarılması için. Serum ve tekrar süpernatant 100 ul bırakarak ile HMI-9 1 ml yıkayın.
  8. şiddetle ve görsel santrifüj tüpü Flick pelet tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olmak için tüp inceleyin. Hücreler de yeniden süspanse emin olmak için yukarı ve aşağı serum ve pipet ile HMI-9 1 ml ekleyin.

3. Manyetik Ayırma

  1. Yukarıda açıklandığı gibi sütunlar hazırlanmış olduğundan emin olun. sütun hücreler uygulanır. Hücreler baskın olmayan VS ifade ile flow-through toplayınsütun üzerinden akmaya 7 dakika - G. 1 orta ml + tripanozomlar genellikle 6 alır.
  2. Yıkama 1 ml HMI-9 serum ile 2x ve adım 3.1 olarak akış yoluyla aynı tüp içinde toplamak.
  3. Bölme akış (3 mi), iki 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine.
    Not: Bu, daha sonra bir araya getirilebilir ya da yarı vb RNA izole etmek için de kullanılabilir
  4. mıknatıstan sütun çıkarın. sütununa serum ile HMI-9 3 ml ilave edilir ve başlangıç ​​baskın VSG ifade eden hücreleri elde etmek için bir 15 ml santrifüj tüpüne sütun dalma. daha sonra analiz için akıtılan malzemenin 300 ul çıkarın. buz üzerinde bu hücreleri tutun.
  5. pozitif ve bir negatif kontrol olarak kullanılmak üzere, 37 ° C 'de büyümekte, kontrol hücrelerinin başlangıç ​​kültüründen yaklaşık 1.000.000 hücre sunar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine bunları pipet (bu sıklıkla geçiş beklenmemektedir).
    Not: pozitif kontrol hücreleri adım 4.1 fluoroforla işaretlenmiş antikor ile boyanmış olacaktır. Negatif kontrol hücreleri remaProtokolün geri kalanı boyunca lekesiz olarak.
  6. Sıkma akış örnekler ve 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de pozitif antikor kontrol örneği ve supernatant çıkarın.
    Not: elüt hücrelerinin diğer 300 ul alikosu, anti-VSG boyama için pozitif kontrol olarak kullanılabilir.

4. Boyama Bulaşanlar ve switcherlar Belirlemek İçin

  1. Süspanse akış örnekler ve 100 ul HMI-9, uygun seyreltide Serum primer, fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG antikoru ile pozitif kontrol hücreleri.
    Not: etiketli anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1 seyreltme ile kullanılır: 1000. fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG step.There adım 3.5 aşağıdaki iki mikrosantrifüj tüpleri içinde akış numune 3 mi olmalıdır MACS ayırma etiketlenmemiş antikor olarak aynı kaynaktan olabilir.
  2. yeniden sus ise iki mikrosantrifüj tüpler pelet birleştirmek, akım sitometri-through akımı ile tüm analiz etmek100 ul HMI-9 serum + anti-VSG antikoru ile örnekleri bekleyen. İyice karıştırın.
  3. 10 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ekleyin. 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg'de ve çıkarma bağlanmamış antikorların çıkarılması için.
  4. serumu HMI-9 için 1 ml hücre yıkayın. 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg'de çıkarın. Bu son dönüş sırasında, adım 3.4 ve negatif kontrol örneğinden yıkandı-örnekleri aşağı doğru döndürün.
  5. 148.5 ul HMI-9 serumu, 25 ul mutlak sayım boncuk ve 1.5 ul Propidium iyodür solüsyonu (175 ul toplam) boyama: Tüm akış ve elüt örnekleri yeniden süspanse edin. 175 ul pozitif ve negatif antikor kontrol örnekleri tekrar süspansiyon HMI-9 serumu ile. Mutlak sayım boncuk / kullanılan özel lot için 25 ul sayısını kaydetmek için emin olun.
  6. bir akış sitometresinde aracılığıyla tüm örnekleri çalıştırmak ve veri toplamak. PI olarak leke ölü hücreler - VSG +. VSG - - Seçiciler PI olarak leke 8.
  7. veri flow sitometri kullanılarak anahtarlama frekansları hesaplayın.
    NOT: anahtarlama frekansları nasıl hesaplanacağı ile ilgili talimatlar için, ek dosyasına başvurun Sitometrisi Calculations.docx ve Tablo 1'de.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada anlatılan yöntemi nüfusu 8 switcherlar sayısını artırdı VSG ifade site içinde bu çift iplikli tatili göstermek için kullanılmıştır. Burada, aynı ifade yerinde bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan olan tripanozomlann bir nüfusa temsilcisi sonuçlarını gösterir. Biz bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan edilmemiş olması olanlara bu tripanozomlann karşılaştırın. 1 akış-geçen manyetik aktive hücre sıralama kolondan toplanan un-uyarılmış ve isteyerek hücrelerden araziler sitometri temsili akışını göstermektedir. Bu özel deney için baskın başlangıç ​​VSG VSG2 oldu. Şekil 1A sol panelleri ileri göstermek ve giriş kapıları, canlı hücrelerin karakteristik bir ileri ve yan dağılım imza göstermek mutlak sayım boncuk ve hücrelerin etrafında çizilmiş sağlar yan dağılım. Not kapıları olabilir kiölü hücreler PI boyama ile elimine edilebilir, çünkü daha fazla hücre içerecek şekilde çizilebilir; Bununla birlikte, kapak, tüm numuneler için aynı tutulmalıdır. Şekil 1A sağ panelleri sol panellerde 'Canlı' kapısı giren sadece bu hücreleri göstermektedir. PI (Q1 ve Q2) için pozitif leke Hücreler ölü hücrelerdir. 3. çeyrekte PI pozitif baskın VSG ve olumsuz leke Hücreler kirletici vardır. hem PI ve Q4 baskın VSG için olumsuz leke Hücreler açtınız canlı hücrelerdir. Bir Q3 kirleticilerin yüzde çift iplikli sonu kaynaklı olmuştur bu hücreler için daha düşük olduğunu gözlemleyebiliriz. Ancak, Q3 yüzdeler belirli bir nüfusta daha fazla switcherlar olup olmadığını anlaması için kullanılamaz. Sadece tek bir anahtarlama frekansı hesaplayabilir toplanan tanelerin sayısı Q4 hücrelerin sayısının oranı ile karşılaştırmaktır. Tablo 1 flo elde numaralarını gösterirw sitometri araziler ve yöntem bu popülasyonlarda yüzde anahtarlayıcıları hesaplamak için. Bu hesaplamalar Şekil 1B görüntülenen gözlenen sviçleme frekansları elde etmek için 3 biyolojik örnekler üzerinde yapıldı. Dominant olmayan VSG açtınız 6 x 10 -3 hücrelerinde - 1 bir kırılma sonuçlarını indükleyici ederken, 9.53 x 10 -5 ortalama burada hesaplanan in vitro stokastik geçiş seviyesi oldukça düşüktür.

Şekil 1
Şekil 1. İzolasyon ve Anahtarlamalı Trypanosome Populasyonlarının miktarının belirlenmesi. (A), bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif kolonu üzerinde olmayan anahtarlama seçimi şu akış fraksiyonunda tripanozomlarına fraksiyonlarını gösteren akış sitometri bulunmaktadır. indüklenmiş bir I-SceI çift iplikli kesmeli bir hücre popülasyonu indüklenmiş bir bre olmayan hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığındaak. (B) ya da I-SCEI çift sarmallı bir mola ile uyarılan edilmemiş hücreler için anahtarlama frekanslarını hesaplanmıştır. arsa üzerinde sayı iki kuyruklu, eşsiz T testinin sonuçlarını temsil eder. Hata çubukları SD temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Company Dosya 1. Akım Sitometri Hesaplamalar. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

tablo 1
Tablo Anahtarlama Frekansları 1. hesaplanması. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deneysel tekniği ile ilgili olarak, protokolün en önemli bileşeni soğuk tüm örnekleri tutuyor. Tripanozomlarına çok hızlı yüzeyleri 9 bağlanan antikor içselleştirmeye ancak bu işlem motilite bağlıdır ve hücreler, 4 ° C 'de tutulur sürece tahlil etkilemez. Tüm numuneler daima buz üzerinde tutulmalıdır ve pipet 25 ° C laboratuar ortamında maruz kalma en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Soğuk HMI-9 serum ile deneyin başlangıcında mevcut olmalıdır ve boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. sütun üzerinden 1 ml örneği çalıştırmak için 7 dakika - bu 5 alır gibi sütun üzerinde çalıştırarak tripanozomlann izolasyonu, soğuk bir odada yapılmalıdır. Mevcut manyetik ayırma birimleri daha fazla örnek varsa aktif ayrılır olmayan örnekleri, buz üzerinde tutulur gibi manyetik izolasyon sürece, sırayla yapılabilir.

Örnekler, çok iyi karışmış af olması da önemlidirmıknatıs üzerinde mikro-ve önceki izolasyonu ile inkübasyon aşağıdaki son yıkama ter. Bu santrifüj tüpüne veya hafif vorteks agresif titreşmesinde yapılabilir. hücrelerin yok pelet veya kümeleri önce ışık mikroskobu düzeyinde bakarak kontrol edilebilir ayırma kolonuna numunenin, eklenmesi görünür olmalıdır. kümeleri varsa, baskın VSG ifade eden hücrelerin akış örnekteki kirlenme düzeyi genellikle arzu çok daha yüksektir. protokol sonunda numunede switcherlar sayısı hesaplama yaparken, tüm flow-through akım sitometri analizi için kullanılıp kullanılmadığı dikkate almak önemlidir, ya da yarım kullanılıp kullanılmadığı. sadece yarısı kullanıldı, hesaplanan anahtarlama sayısı 2 ile çarpılmalıdır.

Yıkama adımları sırasında süpernatant çıkarırken, her son damlasına kapalı pipetle için gerekli değildir ve tipik olarak 15-25 ul vardırHücrelerin pelet çevreleyen bıraktı. Orada çok az olan hücreleri açık olduğundan, bu noktada peletler nadir akış örneklerde görülmektedir, bu, boyama ve yıkama işleminin nihai safhalarında, özellikle önemlidir.

Nihai önleyici VSG leke tipik olarak saflaştırılmış, florofor-etiketli anti-VSG antikoru ile birlikte, önceden manyetik izolasyon birinci anti VSG leke saflaştırılmış antikor veya serum ile yapılabilir. Ayrıca, anti-VSG antikorları eksprese eden hibridomlar elde biyoreaktör süpernatant kullandık. Ne olursa olsun, başlangıç ​​lekesi için kullanılan malzeme yapmak veya baskın başlangıç ​​VSG eksprese etmeyen hücre iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak için titre edilmelidir.

Baskın VSG ifade eden hücreler ile kirlenmiş akış-through hücre nüfus için tipiktir. Bu kirlenme düzeyde olmalıdır iken nüfus ifade eden hücrelerin tamamen yoksun olabilmesi için, bizim deneyim o nadirbaskın VSG ing. Izolasyon prosedürü ile gitti hücreler prosedür aracılığıyla olmamıştır o kadar anti-VSG antikoru gibi parlak leke yok dikkat etmek de önemlidir. Biz iki şey bu farkın hesabını ihtimalini varsaydığımızda. İlk tripanozomlarına eğirme VSG dökülme yol açar, ve izolasyon prosedürü dahil olan birçok spin vardır. Bu son anti-VSG leke sinyalin şiddetini azaltmak için beklenir. İkinci protokol, ilk aşaması, bir birincil anti-VSG antikorla boyama içermesidir. bu birinci aşamada kullanılan, antikor tarafından tanınan epitopları ile aynıdır ya da son leke antikor tarafından tanınan epitopları tıkanması durumunda, tek bir sinyal yoğunluğu yalnızca bir antikor kullanılması durumunda daha düşük olması beklenir. nedenle pozitif boyalı hücreye sinyal kabaca iki öyle ki son aşamada kullanılan antikor, titre önemlidirBir olumsuz lekeli hücre için daha yüksek büyüklükte emir. Bu şekilde, bir pozitif şekilde lekeleme yapan hücre sinyalinin şiddeti izolasyon prosedürü geçiren hücrelerde azalmış bile, bu olumlu hücreler hala akış sitometri arsa üzerinde olumsuz hücrelerden ayrılır. otomatik dengeleme kullanılıyorsa, tek bir leke kontrol örnekleri hazırlanmalıdır. Biz yarattı Antikorlar Memorial Sloan Kanser Center monocolonal antikor tesisinden satın alınabilir. Biz etiketsiz monoklonal antikor IgG kullanarak en iyi başarı elde ettiler. Biz poliklonal VSG antikorları ile protokol gerçekleştirdiklerini, ancak poliklonal antikorlar bazen o kadar monoklonal antikorlar tercih edilmektedir diğer VSGs tanıyabilir. VSG kimliği VSG 3'UTR ve eklenmiş lider korunmuş dizilerinin amplifikasyonu elde edilen dizi VSG cDNA tarafından belirlenebilir. Belirli bir antikor, daha önce açık izole ilgili özgüllük bakımından test edilebilirSadece açıklandığı gibi VSG kimliğini hücreleri tespit edilmiştir.

Burada sunulan protokol bir takım avantajlara sahiptir. Daha sonra analiz için anahtarlayıcıları izole etmek ve belirli bir popülasyonda anahtarlama sayısını ölçmek için de kullanılabilir. Aynı zamanda, uzun bir antikor bu varyant için uygun olduğu gibi, ilgi konusu özel bir varyantını izole etmek için kullanılabilir. Kırmızı kan hücreleri, üreticinin protokolüne uygun olarak, anti-Ter119 kaplı manyetik boncuklar kullanılarak giderilmiştir koşuluyla, aynı zamanda hayvanların izole tripanozomlarına kullanarak bu protokol gerçekleştirmek mümkündür. Biz gerekli tripanozomlann sayısının alt sınırı test değil, ama biz başarıyla 2.5 kullanarak protokol gerçekleştirdiklerini - kan 250 ul gelen 10 milyon tripanozomlann. Son olarak, iletişim kuralı, belirli bir popülasyonda anahtarlama frekansı elde etmek için dalgalanma analizi ile bağlantılı olarak kullanılabilir.

izolasyon prosedürü oldukça fAST, 3 alarak - baştan 4 saat numune sayısına bağlı olarak tamamlamak ve böylece ilaç direnci markerleri içeren fareler veya özel soylarının önceden bağışıklığın gerek önceki yöntemlere göre daha verimli olduğu için. yöntem, başlangıç ​​VSG karşı oluşan antikorlar, ancak gerekli olması ile sınırlıdır. Bu tür reaktif olmadan, böyle VSG-seq olarak alternatif bir yöntem VSGs belirli bir nüfus 10 olarak ifade edildiği ölçmek için daha uygun bir seçim olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz tripanozom biyoloji genel tavsiye için George Haçı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma aynı zamanda DS, MRM bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (DGE-1.325.261) ve FNP bir NIH / NIAID (hibe # AI085973) Bir Bill ve Melinda Gates Vakfı GCE hibe ile desteklenmiştir. Biz-SCEI geni ve tanıma bölgesi içeren gerginlik kullanımı için Galadriel Hovel-Miner teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
unlabeled anti-VSG antibody n/a n/a VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody n/a n/a VSG antibody is made in house
HMI-9 media n/a n/a HMI-9 is made in house
Propidium Iodide BD Pharmingen 556463
CountBright absolute counting beads Thermofisher Scientific C36950
LD columns Miltenyi Biotech 130-042-901
MACS magnet Miltenyi Biotech 130-042-303
MACS magnetic separator Miltenyi Biotech 130-042-302
vortex adapter-60 ThermoFisher scientific AM10014
flow cytometer Coulter n/a
flow cytometer analysis software FloJo n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195, (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92, (Pt 2), 355-367 (1986).
  3. Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80, (1), 65-75 (1996).
  4. Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99, (Pt 1), 67-75 (1989).
  5. Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82, (1), 63-80 (1981).
  6. Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84, (2), 189-201 (1997).
  7. Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6, (7), e161 (2008).
  8. Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459, (7244), 278-281 (2009).
  9. Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131, (3), 505-515 (2007).
  10. Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347, (6229), 1470-1473 (2015).
Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulz, D., Mugnier, M. R., Boothroyd, C. E., Papavasiliou, F. N. Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54715, doi:10.3791/54715 (2016).More

Schulz, D., Mugnier, M. R., Boothroyd, C. E., Papavasiliou, F. N. Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54715, doi:10.3791/54715 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter