Abstract
Nel test biologici transattivazione in vitro hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di monitoraggio della qualità delle acque, ma la loro adozione e l'applicazione diffusa è stata ostacolata in parte a causa della mancanza di metodi e disponibilità di robusta, tecnologia user-friendly standardizzati. In questo studio, disponibili in commercio, linee cellulari di divisione-arrestati sono stati impiegati per lo screening quantitativo per l'attività endocrina di sostanze chimiche presenti nei campioni di acqua di interesse per i professionisti di qualità ambientale. Un unico, protocollo standardizzato che comprendeva garanzia della qualità / controllo della qualità (QA / QC) controlli è stato sviluppato per l'attività degli estrogeni e glucocorticoidi recettore (ER e GR, rispettivamente) con un saggio basato su cellule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). I campioni di trattamento degli effluenti acque reflue urbane e delle acque di superficie dai sistemi di acqua dolce in California (USA), sono stati estratti con estrazione in fase solida e analizzati per l'attività endocrina utilizzando il proto standardizzatocol. Background e dose-risposta per le sostanze chimiche di riferimento specifici per endpoint soddisfatte le linee guida QA / QC ritenute necessarie per la misurazione affidabile. La risposta di screening test biologico per i campioni d'acqua di superficie non era in gran parte rilevabile. Al contrario, i campioni effluenti degli impianti di trattamento secondario hanno avuto la più alta attività misurabile, con concentrazioni equivalenti stimata saggi biologici (BEQ) fino a 392 ng desametasone / L per GR e 17 ng 17β-estradiolo / L per ER. La risposta saggio biologico per un campione effluente terziaria era inferiore a quello misurato per effluenti secondari, che indica un residuo inferiore di sostanze chimiche attive a livello endocrino dopo il trattamento avanzato. Questo protocollo ha dimostrato che nei biotest transattivazione vitro che utilizzano disponibili in commercio, Divisione cellulare-arrestato "kit", può essere adattato per lo screening per l'attività endocrina in acqua.
Introduction
monitoraggio della qualità dell'acqua corrente si basa sulla capacità di misurare con precisione e con precisione la presenza di contaminanti chimici come proxy per l'esposizione per la fauna selvatica e gli esseri umani. Tuttavia, questo monitoraggio chimico-by-chimiche e paradigma di valutazione non può tenere il passo con la continua evoluzione dell'universo chimico che abbiamo di fronte. Come impariamo di più sul destino e gli effetti delle sostanze chimiche di sintesi e naturali, continuiamo a cercare strumenti di misurazione che si rivolgono attesi impatti biologici, e che allo stesso tempo sono immuni da cambiamenti nella produzione di prodotti chimici, l'utilizzo e l'ingresso ambientale. Tali strumenti sono particolarmente rilevanti per la comprensione se sconosciute o nuove sostanze chimiche e prodotti di trasformazione, meritano la nostra attenzione. Inoltre, miscele complesse di sostanze chimiche presenti nell'acqua sono scarsamente affrontate da monitoraggio chimico individuale. Così, ci troviamo di fronte alla sfida di modernizzazione degli strumenti di monitoraggio esistente per affrontare meglio questi problemi nelle acque superficiali that ricevere scarico degli effluenti acque reflue trattate e deflusso / acque piovane urbane.
Negli ultimi anni, le tecniche bioanalitici hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di screening per la valutazione della qualità delle acque. In particolare, biotest in'vitro che rispondono alle sostanze chimiche che agiscono tramite noto, i modi d'azione specifici 1,2 sono di grande interesse per la comunità monitoraggio ambientale 3. Numerose indagini hanno impiegato in test biologici in vitro per quantificare l'attività endocrina di bere, di superficie e acque di scarico 4 -6. Inoltre, una serie di saggi biologici bersaglio eventi scatenanti molecolari (ad esempio, il recettore di attivazione) che potenzialmente possono essere associati ad effetti deleteri via via negativo esito analisi 7,8.
L'evoluzione della bioscreening per la valutazione della qualità delle acque è stato relativamente rapido, con centinaia di diverso in endpoint saggi biologici in vitro sono state esaminate per la loroutility 9,10. Attualmente, solo una manciata di test biologici hanno dimostrato di ottenere una buona precisione di misura (nei laboratori), dimostrando la capacità di differenziare tra qualità dell'acqua 5,6. Per effluenti acque reflue trattate, in particolare, la presenza di estrogeni e steroidi glucocorticoidi è stata valutata con successo nei test in vitro di transattivazione 11,12. test biologici Tuttavia, la maggior parte degli studi fino ad oggi hanno dipendenti la cui cella linee sono di proprietà (e quindi non largamente disponibile), necessitano di cure continue e di manipolazione, o entrambi. Di conseguenza, la capacità di standardizzare i protocolli, eseguire interlaboratorio esercizi di calibrazione, e in ultima analisi, di trasferire questa tecnologia di screening per le risorse idriche della comunità rimane ostacolato.
Almeno un fornitore di test biologici in vitro controllati attraverso il programma degli Stati Uniti ToxCast è disponibile in commercio in 13 facili da usare "gelo e disgelo4; formati. Queste cellule "kit" di divisione-arrestati hanno dimostrato di essere robusto in misurando l'attività di sostanze chimiche estratte dall'acqua che rappresentano diversi livelli di trattamento 14. Sebbene i protocolli vendor sono disponibili per schermare la bioattività di singoli prodotti chimici o miscele, alcuni di essi richiedono la modifica prima che possano essere applicati a campioni di acqua. Trattata acque reflue effluenti 15, deflusso delle acque piovane 16, ricevendo le acque 17,18 e, più recentemente riciclato 19,20 acqua sono i principali esempi di mezzi acquosi che sono di interesse per la comunità della qualità delle acque.
Questo studio presenta un unico protocollo standardizzato per misurare l'attività endocrina in campioni di acqua utilizzando disponibili in commercio, divisione arrestato in saggi biologici transattivazione vitro. Abbiamo dimostrato la robustezza del protocollo attraverso una valutazione globale di sfondo, responsività dose e la ripetibilità di risposta per twO endpoint di particolare interesse e di estrogeni glucocorticoidi recettore transattivazione (ER e GR, rispettivamente). Il protocollo è stato applicato a campioni dello schermo di effluenti acque reflue trattate e delle acque di superficie dai sistemi d'acqua dolce in California.
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Protocol
1. Raccogliere e Sample Water Process (Modificata da Escher et al. 9)
- Riempire un 1 L bottiglia di vetro ambra pulita contenente 1 g di sodio azide e acido ascorbico 50 mg verso l'alto con il campione di interesse. Conservare il campione a 4 ° C e di processo all'interno di 72 ore.
NOTA: Il sodio azide è altamente tossico e deve essere maneggiato con cautela. Utilizzare equipaggiamento protettivo (per occhi / viso, guanti, abbigliamento) e pesare in un corretto funzionamento dei fumi-cappuccio. Non utilizzare una spatola di metallo per la pesatura. - Passare il campione attraverso un filtro in fibra di vetro 1,6 mM e poi attraverso una cartuccia precondizionato Estrazione in fase solida (SPE) ad una portata di 5-10 ml / min. Regolare la pressione della pompa a vuoto per controllare la portata.
- Vacuum asciugare la cartuccia per 15 min.
- Eluire la cartuccia con 10 ml di metanolo, seguiti da 10 ml di acetone: esano (1: 1, v / v).
- Concentrato eluato a ~ 1 ml sotto una leggera corrente di azoto ad alta purezza. Solventescambio aggiungendo 500 ml di dimetilsolfossido (DMSO) ed evaporando l'estratto fino a 500 microlitri.
- Trasferire l'estratto di un campionatore automatico fiala di vetro ambra. Conservare a -20 ° C.
2. Preparare diluizioni del test specifico chimica di riferimento e estrarre l'acqua
- Preparare diluizioni 9 per la curva di calibrazione.
- Fare una soluzione madre della specifica sostanza chimica di riferimento del test in 100% DMSO. La concentrazione finale deve essere 2 mM 17β-estradiolo per il dosaggio ER, e 100 pM desametasone per il dosaggio GR. Conservare le soluzioni madre a -20 ° C.
- Aggiungere 15 ml di brodo chimico di riferimento appropriato per 285 ml di terreno di coltura in una provetta sterile (tubo # 1). Mescolare il campione pipettando su e giù.
- Aggiungere 200 ml di una soluzione di 5% DMSO in terreno di coltura in 8 provette (tubi # 2-9).
- Trasferire un'aliquota di 100 microlitri dal tubo # 1 a tubo # 2 con vascae # 9 per eseguire una serie di diluizioni di 3 volte. Ogni campione diluito deve essere accuratamente miscelato con pipetta prima di prendere una aliquota e aggiungendolo al tubo successivo.
- Preparare un campione di controllo di solvente miscelando 10 ml di DMSO in 190 ml di terreno di coltura.
- Preparare quattro diluizioni per ogni estratto di acqua.
- Nel primo tubo, aggiungere 5 ml di estratto d'acqua in 95 ml di terreno di coltura e mescolare accuratamente. Aggiungere 50 ml di 5% DMSO in terreno di coltura in altri tre tubi.
- Eseguire una diluizione 2 volte trasferendo 50 ml di soluzione da una provetta all'altra.
3. Preparare la sospensione cellulare di condurre l'FRET Bioassay
- Preparare il supporto specifico test in base alle istruzioni del produttore. terreno di coltura deve essere conservato a 4 ° C e riscaldato a 37 ° C in un bagno d'acqua prima dell'uso.
- Prendere una fiala di cellule divisione arrestato ER o GR fuori della libera criogenicozer e scongelare le cellule rapidamente ponendo il flacone a 37 ° C bagnomaria per 2 minuti con agitazione. Decontaminare la fiala con il 70% di etanolo e collocarlo in una cappa di sicurezza biologica di Classe II.
- Aprire il flacone usando tecniche asettiche e trasferire le cellule in 10 ml di terreno di coltura.
- Centrifugare a 200 g per 5 min.
- Aspirare il supernatante utilizzando una pipetta di vetro sterile e risospendere il pellet cellulare in 6 ml di terreno di coltura.
- Mescolare 5 ml di sospensione cellulare con 5 ml di una soluzione di colorazione vitale e aggiungere una aliquota in una camera di conteggio.
- Contare il numero di cellule vive usando un microscopio ottico o un contatore automatico di cellule e stimare la densità di cellule vive nella sospensione cellulare. Diluire se necessario, per ottenere una densità finale di 550.000 cellule vive per ml di terreno di coltura.
4. Cellule piatto in un pozzo-96 Black Plate parete Clear-bottom e Aggiungere diluito estrarre l'acqua
- Creare un piattolayout che include un test della curva a 9 punti taratura specifica, i campioni di QA / QC e molteplici diluizioni per ogni estratto di acqua. Un esempio di un layout di piastra a 96 pozzetti è mostrato in Figura 1.
- Aggiungere 90 ml di terreno di coltura per i pozzetti di controllo privi di cellule replicate.
- Versare la sospensione cellulare in un serbatoio pipettaggio sterile e aggiungere 90 ml di sospensione cellulare agli altri pozzetti usando una pipetta multicanale.
- Aggiungere 10 ml di campioni diluiti preparati durante la fase 2 nei rispettivi pozzetti. La concentrazione finale di DMSO per pozzetto deve essere di 0,5% al massimo.
- Coprire la piastra con un coperchio e metterlo in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C per 16 ore.
Figura 1:. Esempio di layout delle piastre a 96 pozzetti La piastra multi-pozzo è progettato per includere una curva di taratura specifica dosaggio, 3 tipidi controlli QA / QC (media only, cellule in terreno pulito e cellule in DMSO a spillo di media) e 4 diluizioni per ogni estratto di acqua. Ogni controllo e diluizione di estratto di acqua viene analizzata nei pozzi triplice copia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
5. Preparare la Loading Solution e Aggiungere ad ogni pozzetto
- Dopo l'incubazione, lasciare la piastra per equilibrare a RT. Per questo saggio biologico FRET, passi 5.2 attraverso 5.6 dovrebbe essere condotta in assenza di luce diretta.
- Preparare una soluzione 6x carico secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 20 ml di soluzione 6x carico a ciascun pozzetto.
- Aggiungere 10 ml di reagente di vitalità cellulare in ciascun pozzetto di valutare la citotossicità dell'estratto diluito con acqua.
- Sigillare la piastra con pellicola adesiva in alluminio.
- Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 2 ore.
6. citotossicità Misurare e endocrino attività di risposta
- Impostare il lettore di micropiastre con capacità di fondo di lettura seguito le istruzioni del produttore.
- Per la transattivazione saggio biologico FRET, misurare la fluorescenza nel blu (409/460 nm, di eccitazione (Ex) / emissione (Em) di lunghezza d'onda) e verde (409 Es / 530 Em nm) canali.
- Per il test di citotossicità, misurare la fluorescenza a 560 Ex / 590 Em nm.
7. Valutare QA / QC controlli per determinare la qualità dei dati
- Confrontare la fluorescenza grezza media del cell-free (media only) i controlli e le cellule soli (cellule nel terreno di coltura pulita). La fluorescenza di fondo media-solo dovrebbe essere inferiore di almeno il 25% rispetto alla risposta del controllo cellule soli.
- Elaborare i dati grezzi FRET. Per entrambi i 'blu' e set di dati "verdi", sottrarre la fluorescenza media dei pozzetti di controllo privi di cellule da ogni cella contenente bene. calcolare ilblu / verde il rapporto per ogni bene sperimentale.
- Confronto blu Rapporto / verde delle cellule soli e le cellule con controlli DMSO. valori di fluorescenza di questi controlli devono essere entro il 15% deviazione standard relativa (RSD).
- Tracciare la curva di calibrazione specifica saggio come blu rapporto / verde contro la concentrazione del campione espressa come una massa molecolare di registro (log M). Calcolare la pendenza, R 2 e log EC 50 (50% Effect Concentration). Parametri di taratura devono essere all'interno del range previsto elencati nella tabella 1.
- Calcolare la RSD per tutti i pozzetti in triplicato. La variabilità tra le repliche deve essere inferiore al 20%.
- Per i dati di citotossicità (560 Ex / 590 Em nm), sottrarre la media di controllo cell-free (cioè sfondo media) da tutti i pozzetti di cellule contenenti.
- Calcolare la fluorescenza di fondo media-sottratto per ogni campione. Tracciare i dati di fluorescenza risultante come percentuale del controllo DMSO. diluizioni campione non deveesporre mortalità cellulare più del 20% rispetto alle cellule sola e DMSO controlli.
8. Analisi dei dati
- Calcolare il limite del test di rilevamento (LOD) come la risposta minima di taratura più due deviazioni standard della media di quella risposta.
- Per i campioni che mostrano una risposta alla dose, ricavare il 50 CE dell'estratto dell'acqua utilizzando la pendenza di una regressione lineare della curva di calibrazione tra 10 e 50% Concentrazioni di effetto della sostanza chimica di riferimento.
- Calcolare la concentrazione Bioanalitica Equivalente (BEQ) mediante la formula: BEQ = EC 50 di chimica di riferimento / CE 50 del campione di acqua.
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Representative Results
Nel presente studio, 4x 24 hr campioni compositi di trattamento degli effluenti acque reflue urbane, 6 campioni prelevati di acque superficiali provenienti da sistemi di acqua dolce nel sud della California e un campo vuoto costituito da acqua ultrapura sono stati selezionati per illustrare questo protocollo. 3 dei campioni 4 effluenti provenivano da impianti convenzionali di trattamento dei fanghi attivati acque reflue ( "effluente secondario"), e il quarto da una pianta avanzata depurazione con filtrazione a sabbia / carbonio aggiunto post trattamento biologico ( "effluente terziaria"). campioni di acqua di superficie sono stati raccolti da spartiacque che rappresentano uso del suolo diverso (aperto, agricolo e urbano).
Le diluizioni di estratti di acqua non hanno mostrato citotossicità evidente con mortalità cellulare meno del 20% osservata rispetto ai controlli DMSO (Tabella 1). -Free Cell (solo media) di fondo era basso, e la cONFRONTO tra le cellule soli e le cellule con risposte DMSO indicato che il solvente ha avuto alcun impatto misurabile sulle misure di fluorescenza. I parametri del test specifici curve di calibrazione, tra cui pendenza e log CE 50, sono stati nel range di valori storici accettabili (Tabella 1) dimostrano una buona riproducibilità delle curve di calibrazione nel corso del tempo. Un esempio di curva di taratura accettabile per il saggio ER è mostrato in Figura 2. La selezione di 17β-estradiolo e desametasone come prodotti chimici di riferimento si è basata sulla forza di risposta dosaggio, possibilità di verificarsi nelle acque reflue trattate e uso storico da altri ricercatori 20- 22. La variabilità nella risposta tra campioni in triplo era inferiore al 20% RSD. Così, tutti i dati sono stati considerati di qualità accettabile, e sono stati successivamente utilizzati per stimare la ER e GR bioattività (espressa come BEQ in ng / L) in campioni di acqua di acque reflue e di superficie.
(Figura 3). Tuttavia, gli estratti delle acque superficiali non hanno mostrato forte ER o attività GR. Nonostante un REF 10, le risposte fluorescenti erano spesso vicino o al di sotto del LOD. L'assenza di risposte saggi biologici per il campo vuoto ha confermato che le rilevazioni sopra indicati LOD non erano il risultato di artefatti di campionamento o di laboratorio procedurale.
Attività ER e GR sono stati rilevati in 7 e 4 dei campioni di acqua rappresentativi 10, rispettivamente (Tabella 2), con il massimo di BEQ di 17 ng E2 / L e 392 ng Dex / L trovato negli effluenti secondari. L'attività GR nel campione di effluente terziaria era al di sotto del LOD saggio biologico. Allo stesso modo, la maggior parte dei campioni di acque superficiali hanno mostrato alcuna attività GR sopra LOD e livelli molto più bassi di attività ER di effluenti secondari.
Figura 2:. Esempio di curva di calibrazione per ER Assay La curva dose-risposta, tracciata come rapporto di fluorescenza media (± SEM), è sigmoidale e utilizzato per determinare i valori di EC 10 e EC 50. Questa porzione della curva è montata utilizzando la regressione lineare e utilizzata per ottenere un saggio biologico concentrazione equivalente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3:. Media Blu / Rapporto verde fluorescenza (± SEM) di campioni d'acqua tramato contro theRrelative Enrichment Factor biodosaggio concentrazioni equivalenti (BEQ) sono calcolati per i campioni la cui serie di diluizioni mostrare una concentrazione-dipendente risposta con un minimo di due punti al di sopra del limite di rilevazione (LOD). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Estrogen Receptor (ER) Assay | Glucocorticoidi Receptor (GR) Assay | |||
| I risultati dello studio | Criteri di accettazione | I risultati dello studio Criteri di accettazione | ||
| parametri di taratura | ||||
| Significano log EC50 (M) | -9.6 | -10.1 A -9.1 | -8.5 | -9.0 A -8.0 |
| media pendenza | 1.1 | 0,9 al 1.5 | 2.0 | 1,8-2,4 |
| R2 | 0.99 | > 0.95 | 0.99 | > 0.95 |
| Controlli QA / QC | ||||
| sfondo media | sì | solo i media <cellulare + supporto | sì | solo i media <cellulare + supporto |
| Citotossicità (% di mortalità) | 0% | <20% di mortalità | 0 a 5% | <20% di mortalità |
| precisione del campione (% RSD) </ Td> | 2 a 18% | <20% | 4 a 13% | <20% |
Tabella 1: Sintesi dei QA / QC risultati da Bioanalitica Proiezione di acque reflue trattate acque reflue e di superficie campioni di acqua.
| ID campione e descrizione | ER-BEQ (ng E2 / L) | GR-BEQ (ng Dex / L) |
| A - effluente finale da impianto completo di trattamento secondario | 6.4 | 248 |
| B - dell'effluente finale da impianto completo di trattamento secondario | 13 | 392 |
| C - dell'effluente finale da impianto completo di trattamento secondario | 17 | 236 |
| D - dell'effluente finale da trattamento terziario pLant | 2.3 | <22 |
| E - acque di superficie da zona agricola | <0,5 | 30 |
| F - acque di superficie da zona agricola | <0,5 | <22 |
| G - acque di superficie dall'area urbana | 4 | <22 |
| H - acque di superficie dall'area urbana | 0.9 | <22 |
| I - acque di superficie da campo aperto | 0.8 | <22 |
| J - acque di superficie da campo aperto | <0,5 | <22 |
| K - campo vuoto (acqua ultrapura) | <0,5 | <22 |
Tabella 2: biodosaggio concentrazioni equivalenti per Estrogen Receptor (ER-BEQ) e glucocorticoidi Receptor (GR-BEQ) ac. tività tre tipi di campioni raccolti in California (USA) sono analizzati: acque di scarico degli effluenti comunale (AD), acque di superficie (EJ), e il campo vuoto (K).
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Discussion
La potenza ben documentata di estrogeni ambientali, come 17β-estradiolo (E2), lo screening mandati di queste sostanze chimiche in ng / L concentrazioni 23,24. In questo studio, la risposta ER per gli effluenti di acque reflue (gamma BEQ: 2,3-17 ng E2 / L) era un po 'superiore a quello riportato per effluente secondario da WWTPs australiani 20, mentre i BEQ per le acque superficiali (<0,5 a 4 ng E2 / L ) erano nel range riportato per superficie e delle acque piovane altrove (<1 a 11 ng E2 / L) 16. Nonostante i bassi livelli di attività ER misurati nei campioni di acque superficiali, questo test rappresenta un endpoint di screening ai fini della valutazione della qualità delle acque. Estrogeni come il bisfenolo A e alchilfenoli tensioattivi sono spesso rilevati in ambiente acquatico, ma possono essere difficili da quantificare con chimica analitica convenzionale. saggi ER-cellulari possono anche rivelarsi utile per lo screening di pesticidi attualmente e di nuova immatricolazione, come mostrato da Kojima et al25.
L'attività GR superato dell'attività ER da un ordine di grandezza in tutti e 4 i campioni effluenti analizzati in questo studio (Tabella 2). Questa tendenza è coerente con gli studi precedenti sull'acqua di scarico effluenti 14, e l'intervallo per GR-BEQ qui riportato è leggermente superiore ma paragonabile a quello riportato per altri effluenti secondari utilizzando lo stesso saggio biologico 12 in vitro. Utilizzando un diverso test su cellule, l'intervallo per GR-BEQ per effluenti da impianti di trattamento delle acque reflue in Giappone era più bassa (<3-78 ng Dex / L) rispetto a quelli riportati per effluente secondario nel presente studio 22. Con l'eccezione del campione di acqua singola superficie che ha registrato una risposta massima GR 30 ng Dex / L (Tabella 2, campione E), l'attività GR nelle restanti campioni di acqua di superficie era coerente con l'attività bassa riportata per superficie Dutch acque 21 . Tuttavia, l'im ambientalepatto per GR chimici attivi è meno caratterizzata rispetto a ER sostanze chimiche attive 26, rendendo la valutazione del potenziale di maggiori effetti di ordine una sfida.
Come per l'analisi chimica convenzionale, aderenza ai protocolli scritti e convalida delle misure con un QA performance-based / approccio QC massimizza la qualità dei dati e la robustezza. Anche se la convalida di test biologici cellulari adatti per la valutazione della qualità delle acque continuerà ad evolversi e migliorare, la misurazione dei parametri di QA / QC prima delineati nel Mehinto et al. 14 e applicate a questo studio ha dimostrato che i nostri risultati sono ampiamente sotto i valori indicativi prespecificati (Tabella 1 ). I parametri della curva di calibrazione per questi saggi biologici rispecchiano quelli utilizzati per la calibrazione di altri protocolli analitici (es, GC-MS), con l'aggiunta di criteri che valutano la vitalità delle cellule (ad esempio, citotossicità) rappresenta la differenza principale. un'altra operativadifferenza reso possibile utilizzando cellule in un formato ad alta produttività è l'inclusione di molteplici diluizioni del campione che illustrano la concentrazione risposta dipendente previsto quando bioattività viene misurata (Figura. 2). Nel rivedere le misure dei campioni, al pronto soccorso più bassa e le risposte GR per l'effluente terziario (campione D) rispetto ai tre campioni effluente secondario (AC) fornisce ulteriori prove della relativa precisione dei nostri risultati dello screening saggio biologico nella tabella 2. Incorporazione di controllo o campioni di riferimento che rappresentano la matrice di interesse, in questo caso l'acqua, potrebbero migliorare ulteriormente la possibilità di confrontare i risultati test biologici all'interno e soprattutto attraverso enti di misura.
Le risposte delle linee cellulari ER e transattivazione GR utilizzati in questo studio sono stati espressi relativi all'attività delle forti agonisti E2 e desametasone, rispettivamente. Ciò consente una stima quantitativa di bioattività espresso unsa Bioassay concentrazione equivalente (BEQ). Ciò consente inoltre per le indagini di sostanze chimiche che contribuiscono alla risposta saggio biologico, cioè un confronto diretto di BEQ con concentrazioni di agonisti singoli determinati via chimica analitica convenzionale. Questo concetto sottolinea il valore aggiunto bioscreening nel dirigere indagine diagnostica di agenti causali, noto anche come l'analisi degli effetti-diretti.
Poiché SPE viene solitamente usata per isolare una vasta gamma di farmaci e altri "contaminanti" emergenti dall'acqua, abbiamo impiegato un protocollo precedentemente pubblicato 9, 20 che ha caratterizzato un sorbente progettato per catturare sostanze chimiche, sia idrofili e idrofobi in acqua. Anche se assumiamo cattura quantitativa di tutti i composti organici bioattivi utilizzando questa tecnica, è necessario un lavoro supplementare per standardizzare pienamente e convalidare le prestazioni di tali metodi di estrazione. Il tipo di dosaggio cellule impiegato in questo studio può presentareun'altra limitazione. Questi test misurano le interazioni tra contaminanti e recettori nucleari e non tengono conto di altre interazioni possibili, come il recettore chimico-membrana. Quindi, è possibile che le risposte di screening misurati qui sono stati sottovalutati. Come l'estrazione del campione, non ci sono metodi standardizzati per l'analisi dei dati di analisi delle cellule e approcci diversi possono produrre risultati diversi. La regressione lineare utilizzato in questo studio per modellare la risposta per la metà inferiore della curva di calibrazione può non essere adatto a tutti i dosaggi cellulari, in particolare se la risposta modellato si estende al di là della gamma relativamente stretta specificato nel presente studio. Ulteriori indagini sulle questioni di cui sopra è necessaria per comprendere fino a che punto tali strumenti possono essere applicati come uno strumento di monitoraggio robusto.
Mentre gran parte del terreno è essere licenziati per ER e GR come schermi per i prodotti chimici attive a livello endocrino, i ricercatori stanno ampliando il campo di applicazionestrumenti bioanalitici ad altre modalità di rilevante di azioni, ad esempio, androgenicity, genotossicità, neurotossicità e immunotossicità 9,27. Una cassetta degli attrezzi più completa migliorerà la capacità di screening per le sostanze chimiche bioattive, tra cui prodotti di trasformazione di noti e / o sostanze chimiche sconosciute che possono verificarsi 28, ora e in futuro, in vari ambienti acquatici 19.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
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