Abstract
In - vitro - Trans Biotests haben Versprechen als Wasserqualität Monitoring - Tools gezeigt, aber ihre Annahme und weit verbreitete Anwendung ist zum Teil auf einen Mangel an standardisierten Methoden und die Verfügbarkeit von robusten, benutzerfreundliche Technologie aufgrund behindert. In dieser Studie wurden im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelllinien wurden quantitativ verwendet für endokrine Aktivität zu screenen von Chemikalien, die in Wasserproben von Interesse für die Umweltqualität Profis. Ein einziges, standardisiertes Protokoll, das umfassende Qualitätssicherung / Qualitätskontrolle (QA / QC) Kontrollen einbezogen wurde für Östrogen- und Glucocorticoid-Rezeptor-Aktivität entwickelt (ER und GR, jeweils) unter Verwendung eines zellbasierten Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) -Test. Die Proben der behandelten kommunalen Abwasser Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien (USA), wurden unter Verwendung von Festphasenextraktion und analysiert für endokrine Aktivität extrahiert, um die standardisierten Proto mitcol. Hintergrund und Dosis-Wirkungs-für Endpunkt spezifische Referenz Chemikalien erfüllt QA / QC-Richtlinien für notwendig erachtet für eine zuverlässige Messung. Der Bioassay-Screening-Antwort für die Oberflächenwasserproben war weitgehend nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu hatte Abwasserproben aus sekundären Behandlungsanlagen die höchste messbare Aktivität, mit geschätzten Bioassay äquivalenten Konzentrationen (BEQs) bis zu 392 ng Dexamethason / L für GR und 17 ng 17β-Estradiol / L für ER. Der Bioassay Antwort für eine tertiäre Abwasserprobe war niedriger als die für sekundäre Abwässer gemessen, was auf eine geringere Rest von endokrin wirksamen Chemikalien nach vorheriger Behandlung. Dieses Protokoll hat gezeigt , dass in vitro - Trans Biotests , die im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelle "Kits" nutzen wollen , können für endokrine Aktivität in Wasser zu screenen angepasst werden.
Introduction
Aktuelle Überwachung der Wasserqualität auf der Fähigkeit sagt, genau und präzise das Auftreten von chemischen Verunreinigungen als Proxy für die Exposition gegenüber Mensch und Tier zu messen. Dies ist jedoch chemisch-by-chemische Überwachung und Beurteilung Paradigma kann nicht Schritt halten mit den sich ständig ändernden chemischen Universum, das wir konfrontiert sind. Wenn wir mehr über das Schicksal und Effekte von synthetischen und natürlichen Chemikalien lernen wir weiterhin für Messinstrumente zu suchen, die biologischen Auswirkungen zu erwarten Adresse und dass zur gleichen Zeit auf Veränderungen in der chemischen Produktion, Nutzung und Umwelt Eingang immun. Solche Werkzeuge sind besonders relevant für das Verständnis, ob unbekannte oder neue Chemikalien und Transformationsprodukte, unsere Aufmerksamkeit verdienen. Darüber hinaus komplexe Mischungen von Chemikalien, die in Wasser schlecht durch einzelne chemische Überwachung angesprochen. So stehen wir vor der Herausforderung, die bestehenden Überwachungs Toolbox besser Adresse zu modernisieren, diese Probleme in Oberflächengewässern that Einleitung von gereinigtem Abwasser anfällt und städtischen / Abfluss von Regenwasser erhalten.
In den letzten Jahren haben Bioanalysetechniken versprechen als Screening-Instrumente gezeigt für die Wasserqualitätsbeurteilung. Insbesondere in'vitro Biotests, die Chemikalien wirken über bekannte, spezifische Wirkungsweisen 1,2 sind von großem Interesse für die Umweltüberwachung Gemeinschaft 3 reagieren. Zahlreiche Untersuchungen haben in vitro Biotests eingesetzt , um die endokrine Wirkung von Trink-, Oberflächen- und Abwasser 4 -6 zu quantifizieren. Außerdem zielen eine Reihe von Biotests Molekular auslösenden Ereignissen (beispielsweise Rezeptoraktivierung) , die möglicherweise zu nachteiligen Wirkungen über adverse outcome pathway 7,8 analysiert verknüpft werden können.
Die Entwicklung der bioscreening für die Wasserqualitätsbewertung hat relativ schnell gewesen, mit Hunderten von verschiedenen in vitro - Bioassay Endpunkte wurden ausgewertet haben ihreDienstprogramm 9,10. Derzeit ist nur eine Handvoll von Biotests wurden gute Messgenauigkeit zu erreichen , gezeigt (in Laboratorien) , während die Fähigkeit , unter Wasserqualitäten 5,6 zu unterscheiden demonstrieren. Für behandeltem Abwasser insbesondere das Auftreten von Östrogenen und Glukokortikoid Steroide wurde für die Verwendung von In - vitro - Transaktivierungsassays 11,12 erfolgreich bilanziert. Allerdings haben die meisten Studien bisher eingesetzten Biotests, deren Zelllinien sind Eigentum der Firma (und somit nicht allgemein verfügbar), bedürfen ständiger Pflege und Manipulation, oder beides. Als Ergebnis wird die Fähigkeit, Protokolle zu standardisieren, führen inter-Laborkalibrierung Übungen und schließlich diese Screening-Technologie, um die Wasserressourcen zu übertragen Gemeinschaft gehinderten bleibt.
Mindestens ein Anbieter von In - vitro - Biotests durch die US ToxCast Programm überprüft , ist im Handel erhältlich 13 in leicht zu bedienen "Einfrieren und Auftauen4; Formate. Diese Abteilung verhaftet Zelle "Kits" wurden bei der Messung der Aktivität von Chemikalien aus dem Wasser , die verschiedene Ebenen der Behandlung 14 extrahiert werden robust gezeigt. Obwohl Anbieter Protokolle die Bioaktivität von einzelnen Chemikalien oder Mischungen zum Screenen verfügbar sind, erfordern einige von ihnen Modifikation, bevor sie an Wasserproben angewendet werden. Behandeltem Abwasser 15, Abfluss von Regenwasser 16, Vorfluter 17,18 und in jüngster Zeit wieder aufbereitetem Wasser 19,20 sind Paradebeispiele für wässrige Medien , die von Interesse für die Wasserqualität Gemeinschaft sind.
Diese Studie stellt eine einheitliche, standardisierte Protokoll , um die endokrine Aktivität in Wasserproben unter Verwendung von kommerziell erhältlichen, divisions verhaftet in vitro Trans Biotests zu messen. Wir haben gezeigt, Robustheit des Protokolls durch eine umfassende Bewertung der Hintergrund, Dosis Responsivität und Wiederholbarkeit der Reaktion für two Endpunkte von besonderem Interesse Estrogen und Glucocorticoidrezeptor Trans (ER und GR, beziehungsweise). Das Protokoll wurde auf Bildschirm Proben von behandeltem Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien angewendet.
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Protocol
1. Sammeln und Prozesswasserprobe (Modified von Escher et al. 9)
- Füllen Sie eine saubere 1 L Braunglasflasche mit 1 g Natriumazid und 50 mg Ascorbinsäure an die Spitze mit Wasserprobe von Interesse. Store Probe bei 4 ° C und Verfahren innerhalb von 72 Std.
HINWEIS: Natriumazid ist sehr giftig und müssen mit Vorsicht behandelt werden. Verwenden Sie Schutzkleidung (Schutzbrille / Gesicht, Handschuhe, Kleidung) und wiegen in einem ordnungsgemäß funktionierenden Dunstabzugshaube. Verwenden Sie keine Metallspachtel zum Wiegen verwenden. - Übergeben, die Probe durch einen 1,6 um-Glasfaserfilter und dann durch eine vorkonditionierte Festphasenextraktion (SPE) Patrone mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5-10 ml / min. Einzustellen, den Druck der Vakuumpumpe die Durchflussrate zu steuern.
- Vakuum-Trocknen Sie die Patrone für 15 min.
- Eluieren die Patrone mit 10 ml Methanol, gefolgt von 10 ml Aceton: Hexan (1: 1, v / v).
- Konzentrat Eluat ~ 1 ml unter einem leichten Strom von hochreinem Stickstoff. LösungsmittelAustausch von 500 ul Dimethylsulfoxid Zugabe (DMSO) und der Extrakt bis zu 500 & mgr; l verdampft.
- Bringen Sie den Extrakt zu einem bernsteinfarbenen Glasautosamplergefäß. Lagerung bei -20 ° C.
2. Bereiten Sie Verdünnungen der Test Spezifische Referenz Chemische und Wasserextrakt
- Bereiten 9 Verdünnungen für die Eichkurve.
- Machen Sie eine Stammlösung des Assays spezifischen Referenzsubstanz in 100% DMSO. Die endgültige Konzentration muss 2 uM 17β-Östradiol für die ER-Test sein, und 100 & mgr; M Dexamethason für den GR-Test. Bewahren Sie die Stammlösungen bei -20 ° C.
- In 15 ul der geeigneten Referenz chemischen Bestand auf 285 & mgr; l Assay-Medium in einem sterilen Röhrchen (Röhrchen # 1). Mischen Sie die Probe durch Pipettieren von oben und unten.
- In 200 ul einer Lösung von 5% DMSO in Testmedium in 8 zusätzliche Rohre (Rohre # 2-9).
- Übertragen einer 100-ul-Aliquot von Rohr # 1 bis # Rohr 2 durch Wannee # 9 mit einer 3-fach-Verdünnungsreihe durchzuführen. Jede verdünnte Probe muss gründlich mit einer Pipette gemischt werden, bevor eine aliquote Menge zu nehmen und es auf die nächste Röhre hinzugefügt wird.
- Bereiten Sie eine Lösungsmittelkontrollprobe von 10 ul DMSO in 190 & mgr; l Assay-Medium gemischt wird.
- Bereiten Sie vier Verdünnungen für jeden Wasserextrakt.
- In der ersten Röhre, fügen Sie 5 ul Wasser-Extrakt in 95 & mgr; l Assay-Medium und gründlich mischen. In 50 ul 5% DMSO in Testmedium in drei anderen Rohren.
- Durchführen einer 2-fachen Verdünnung von 50 ul Lösung von einem Rohr zum nächsten übertragen.
3. Bereiten Sie die Zellsuspension, die FRET-Bioassay Conduct
- Bereiten Sie den Test spezifischen Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Assaymedium muss bei 4 ° C gelagert werden und erwärmt auf 37 ° C in einem Wasserbad vor dem Gebrauch.
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit ER oder GR Division-arretierten Zellen aus dem Kryo-freizer und schnell die Zellen auftauen durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten unter leichtem Schütteln platzieren. Dekontaminieren Fläschchen mit 70% Ethanol und legen Sie es in der Klasse II biologischen Sicherheitsschrank.
- Öffnen Sie das Fläschchen unter aseptischen Bedingungen und übertragen Sie die Zellen in 10 ml Testmedium.
- Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
- Den Überstand aspirieren eine sterile Glaspipette verwendet und das Zellpellet in 6 ml Assaymedium zu resuspendieren.
- Mischen Sie 5 ul der Zellsuspension mit 5 ul einer Vitalfärbung Lösung und fügen Sie einen aliquoten in einer Zählkammer.
- Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen unter Verwendung eines Lichtmikroskops oder automatisierten Zellzähler und schätzen Sie die Dichte der lebenden Zellen in der Zellsuspension. Verdünnen, wenn notwendig, eine Enddichte von 550.000 lebende Zellen pro ml Assay-Medium zu erhalten.
4. Platte Zellen in einer 96-Well-Black Wall Clear-Bodenplatte und hinzufügen verdünntem Wasserextrakt
- Erstellen Sie eine PlatteLayout, das über einen 9-Punkt-Test spezifische Kalibrierungskurve, QA / QC-Proben und mehrere Verdünnungen für jeden Wasserextrakt enthält. Ein Beispiel einer 96-Well - Platte Layout ist in Abbildung 1 dargestellt.
- In 90 ul Testmedium auf die Replikation zellfreie Kontrollvertiefungen.
- Gießen Sie die Zellsuspension in einem sterilen Pipettieren Reservoir und fügen Sie 90 ul der Zellsuspension in den anderen Vertiefungen einer Mehrkanalpipette verwenden.
- In 10 ul der verdünnten Proben während der Stufe 2 in die entsprechenden Vertiefungen vorbereitet. Die Endkonzentration von DMSO pro Napf muß maximal 0,5% sein.
- Die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 16 Stunden.
Abb . 1: Beispiel einer 96-Well - Platte Layout Das Multi-Well - Platte wird entwickelt , um eine Assay - spezifische Kalibrierkurve umfassen 3 Typenvon QA / QC-Kontrollen (nur Medien, Zellen in einem sauberen Medium und Zellen in DMSO versetzt Medium) und 4 Verdünnungen pro Wasserextrakt. Für jede Kontrolle und Verdünnung von Wasserextrakt in drei Vertiefungen analysiert wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Bereiten Sie die Lade-Lösung und werden in jedes Well
- Nach der Inkubation ermöglichen die Platte auf RT äquilibrieren. Zu diesem FRET-Bioassay, werden die Schritte 5.2 bis 5.6 sollte in Abwesenheit von direktem Licht durchgeführt werden.
- Bereiten Sie eine 6-fachem Beladungslösung nach den Anweisungen des Herstellers.
- In 20 ul der 6-fachem Beladungslösung in jede Vertiefung.
- In 10 ul der Lebensfähigkeit der Zellen Reagens in jede Vertiefung der Zytotoxizität des verdünnten Wasserextrakt zu bewerten.
- Verschließen Sie die Platte mit Aluminiumklebefolie.
- Die Platte im Dunkeln bei RT für 2 Stunden.
6. Messen Zytotoxizität und endokrine Aktivität Antwort
- Stellen Sie den Mikroplatten-Reader mit einer Bottom-Lesefähigkeiten bis nach den Anweisungen des Herstellers.
- Für die FRET-Trans Bioassay messen Fluoreszenz im blauen (409/460 nm Anregung (Ex) / Emission (Em) Wellenlänge) und Grün (409 Ex / 530 Em nm) Kanäle.
- Für den Zytotoxizitätstest messen Fluoreszenz bei 560 Ex / 590 Em nm.
7. Beurteilen Sie QA / QC überprüft die Qualität der Daten zu bestimmen
- Vergleichen Sie die durchschnittliche rohen Fluoreszenz der zellfreien (Medien nur) und Zellen-only (Zellen in einem sauberen Testmedium) Kontrollen. Die Medien-only Hintergrundfluoreszenz sollte mindestens 25% niedriger ist als die Antwort der Zellen-only Kontrolle.
- Verarbeiten Sie die Roh-FRET-Daten. Für beide "blau" und "grün" Datensätze, subtrahieren die durchschnittliche Fluoreszenz der zellfreie Kontrollvertiefungen von allen Zellen gut enthält. Berechnen Sie dieBlau / Grün-Verhältnis für jeden experimentellen gut.
- Vergleichen blau / grün-Verhältnis von Zellen-only und Zellen mit DMSO-Kontrollen. Die Fluoreszenzwerte dieser Kontrollen sollten innerhalb von 15% relative Standardabweichung (RSD) sein.
- Zeichnen Sie die Assay-spezifische Kalibrierungskurve als blau / grün-Verhältnis gegen die Probenkonzentration als Protokollmolekularmasse ausgedrückt (log M). Berechnen Sie die Steigung, R 2 und log EC 50 (50% - Effekt - Konzentration). Kalibrierungsparameter sollten in Tabelle 1 aufgelistet innerhalb des erwarteten Bereichs liegen.
- Berechnen Sie die RSD für alle drei Vertiefungen. Die Variabilität zwischen den Replikaten sollte über 20% liegen.
- Für die Angaben zur Zytotoxizität (560 Ex / 590 Em nm), subtrahieren, um die zellfreie Kontrolle Durchschnitt (dh Medien Hintergrund) aus allen Zellen enthaltenden Vertiefungen.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund subtrahiert Fluoreszenz für jede Probe. Plotten der resultierenden Fluoreszenzdaten als Prozent der DMSO-Kontrolle. Probenverdünnungen sollte nichtweisen mehr als 20% Mortalität der Zellen im Vergleich zu den Zellen-only und DMSO Kontrollen.
8. Datenanalysen
- Berechnen Sie den Test Nachweisgrenze (LOD) als Mindesteichreaktion plus zwei Standardabweichungen vom Mittelwert dieser Antwort.
- Für Proben , die eine Dosis - Antwort zeigt, leiten die EC 50 des Wasserextrakts der Steigung einer linearen Regression der Kalibrierungskurve zwischen 10 und 50% Wirkung Konzentrationen der Referenzsubstanz verwendet wird.
- Berechnen Sie die bioanalytische Equivalent Konzentration (BEQ) unter Verwendung der Formel: BEQ = EC 50 von Referenzsubstanz / EC 50 von Wasserprobe.
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Representative Results
In der vorliegenden Studie wurden 24 4x h-Mischproben der behandelten kommunalen Abwasser anfällt, 6 Schürfproben von Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Südkalifornien und ein Feld leer von Reinstwasser aus wurden ausgewählt, um dieses Protokoll zu illustrieren. 3 der 4 Abwasserproben wurden aus konventionellen Schlamm Kläranlagen aktiviert ( "secondary Abwasser"), und der vierte von einer fortgeschrittenen Kläranlage mit Sand / Kohlefiltration Post biologische Behandlung ( "tertiäre Abwasser") gegeben. Oberflächenwasserproben wurden von Wasserscheiden, die unterschiedliche Landnutzung (offen, landwirtschaftlichen und städtischen) gesammelt.
Verdünnungen der Wasserextrakte zeigte keine offensichtlichen Zytotoxizität mit weniger als 20% Mortalität Zelle zu den Kontrollen beobachtet DMSO verglichen (Tabelle 1). Die zellfreien (Medien nur) Hintergrund war niedrig, und die cERGLEICH zwischen Zellen-only und Zellen mit DMSO Antworten zeigten, dass das Lösungsmittel auf den Fluoreszenzmessungen keine messbare Wirkung gezeigt. Parameter der Assay spezifischen Eichkurven, einschließlich Steigung log 50 EC, lagen im Bereich von akzeptablen historischen Werte (Tabelle 1) , um eine gute Reproduzierbarkeit der Kalibrierungskurven über die Zeit zeigt. Ein Beispiel für eine akzeptable Kalibrierungskurve für die ER - Assay wird in Figur 2 gezeigt. Die Auswahl von 17β-Östradiol und Dexamethason als Referenzsubstanzen auf die Stärke der Testantwort, die Wahrscheinlichkeit des Auftretens in behandeltem Abwasser und historischen Verwendung von anderen Forschern beruhte 20- 22. Die Variabilität in der Reaktion unter dreifachen Proben betrug weniger als 20% RSD. Somit wurden alle Daten sein, von annehmbarer Qualität erachtet wird, und anschließend wurden die ER und GR Bioaktivität zu schätzen (ausgedrückt als BEQ in ng / L) in Abwasser und Oberflächenwasserproben.
(Abbildung 3). Allerdings Oberflächenwasserextrakte zeigten keine starke ER oder GR-Aktivität. Trotz einer REF von 10, waren die Fluoreszenzreaktionen oft in der Nähe oder unterhalb der Nachweisgrenze. Das Fehlen von Bioassay-Antworten für das Feld leer bestätigt, dass die Erfassungen über LOD waren nicht das Ergebnis der Probenahme oder verfahrens Labor Artefakte zur Kenntnis genommen.
ER und GR - Aktivitäten wurden in 7 und 4 der 10 repräsentativen Wasserproben (Tabelle 2), mit dem höchsten der BEQs von 17 ng E2 / L detektiert und 392 ng Dex / L in den sekundären Abwässern gefunden. Die GR-Aktivität in der Probe des tertiären Ausflusses war unter dem Bioassay LOD. Ebenso zeigten die meisten Oberflächenwasserproben keine GR-Aktivität über LOD und einem deutlich niedrigeren Niveau von ER-Aktivität als die sekundären Abwässer.
Abbildung 2:. Beispiel Kalibrierungskurve für die ER - Assay Die Dosis-Wirkungs-Kurve, als mittlere Fluoreszenzverhältnis (± SEM) aufgetragen, ist sigmoidale und verwendet , um die EC 10 und EC 50 -Werte zu bestimmen. Dieser Teil der Kurve wird die lineare Regression ausgestattet mit und verwendet , um eine Bioassay äquivalente Konzentration abzuleiten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3:. Mittlere Blau / Grün - Fluoreszenz - Verhältnis (± SEM) von Wasserproben aufgetragen gegen theRrelative Anreicherungsfaktor Bioassay äquivalenten Konzentrationen (BEQ) sind für Proben , deren Verdünnungsreihe berechnet zeigen eine konzentrationsabhängige-Reaktion mit einem Minimum von zwei Punkten über dem Grenzwert Nachweis (LOD). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Estrogen Receptor (ER) Assay | Glucocorticoidrezeptor (GR) Assay | |||
| Die Ergebnisse der Studie | Akzeptanzkriterium | Die Ergebnisse der Studie Akzeptanzkriterium | ||
| Kalibrierungsparameter | ||||
| Mittlere log EC50 (M) | -9,6 | -10,1 Auf -9,1 | -8,5 | -9,0 Bis -8,0 |
| Die mittlere Steigung | 1.1 | 0,9 bis 1,5 | 2.0 | 1,8 bis 2,4 |
| R2 | 0,99 | > 0,95 | 0,99 | > 0,95 |
| QA / QC - Kontrollen | ||||
| Medien Hintergrund | ja | Medien nur <cell + Medien | ja | Medien nur <cell + Medien |
| Zytotoxizität (% Mortalität) | 0% | <20% Mortalität | 0 bis 5% | <20% Mortalität |
| Beispiel Präzision (% RSD) </ Td> | 2 bis 18% | <20% | 4 bis 13% | <20% |
Tabelle 1: Zusammenfassung der QA / QC Ergebnisse aus bioanalytischen Screening von behandeltem Abwasser und Oberflächenwasserproben.
| Proben - ID und Beschreibung | ER-BEQ (ng E2 / L) | GR-BEQ (ng Dex / L) |
| A - Endablaufwasser aus Vollsekundär Kläranlage | 6.4 | 248 |
| B - Endablaufwasser aus Vollsekundär Kläranlage | 13 | 392 |
| C - Endablaufwasser aus Voll pflanzlichen Sekundärbehandlung | 17 | 236 |
| D - Endablaufwasser aus Drittbehandlung plant | 2.3 | <22 |
| E - Oberflächenwasser aus landwirtschaftlich genutzten Fläche | <0,5 | 30 |
| F - Oberflächenwasser aus landwirtschaftlich genutzten Fläche | <0,5 | <22 |
| G - Oberflächenwasser aus Stadtgebiet | 4 | <22 |
| H - Oberflächenwasser aus Stadtgebiet | 0,9 | <22 |
| I - Oberflächenwasser aus offenen Feld | 0,8 | <22 |
| J - Oberflächenwasser aus offenen Feld | <0,5 | <22 |
| K - Feld leer (Reinstwasser) | <0,5 | <22 |
Tabelle 2: Bioassay äquivalenten Konzentrationen für Estrogen Receptor (ER-BEQ) und Glucocorticoidrezeptor (GR-BEQ) ac. vität Drei Arten von Proben in Kalifornien (USA) gesammelt werden analysiert: kommunales Abwasser Abwasser (AD), Oberflächenwasser (EJ), und dieses Feld leer (K).
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Discussion
Die gut dokumentierte Potenz von Umwelt Estrogene, wie 17β-Estradiol (E2), garantiert Screening für diese Chemikalien in ng / L - Konzentrationen 23,24. In dieser Studie wurde die ER - Antwort für Abwasser Abwässer (BEQ Bereich: 2,3 bis 17 ng E2 / L) war etwas höher als für sekundäre Abwasser berichtet von der australischen AWBAn 20, während die BEQs für Oberflächenwasser (<0,5 bis 4 ng E2 / L ) waren für die Oberflächen- und Regenwasser im Bereich an anderer Stelle berichtet (<1 bis 11 ng E2 / L) 16. Trotz der niedrigen Niveaus der ER-Aktivität in den Oberflächenwasserproben gemessen, stellt dieser Test eine entsprechende Screening-Endpunkt für die Wasserqualitätsbeurteilung. Östrogene wie Bisphenol A und Alkylphenol-Tenside werden häufig in Gewässern entdeckt, aber sie können schwierig sein, unter Verwendung von herkömmlichen analytischen Chemie zu quantifizieren. ER-Zell-Assays können auch für das Screening von derzeit und neu zugelassenen Pestiziden nützlich erweisen, wie von Kojima et al25.
Die GR - Aktivität überschritten die ER - Aktivität durch eine Größenordnung in allen 4 Abwasserproben in dieser Studie analysiert (Tabelle 2). Diese Tendenz steht im Einklang mit früheren Studien über Abwasserausfluß 14 und der Bereich für GR-BEQs hier berichtet wird , ist etwas höher , aber vergleichbar mit dem für andere Sekundär Abströme berichtet 12 den gleichen in vitro - Bioassay verwendet wird . Mit einer anderen Zelle Bioassay, der Bereich für GR-BEQs für Abwasser aus Kläranlagen in Japan geringer war (<3-78 ng Dex / L) als die für die Sekundär Abwasser berichtet in der vorliegenden Studie 22. Mit Ausnahme der Wasserprobe einzige Oberfläche , die eine maximale GR Reaktion von 30 ng Dex / L registriert (Tabelle 2, Probe E), die GR - Aktivität in den übrigen Oberflächenwasserproben war im Einklang mit der geringen Aktivität berichtet für niederländische Oberfläche 21 Gewässer . Doch die Umwelt imPakt für GR aktive Chemikalien ist weniger gut charakterisiert als für ER aktiven Chemikalien 26, des Potenzials für Effekte höherer Ordnung eine Herausforderung machen Beurteilung.
Wie bei herkömmlichen chemischen Analyse, die Einhaltung der schriftlichen Protokolle und Validierung von Messungen eine erfolgsabhängige QA mit / QC Ansatz maximiert die Datenqualität und Robustheit. Obwohl Biotests Validierung der Zelle für die Bewertung der Wasserqualität angepasst wird sich weiter entwickeln und zu verbessern, die Messung der QA / QC - Parameter skizziert zunächst in Mehinto et al. 14 und an dieser Studie angewendet haben gezeigt , dass unsere Ergebnisse innerhalb von vorgegebenen Richtwerte gut waren (Tabelle 1 ). Die Kalibrierungskurve Parameter für diese Bioassays spiegeln die für die Kalibrierung anderen analytischen Protokollen verwendet (beispielsweise GC-MS), mit dem Zusatz von Kriterien, die die Lebensfähigkeit der Zellen (beispielsweise Zytotoxizität) , die die Hauptunterschied zu beurteilen. Ein weiterer BetriebsDifferenz ermöglicht Zellen in einem Format mit hohem Durchsatz ist die Aufnahme von mehreren Probenverdünnungen verwendet, die die konzentrationsabhängige Antwort erwartet veranschaulichen , wenn Bioaktivität gemessen (Abb. 2). Bei der Überprüfung der Probenmessungen, die untere ER und GR Antworten für den tertiären Ausflusses (Probe D) im Vergleich zu den drei sekundären Abwasserproben (AC) liefert zusätzliche Beweise für die relative Genauigkeit unserer Bioassay - Screening Ergebnisse in Tabelle 2. Der Einbau von Steuer- oder Referenzproben, die die Matrix von Interesse, in diesem Fall Wasser darstellen, würde verbessern weiter die Fähigkeit innerhalb Bioassay-Ergebnisse zu vergleichen und vor allem über Messeinheiten.
Die Antworten der ER und GR Trans Zelle in dieser Studie verwendeten Linien wurden auf die Aktivität der starken Agonisten E2 und Dexamethason, jeweils bezogen ausgedrückt. Dies ermöglicht eine quantitative Schätzung der Bioaktivität a ausgedrücktsa Bioassay Equivalent Konzentration (BEQ). Dies ermöglicht eine weitere für die Untersuchung von Chemikalien, die dem Bioassay Reaktion beitragen, dh einen direkten Vergleich von BEQs mit Konzentrationen einzelner Agonisten über herkömmliche analytische Chemie bestimmt. Dieses Konzept unterstreicht den zusätzlichen Nutzen von bioscreening in der diagnostischen Untersuchung von Erregern lenken, die auch als Effekte gerichtete Analyse bekannt.
Da SPE routinemäßig eine breite Palette von Arzneimitteln und anderen "emerging Verunreinigungen" von Wasser zu isolieren, beschäftigten wir bisher veröffentlichten Protokoll 9, 20 verwendet wird , die ein Sorptionsmittel vorge entwickelt , um sowohl hydrophile als auch hydrophobe Chemikalien im Wasser zu erfassen. Obwohl wir quantitative Erfassung aller bioaktiven organischen Verbindungen mit dieser Technik, zusätzliche Arbeit ist notwendig, um vollständig zu standardisieren und zu validieren die Leistung solcher Extraktionsverfahren übernehmen. Die Art der Zellassay in dieser Studie verwendet wird, kann präsentierenEine weitere Einschränkung. Diese Tests messen die Wechselwirkungen zwischen Schadstoffen und Kernrezeptoren und nehmen Sie nicht in Betracht andere mögliche Wechselwirkungen, wie chemisch-Membranrezeptor. Somit ist es möglich, dass die hier gemessenen Screening-Reaktionen unterschätzt wurden. Wie Probenextraktion, gibt es keine standardisierten Methoden Zellassay Daten zu analysieren und unterschiedliche Ansätze können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Die lineare Regression in dieser Studie verwendet, um die Reaktion für die untere Hälfte der Kalibrierungskurve zu modellieren kann für alle Zellassays nicht geeignet sein, insbesondere wenn modellierte Antwort über den relativ engen Bereich in der vorliegenden Untersuchung angegeben verlängert wird. Weitere Untersuchungen in den oben genannten Fragen wird benötigt, um das Ausmaß, in dem diese Werkzeuge zu verstehen, kann als robustes Monitoring-Tool angewendet werden.
Während ein großer Teil der Grundstein für ER und GR als Bildschirme für endokrin aktive Chemikalien gelegt wird, verbreitern Forscher den Umfang derbioanalytische Werkzeuge andere relevante Modus von Aktionen, zum Beispiel androgenicity, Genotoxizität, Neurotoxizität und Immuntoxizität 9,27 aufzunehmen. Eine vollständigere Toolbox wird verbessern die Fähigkeit für bioaktive Chemikalien zu screenen, einschließlich Umwandlungsprodukte von bekannten und / oder unbekannten Chemikalien , die 28, jetzt und in der Zukunft, in verschiedenen Gewässern 19 auftreten können.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
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