Abstract
En los bioensayos de transactivación in vitro han mostrado prometedor como herramientas de supervisión de la calidad del agua, sin embargo, su adopción y aplicación generalizada se ha visto obstaculizada debido en parte a la falta de métodos estandarizados y la disponibilidad de la tecnología robusta, fácil de usar. En este estudio, se emplearon, líneas celulares de división a detener disponibles en el mercado para la detección cuantitativa de la actividad endocrina de los productos químicos presentes en las muestras de agua de interés para los profesionales de la calidad del medio ambiente. Un protocolo único, estandarizado que incluía aseguramiento de calidad / control de calidad (QA / QC) comprueba si se ha desarrollado para la actividad de estrógeno y receptor de glucocorticoides (GR y ER, respectivamente) utilizando un ensayo de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia basado en células (FRET). Las muestras de los efluentes tratados municipal de aguas residuales y agua de superficie de sistemas de agua dulce en California (EE.UU.), se extrajeron mediante extracción en fase sólida y se analizó la actividad endocrina utilizando el proto estandarizadacolumna. Antecedentes y dosis-respuesta para los productos químicos de referencia de punto final específico cumplen las directrices de AC / CC que se consideren necesarias para la medición fiable. La respuesta de detección bioensayo para las muestras de agua de la superficie no era en gran parte detectable. Por el contrario, las muestras de efluentes de plantas de tratamiento secundario tuvieron la mayor actividad medible, con concentraciones equivalentes de bioensayo estimado (EQB) de hasta 392 ng de dexametasona / L para GR y 17 ng de 17β-estradiol / L para el ER. La respuesta bioensayo para una muestra de efluente terciario fue menor que el medido para los efluentes secundarios, lo que indica un residual inferior de endocrinos químicos activos después del tratamiento avanzado. Este protocolo mostró que en los bioensayos de transactivación in vitro que utilizan comercialmente disponible, la división celular detenido de "kits", se puede adaptar para la detección de la actividad endocrina en agua.
Introduction
El monitoreo actual calidad del agua se basa en la capacidad de medir con exactitud y precisión la presencia de contaminantes químicos como sustituto de la exposición a la fauna y los seres humanos. Sin embargo, esta vigilancia química por sustancia y paradigma de la evaluación no pueden seguir el ritmo del universo químico en constante cambio al que nos enfrentamos. A medida que aprendemos más sobre el destino y los efectos de los productos químicos sintéticos y naturales, continuamos la búsqueda de herramientas de medición que espera abordar los impactos biológicos, y que al mismo tiempo son inmunes a los cambios en la producción de sustancias químicas, el uso y la entrada del medio ambiente. Estas herramientas son especialmente relevantes para la comprensión de si las sustancias químicas desconocidas o nuevas, y productos de transformación, merecen nuestra atención. Por otra parte, mezclas complejas de productos químicos presentes en el agua están mal dirigidas por vigilancia química individual. Por lo tanto, nos encontramos ante el reto de la modernización de la caja de herramientas de monitoreo existente para abordar mejor estas cuestiones en las aguas superficiales del that recibir descarga de efluentes de aguas residuales tratadas y aguas de escorrentía / pluviales urbanos.
En los últimos años, las técnicas de bioanálisis se han mostrado prometedoras como herramientas de detección para la evaluación de la calidad del agua. En particular, los bioensayos, in'vitro que responden a las sustancias químicas que actúan por medio conocido, los modos específicos de acción 1,2 son de gran interés para la comunidad vigilancia del medio ambiente 3. Numerosas investigaciones han empleado en bioensayos in vitro para cuantificar la actividad endocrina del consumo de alcohol, la superficie y las aguas residuales 4 -6. Por otra parte, una serie de bioensayos objetivo sucesos iniciadores moleculares (por ejemplo, la activación del receptor), que puedan estar relacionadas con efectos nocivos a través de la vía resultado adverso analiza 7,8.
La evolución de bioscreening para la evaluación de la calidad del agua ha sido relativamente rápida, con cientos de diferentes puntos finales en bioensayos in vitro de haber sido evaluados por suutilidad de 9,10. En la actualidad, sólo un puñado de bioensayos se ha demostrado para lograr una buena precisión de la medida (dentro de los laboratorios) al tiempo que demuestra la capacidad de diferenciar entre las calidades de agua 5,6. Para los efluentes de aguas residuales tratadas, en particular, la aparición de los estrógenos y esteroides glucocorticoides ha sido exitosamente representaron para usar en ensayos de transactivación in vitro 11,12. bioensayos Sin embargo, la mayoría de los estudios hasta la fecha han empleado cuyas líneas celulares son de propiedad (y por lo tanto no están ampliamente disponibles), requieren de atención continua y la manipulación, o ambos. Como resultado, la capacidad de estandarizar protocolos, realizar ejercicios de calibración entre laboratorios, y en última instancia para transferir esta tecnología de detección para los recursos de agua de la comunidad sigue siendo impedida.
Al menos un proveedor de bioensayos in vitro examinados a través del programa de Estados Unidos ToxCast está disponible comercialmente en 13 fáciles de usar "congelación y descongelación4; formatos. Estas células "kits" de división-detenidos han demostrado ser robustos en la medición de la actividad de los productos químicos extraídos de agua que representan diferentes niveles de tratamiento 14. Aunque los protocolos de los proveedores están disponibles para detectar la bioactividad de los productos químicos individuales o mezclas, algunos de ellos requieren modificación antes de que se pueden aplicar a muestras de agua. Efluentes de aguas residuales tratadas 15, 16 escorrentía de aguas pluviales, aguas receptoras 17,18 y más recientemente reciclada 19,20 agua son los principales ejemplos de medios acuosos que son de interés para la comunidad de la calidad del agua.
En este estudio se presenta un protocolo único, estandarizado para medir la actividad endocrina en muestras de agua usando disponible en el mercado, la división-detenido en bioensayos de transactivación in vitro. Hemos demostrado la robustez del protocolo a través de una evaluación exhaustiva de fondo, la capacidad de respuesta de la dosis y la repetibilidad de la respuesta de two Los criterios de valoración de especial interés y estrógeno transactivación del receptor de glucocorticoides (GR y ER, respectivamente). El protocolo se aplicó a muestras de pantalla de efluentes de aguas residuales tratadas y aguas superficiales procedentes de sistemas de agua dulce en California.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Recoger y la Muestra de aguas de procesos (Modificado de Escher y otros. 9)
- Llenar un 1 L frasco de vidrio ámbar limpia que contiene 1 g de azida de sodio y ácido ascórbico 50 mg a la parte superior con la muestra de agua de interés. conserve la muestra a 4 ° C y proceso dentro de 72 horas.
NOTA: La azida sódica es altamente tóxico y debe manejarse con precaución. Use equipo de protección (gafas / máscara, guantes, ropa) y pesar en una campana de humos que funcione correctamente. No use una espátula de metal para el pesaje. - Pasar la muestra a través de un filtro de fibra de vidrio 1,6 M y luego a través de un cartucho de extracción en fase sólida preacondicionado (SPE) a una velocidad de flujo de 5 a 10 ml / min. Ajustar la presión de la bomba de vacío para controlar la velocidad de flujo.
- Vacuum secar el cartucho durante 15 min.
- Eluir el cartucho con 10 ml de metanol, seguido de 10 ml de acetona: hexano (1: 1, v / v).
- Concéntrese eluato a ~ 1 ml bajo una ligera corriente de nitrógeno de alta pureza. Solventeintercambio mediante la adición de 500 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y evaporando el extracto hasta 500 l.
- Transferir el extracto a un vial de vidrio ámbar muestreador automático. Almacenar a -20 ° C.
2. Preparar diluciones de la química específica Prueba de Referencia y el extracto de agua
- Preparar diluciones 9 para la curva de calibración.
- Hacer una solución madre de la sustancia de referencia específico de ensayo en 100% DMSO. La concentración final debe ser de 2 M 17β-estradiol para el ensayo de ER, y 100 mM de dexametasona para el ensayo de GR. Almacenar las soluciones madre a -20 ° C.
- Añadir 15 l de la de la sustancia de referencia apropiada a 285 l de medio de ensayo en un tubo estéril (tubo # 1). Mezclar la muestra con la pipeta hacia arriba y abajo.
- Añadir 200 l de una solución de 5% de DMSO en medio de ensayo en 8 tubos adicionales (tubos # 2-9).
- Transferir una alícuota de 100 l de tubo # 1 al tubo # 2 a la bañerae # 9 para llevar a cabo una serie de diluciones de 3 veces. Cada muestra diluida debe ser completamente mezclado con una pipeta antes de tomar una alícuota y agregarlo a la siguiente tubo.
- Preparar una muestra de control de disolvente mezclando 10 l de DMSO en 190 l de medio de ensayo.
- Preparar cuatro diluciones de cada extracto de agua.
- En el primer tubo, añadir 5 l de extracto de agua de 95 l de medio de ensayo y mezclar bien. Añadir 50 l de 5% de DMSO en medio de ensayo en otros tres tubos.
- Realizar una dilución de 2 veces mediante la transferencia de 50 l de solución de un tubo al siguiente.
3. Preparar la suspensión celular a Llevar a cabo el ensayo biológico, FRET
- Preparar el medio específico ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. medio de ensayo debe ser almacenado a 4 ° C y se calentó a 37 ° C en un baño de agua antes de su uso.
- Tomar un vial de células de división-ER arrestado o GR fuera de la criogénica librezer y descongelar las células rápidamente colocando el vial en un 37 ° C baño de agua durante 2 minutos con agitación suave. Descontaminar el vial con 70% de etanol y colocarlo en una cabina de seguridad biológica de clase II.
- Abrir el vial usando técnicas asépticas y transferir las células en 10 ml de medio de ensayo.
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante usando una pipeta de vidrio estéril y resuspender el sedimento de células en 6 ml de medio de ensayo.
- Mezclar 5 l de suspensión de células con 5 l de una solución de vital importancia mancha y añadir una alícuota en una cámara de recuento.
- Contar el número de células vivas usando un microscopio de luz o contador de células automatizado y estimar la densidad de células vivas en la suspensión celular. Diluir si es necesario para obtener una densidad final de 550.000 células vivas por ml de medio de ensayo.
4. Las células de la placa en una placa de 96 pocillos Negro pared de fondo transparente y diluido Añadir extracto de agua
- Crear una placadiseño que incluye una curva de 9 puntos ensayo de calibración específica, las muestras de QA / QC y múltiples diluciones de cada extracto de agua. Un ejemplo de un diseño de placa de 96 pocillos se muestra en la Figura 1.
- Añadir 90 l de medio de ensayo a los pocillos de control libres de células repetidas.
- Se vierte la suspensión de células en un depósito de pipeteado estéril y añadir 90 l de suspensión celular a los otros pocillos utilizando una pipeta multicanal.
- Añadir 10 l de las muestras diluidas preparadas durante la etapa 2 a los pocillos apropiados. La concentración final de DMSO por pocillo debe ser 0,5% como máximo.
- Cubrir la placa con una tapa y colocarla en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C durante 16 horas.
Figura 1:. Ejemplo de una disposición de las placas de 96 pocillos La placa de múltiples pocillos está diseñado para incluir una curva de calibración específica ensayo, 3 tiposde los controles de QA / QC (medios solamente, células en un medio limpio y células en DMSO claveteado medio) y 4 diluciones por extracto de agua. Cada control y la dilución del extracto de agua se analiza en pocillos por triplicado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Preparar la solución de carga y añadir a cada pocillo
- Después de la incubación, dejar que la placa se equilibre a temperatura ambiente. Para este bioensayo FRET, los pasos 5.2 a 5.6 deben llevarse a cabo en ausencia de luz directa.
- Preparar una solución de 6x carga de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir 20 l de la solución de carga 6x a cada pocillo.
- Añadir 10 l de reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo para evaluar la citotoxicidad del extracto de agua diluida.
- Sellar la placa con película adhesiva de aluminio.
- Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 horas.
6. Medida de citotoxicidad y actividad de respuesta endocrina
- Configurar el lector de microplacas con capacidades de lectura de abajo siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Para el bioensayo transactivación FRET, medir la fluorescencia en el azul (409/460 nm, excitación (Ex) / emisión (Em) de longitud de onda) y verde (409 Ex / Em 530 nm) canales.
- Para el ensayo de citotoxicidad, medir la fluorescencia a 560 Ex / Em 590 nm.
7. Evaluar QA / QC cheques para determinar la calidad de los Datos
- Comparar la fluorescencia prima media de la libre de células (medio solamente) y controles de sólo células (células en medio de ensayo limpio). La fluorescencia de fondo de medios de comunicación sólo debe ser al menos 25% más baja que la respuesta del control de las células solamente.
- Procesar los datos de FRET primas. Para ambos conjuntos de datos 'azules' y 'verdes', restar la fluorescencia media de los pocillos de control de células libres de toda célula que contiene también. Calcula elrelación azul / verde para cada pocillo experimental.
- Comparar relación azul / verde de las células y las células sólo para los controles con DMSO. los valores de fluorescencia de los controles deberán estar dentro del 15% de desviación estándar relativa (RSD).
- Trazar la curva de calibración específica ensayo como relación azul / verde contra la concentración de la muestra se expresa como una masa molecular de registro (log M). Calcular la pendiente, R2 y log CE 50 (50% Concentración de efecto). Los parámetros de calibración deben estar dentro del rango esperado que figuran en la Tabla 1.
- Calcular la RSD para todos los pocillos por triplicado. La variabilidad entre los distintos recipientes debe ser inferior a 20%.
- Para los datos de citotoxicidad (560 Ex / Em 590 nm), restar el promedio de control libre de células (es decir, el fondo de medios) de todos los pozos que contienen células.
- Se calcula la media de fluorescencia de fondo-resta para cada muestra. Representar gráficamente los datos de fluorescencia resultantes como un porcentaje del control de DMSO. diluciones de la muestra no deberíaexhibir la mortalidad celular más de 20% en comparación con las células de sólo y DMSO controles.
8. Análisis de datos
- Calcular el límite de detección del ensayo (LOD) como la respuesta de calibración mínimo más dos desviaciones estándar de la media de esa respuesta.
- Para las muestras que muestran una relación dosis-respuesta, derivar la CE 50 del extracto de agua utilizando la pendiente de una regresión lineal de la curva de calibración entre 10 y 50% las concentraciones de efectos de la sustancia de referencia.
- Calcular la concentración Bioanalytical Equivalente (BEQ) usando la fórmula: CE = BEQ 50 de sustancia de referencia / CE 50 de muestra de agua.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En el presente estudio, se seleccionaron muestras de 4x 24 hr compuestos de efluentes de aguas residuales municipales tratadas, 6 muestras al azar de las aguas superficiales de sistemas de agua dulce en el sur de California y un campo en blanco que consiste en agua ultrapura para ilustrar este protocolo. 3 de las 4 muestras de los efluentes de las plantas fueron activados convencionales de tratamiento de lodos de aguas residuales ( "efluente secundario"), y la cuarta de una planta de tratamiento avanzado de aguas residuales con el añadido de tratamiento de filtración por arena / carbón poste biológica ( "efluente terciario"). muestras de agua superficial se obtuvieron de las cuencas hidrográficas que representan diferente uso de la tierra (abierto, agrícola y urbana).
Las diluciones de los extractos de agua no mostraron citotoxicidad aparente a la mortalidad celular de menos de 20% observado en comparación con los controles de DMSO (Tabla 1). -Celular gratis (sólo los medios de comunicación) de fondo era baja, y el cOMPARACIÓN entre las células y las células de sólo con respuestas DMSO indicado que el disolvente no tuvo un impacto mensurable sobre las medidas de fluorescencia. Los parámetros de las curvas de calibración específicos de ensayo, incluyendo la pendiente log CE 50, estaban dentro del rango de valores históricos aceptables (Tabla 1), demostrando una buena reproducibilidad de las curvas de calibración con el tiempo. Un ejemplo de curva de calibración aceptable para el ensayo de ER se muestra en la Figura 2. La selección de 17β-estradiol y dexametasona como productos químicos de referencia se basan en la fuerza de la respuesta del ensayo, la probabilidad de ocurrencia en las aguas residuales tratadas y uso histórico por otros investigadores 20- 22. La variabilidad en la respuesta entre las muestras por triplicado fue de menos de 20% RSD. Por lo tanto, todos los datos fueron considerados como de calidad aceptable, y se utilizaron posteriormente para estimar el ER y bioactividad GR (expresado como BEQ en ng / L) en muestras de agua de aguas residuales y de superficie.
(Figura 3). Sin embargo, los extractos de agua superficial no mostraron fuertes ER o la actividad de GR. A pesar de un REF de 10, las respuestas fluorescentes eran a menudo cerca o por debajo del límite de detección. La ausencia de respuestas de bioensayos para el campo en blanco confirmó que las detecciones mencionados anteriormente LOD no fueron el resultado de artefactos de muestreo o análisis de laboratorio de procedimiento.
Se detectaron actividades de IE y GR en 7 y 4 de las 10 muestras de agua representativas, respectivamente (Tabla 2), con el más alto de EQB de 17 ng E2 / L y 392 ng Dex / L se encuentran en los efluentes secundarios. La actividad de GR en la muestra del efluente terciario estaba por debajo del límite de detección bioensayo. Del mismo modo, la mayoría de las muestras de agua de superficie no exhibieron la actividad de GR por encima de LOD y niveles mucho más bajos de actividad ER que los efluentes secundarios.
Figura 2:. Ejemplo de la curva de calibración para el ensayo de ER La curva de dosis-respuesta, representa como la relación de fluorescencia media (± SEM), es sigmoidal y se utiliza para determinar los valores de CE 10 y CE 50. Esta porción de la curva se ajustó utilizando regresión lineal y se utiliza para derivar una concentración equivalente bioensayo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Les / ftp_upload / 54725 / 54725fig3.jpg "/>
Figura 3:. Mean azul / Ratio verde de fluorescencia (± SEM) de muestras de agua representa frente theRrelative Enrichment Factor de bioensayo concentraciones equivalentes (BEQ) se calculan para muestras cuya serie de dilución mostrar un dependiente de la respuesta de la concentración con un mínimo de dos puntos por encima del límite de detección (LOD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Del receptor de estrógeno (ER) Ensayo | Receptor de glucocorticoides (GR) Ensayo | |||
| Resultados del estudio | Criterios de aceptación | Resultados del estudio Criterios de aceptación | ||
| Los parámetros de calibración | ||||
| El promedio diario de CE50 (M) | -9.6 | -10,1--9,1 | -8.5 | -9,0--8,0 |
| pendiente media | 1.1 | 0,9-1,5 | 2.0 | 1.8 a 2.4 |
| R2 | 0.99 | > 0,95 | 0.99 | > 0,95 |
| Controles de QA / QC | ||||
| Panorama de los medios | sí | Sólo los medios de comunicación <celular + medios | sí | Sólo los medios de comunicación <celular + medios |
| La citotoxicidad (% de mortalidad) | 0% | <20% de mortalidad | 0 a 5% | <20% de mortalidad |
| precisión de la muestra (% RSD) </ Td> | 2-18% | <20% | 4-13% | <20% |
Tabla 1: Resumen de QA / QC Resultados A partir Bioanalítico Proyección de las aguas residuales tratadas de efluentes y muestras de aguas superficiales.
| Muestra Identificación y descripción | ER-BEQ (ng E2 / L) | GR-BEQ (ng Dex / L) |
| A - efluente final de la plena planta de tratamiento secundario | 6.4 | 248 |
| B - efluente final de la plena planta de tratamiento secundario | 13 | 392 |
| C - efluente final de la plena planta de tratamiento secundario | 17 | 236 |
| D - efluentes finales de tratamiento terciario pLant | 2.3 | <22 |
| E - agua superficial de la superficie agrícola | <0,5 | 30 |
| F - agua superficial de la superficie agrícola | <0,5 | <22 |
| G - agua superficial del área urbana | 4 | <22 |
| H - agua superficial del área urbana | 0,9 | <22 |
| I - agua superficial de campo abierto | 0,8 | <22 |
| J - agua superficial de campo abierto | <0,5 | <22 |
| K - campo en blanco (agua ultrapura) | <0,5 | <22 |
Tabla 2: Concentraciones de bioensayo equivalentes para los Receptores de Estrógenos (ER-BEQ) y del receptor de glucocorticoides (GR-BEQ) ac. tividad tres tipos de muestras recogidas en California (EE.UU.) se analizan: efluente de aguas residuales municipales (AD), las aguas superficiales (EJ), y el campo en blanco (K).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La potencia bien documentado de los estrógenos ambientales, tales como 17β-estradiol (E2), Presentación de órdenes de estos productos químicos en concentraciones / L 23,24 ng. En este estudio, la respuesta ER para los efluentes de aguas residuales (rango de BEQ de: 2.3 a la 17 MAL E2 / L) fue algo superior a la reportada para efluente secundario de la EDAR de Australia 20, mientras que los EQB para las aguas superficiales (<0,5 a 4 ng E2 / L ) se encontraban dentro del rango reportado para la superficie de las aguas pluviales y otra parte (<1 a 11 ng E2 / L) 16. A pesar de los bajos niveles de actividad ER medidos en las muestras de agua de superficie, este ensayo representa un punto final de selección pertinente para la evaluación de la calidad del agua. Los estrógenos, tales como tensioactivos bisfenol A y de alquilfenol se detectan a menudo en el medio ambiente acuático, pero pueden ser difíciles de cuantificar utilizando la química analítica convencional. ensayos de células ER también pueden resultar útiles para la detección de pesticidas registrados actualmente y recientemente, como se muestra por Kojima et al25.
La actividad GR supera la actividad de ER en un orden de magnitud en las 4 muestras de los efluentes analizados en este estudio (Tabla 2). Esta tendencia es consistente con estudios anteriores sobre los efluentes de aguas residuales 14, y el rango para GR-EQB informó aquí es ligeramente superior, pero comparable a la reportada para otros efluentes secundarios usando el mismo bioensayo in vitro 12. El uso de un bioensayo con células diferentes, la gama para GR-EQB de efluentes de plantas de tratamiento de aguas residuales en Japón fue menor (<3 a la representó 78 ng Dex / L) que los reportados para efluentes secundarios en el presente estudio 22. Con la excepción de la muestra de agua sola superficie que registró una respuesta máxima GR de 30 ng de Dex / L (Tabla 2, la muestra E), la actividad de GR en las muestras de agua de superficie restantes fue consistente con informó la baja actividad para la superficie holandés riega 21 . Sin embargo, el im ambientalpacto por la GR productos químicos activos es menos bien caracterizado que para los productos químicos activos ER 26, por lo que la evaluación de los posibles efectos de orden superior un desafío.
Al igual que con el análisis químico convencional, la adhesión a los protocolos escritos y validación de las mediciones utilizando un control de calidad basado en el rendimiento / QC enfoque maximiza la calidad de los datos y robustez. Aunque la validación de los bioensayos celulares adaptados para la evaluación de la calidad del agua continuará evolucionando y mejorando, la medición de los parámetros de QA / QC primera esbozados en Mehinto et al. 14 y aplicadas a este estudio demostró que nuestros resultados se encontraban dentro de los valores de referencia especificados previamente (Tabla 1 ). Los parámetros de curva de calibración para estos bioensayos son similares a los utilizados para la calibración de otros protocolos de análisis (por ejemplo, GC-MS), con la adición de criterios que evalúan la viabilidad de las células (por ejemplo, citotoxicidad) que representa la diferencia principal. otro operativodiferencia hecho posible el uso de células en un formato de alto rendimiento es la inclusión de múltiples diluciones de muestras que ilustran la respuesta dependiente de la concentración esperada cuando la bioactividad se mide (. Figura 2). En la revisión de las medidas de la muestra, la sala de emergencias más baja y las respuestas de GR para el efluente terciario (muestra D) en comparación con las tres muestras de los efluentes secundarios (AC) proporciona evidencia adicional de la exactitud relativa de los resultados de la prueba del bioensayo en la Tabla 2. Incorporación de control o muestras de referencia que representan la matriz de que, en este caso agua, aumentaría aún más la capacidad de comparar los resultados del bioensayo dentro y sobre todo a través de entidades de medición.
Las respuestas de las líneas celulares ER y de transactivación de GR utilizados en este estudio se expresaron en relación a la actividad de los agonistas fuertes E2 y dexametasona, respectivamente. Esto permite una estimación cuantitativa de la bioactividad expresó unasa Bioensayo concentración equivalente (EQB). Esto permite además para la investigación de productos químicos que contribuyen a la respuesta bioensayo, es decir, una comparación directa de EQB con concentraciones de agonistas individuales determinados a través de la química analítica convencional. Este concepto pone de relieve el valor añadido de bioscreening en la dirección de la investigación diagnóstica de los agentes causales, también conocido como análisis de efectos-dirigidos.
Desde SPE se utiliza rutinariamente para aislar una amplia gama de productos farmacéuticos y otros "contaminantes emergentes" de agua, se empleó un protocolo previamente publicado 9, 20 que presentaba un sorbente diseñado para capturar los productos químicos tanto hidrófilos e hidrófobos en agua. Aunque suponemos captura cuantitativa de todos los compuestos orgánicos bioactivos usando esta técnica, se necesita trabajo adicional para estandarizar y validar completamente el funcionamiento de dichos métodos de extracción. El tipo de ensayo de células empleado en este estudio puede presentarotra limitación. Estos ensayos miden las interacciones entre los contaminantes y los receptores nucleares y no toman en cuenta otras posibles interacciones, tales como los receptores de membrana química. Por lo tanto, es posible que las respuestas de detección medidos aquí se subestimaron. Al igual que la extracción de la muestra, no existen métodos estandarizados para analizar los datos de ensayo de células y diferentes enfoques pueden producir resultados diferentes. La regresión lineal utilizado en este estudio para modelar la respuesta de la mitad inferior de la curva de calibración puede no ser apropiado para todos los ensayos de células, en particular si la respuesta modelada se extiende más allá de la gama relativamente estrecha se especifica en el presente estudio. Se necesita investigación adicional en los temas anteriores para comprender el grado en que estas herramientas se pueden aplicar como una herramienta de monitoreo robusto.
Mientras que gran parte del trabajo de base se está poniendo para ER y GR como pantallas para endocrinos químicos activos, los investigadores están ampliando el alcance deherramientas de bioanálisis para incluir otro modo correspondiente de acciones, por ejemplo, androgenicidad, genotoxicidad, la neurotoxicidad y la inmunotoxicidad 9,27. Una caja de herramientas más completo mejorará la capacidad de detección de productos químicos bioactivos, incluyendo productos de transformación de los productos químicos conocidos o desconocidos y / que se pueden producir de 28 años, ahora y en el futuro, en diversos ambientes acuáticos 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
