Abstract
In vitro transaktiverings bioanalyser har visat lovande resultat som övervakning av vattenkvaliteten verktyg, men deras antagande och utbredd tillämpning har hindrats delvis på grund av en brist på standardiserade metoder och tillgången på robust, användarvänlig teknik. I denna studie var kommersiellt tillgängliga, division-arrested cellinjer som användes för att kvantitativt screena för endokrin aktivitet av kemikalier som finns i vattenprover av intresse för kvalitets yrkesverksamma miljö. En enda, standardiserat protokoll som ingår omfattande kvalitetssäkring / kvalitetskontroll (QA / QC) kontroller har utvecklats för östrogen och glukokortikoidreceptorn aktivitet (ER och GR, respektive) med en cellbaserad fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -analys. Prover av renat kommunalt avloppsvatten avloppsvatten och dagvatten från sötvattensystem i Kalifornien (USA), extraherades med hjälp av fastfasextraktion och analyserades med avseende endokrin aktivitet med hjälp av standardiserade protocol. Bakgrund och dos-respons för endpoint specifika referenskemikalier träffade QA / QC riktlinjer som anses nödvändiga för tillförlitlig mätning. Bioanalysen screening svar för ytvattenprover var i stort sett inte upptäckas. Däremot utflödesprover från sekundära reningsverk hade den högsta mätbar aktivitet, med beräknade bioassay ekvivalenta koncentrationer (BEQs) upp till 392 ng dexametason / L för GR och 17 ng 17β-estradiol / L för ER. Bioanalysen svaret för en tertiär avloppsvatten prov var lägre än vad som uppmätts för andra utsläpp, vilket indikerar en lägre rest endokrina aktiva kemikalier efter avancerad behandling. Detta protokoll visade att in vitro transaktiverings bioanalyser som använder kommersiellt tillgängliga, division greps cell "kit", kan anpassas att screena för endokrin aktivitet i vatten.
Introduction
Strömövervakning vattenkvaliteten bygger på förmågan att noggrant och exakt mäta förekomsten av kemiska föroreningar som ett mått på exponering för vilda djur och människor. Men denna kemikalie-by-kemisk övervakning och utvärdering paradigm kan inte hålla jämna steg med den ständigt föränderliga kemiska universum som vi står inför. När vi lär oss mer om vad som händer och effekterna av syntetiska och naturliga kemikalier, fortsätter vi att leta efter mätverktyg som adress förväntade biologiska effekter, och att samtidigt är immuna mot förändringar i kemisk produktion, användning och miljö ingång. Sådana verktyg är särskilt relevanta för att förstå om okända eller nya kemikalier och omvandlingsprodukter, förtjänar vår uppmärksamhet. Dessutom är komplexa blandningar av kemikalier som finns i vatten dåligt åtgärdas genom individuell kemisk övervakning. Således står vi inför utmaningen att modernisera den befintliga övervakningsverktygslåda för att bättre hantera dessa frågor i ytvatten that får utsläpp av renat avloppsvatten avloppsvatten och urban / dagvattenavrinning.
Under de senaste åren har bioanalytiska tekniker visat sig lovande som screeningverktyg för bedömning av vattenkvaliteten. I synnerhet in'vitro bioanalyser som svarar på kemikalier som verkar via kända, specifika verkningssätt 1,2 är av stort intresse för miljöövervakning samhället 3. Ett flertal undersökningar har använt in vitro bioanalyser att kvantifiera endokrin aktivitet av dricksvatten, yta och avloppsvatten 4 -6. Dessutom har ett antal av bioanalyser riktar molekylära inledande händelser (t ex receptoraktivering) som eventuellt kan kopplas till skadliga effekter via ogynnsamt utfall väg analyserar 7,8.
Utvecklingen av bioscreening för bedömning av vattenkvaliteten har varit relativt snabb, med hundratals olika bioanalys in vitro endpoints har utvärderats för sinutility 9,10. För närvarande har endast en handfull av bioanalyser visat att uppnå god mätprecision (inom laboratorier) medan visar förmågan att skilja mellan vattenkvaliteter 5,6. För renat avloppsvatten avloppsvatten i synnerhet, har förekomsten av östrogener och glukokortikoidsteroider varit framgångsrikt redovisas enligt in vitro transaktiveringsanalyser 11,12. Dock har de flesta studier hittills anställda bioanalyser vars celllinjer är proprietära (och därmed inte allmänt tillgängliga), kräver kontinuerlig vård och manipulation, eller båda. Som ett resultat, förmågan att standardisera protokoll, utföra mellan laboratorier kalibreringsövningar, och i slutändan för att överföra denna screening teknik till vattenresurser samhälle fortfarande hindras.
Åtminstone en leverantör av försök in vitro granskats genom USA ToxCast programmet är kommersiellt tillgängligt 13 i lätt att använda "frysa och tina4; format. Dessa divisions greps cell "kit" har visat sig vara robust i att mäta aktiviteten av kemikalier som utvinns ur vatten som representerar olika nivåer av behandling 14. Även protokoll leverantörs finns att screena bioaktiviteten av enskilda kemikalier eller blandningar, några av dem måste ändras innan de kan tillämpas på vattenprover. Renade avloppsvattnet avloppsvatten 15, dagvattenavrinning 16, recipienter 17,18 och mer nyligen återvunnet vatten 19,20 är utmärkta exempel på vattenhaltiga medier som är av intresse för vattenkvaliteten samhället.
Denna studie presenterar en enda, standardiserat protokoll för att mäta endokrin aktivitet i vattenprover med hjälp av kommersiellt tillgängliga, division greps in vitro transaktiverande bioanalyser. Vi visade robusthet protokollet genom en övergripande bedömning av bakgrund, dos responsivitet och repeterbarhet av respons för two slutpunkter av särskilt intresse Östrogen och glukokortikoidreceptorn trans (ER och GR, respektive). Protokollet applicerades på skärmen prover av renat avloppsvatten avloppsvatten och dagvatten från sötvattensystem i Kalifornien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samla in och bearbeta vattenprovet (Ändrad från Escher et al. 9)
- Fyll en ren 1 L bärnstensfärgad glasflaska innehållande 1 g natriumazid och 50 mg askorbinsyra till toppen med vattenprovet av intresse. Store provet vid 4 ° C och bearbeta inom 72 timmar.
OBS: Natriumazid är mycket giftig och måste hanteras med försiktighet. Använd skyddsutrustning (ögon- / ansikts, handskar, kläder) och väga in en fungerande rök-huva. Använd inte en metallspatel för vägning. - Sålla provet genom ett 1,6 | iM glasfiberfilter och därefter genom en patron förkonditioneras Solid Phase Extraction (SPE) vid en flödeshastighet av 5-10 ml / min. Justera trycket av vakuumpump för att kontrollera flödeshastigheten.
- Vakuum torka patronen under 15 min.
- Eluera patronen med 10 ml metanol, följt av 10 ml aceton: hexan (1: 1, volym / volym).
- Koncentrera eluatet till ~ 1 ml under en försiktig ström av högrent kväve. Lösningsmedelutbyte genom tillsats av 500 | il dimetylsulfoxid (DMSO) och indunstning av extraktet ned till 500 pl.
- Överför extraktet till en bärnstensfärgad glasautosampler flaska. Förvara vid -20 ° C.
2. Förbered Utspädningar av analysen specifik hänvisning Chemical och vattenextrakt
- Förbered 9 utspädningar för kalibreringskurvan.
- En stamlösning av analysen specifik hänvisning kemikalie i 100% DMSO. Den slutliga koncentrationen måste vara två iM 17β-östradiol för ER-analys, och 100 | iM dexametason för GR-analysen. Lagra förrådslösningar vid -20 ° C.
- Tillsätt 15 pl av den lämpliga referens kemisk lager till 285 pl analysmedium i ett sterilt rör (rör # 1). Blanda provet genom att pipettera upp och ned.
- Tillsätt 200 ul av en lösning av 5% DMSO i analysmedium i 8 andra rör (rör # 2-9).
- Överför en 100 pl alikvot från röret # 1 till röret # 2 till badkare # 9 för att utföra en 3-faldig utspädningsserie. Varje utspätt prov måste blandas noggrant med en pipett innan en portion och lägga till det i nästa rör.
- Framställa ett lösningsmedelskontrollprov genom att blanda 10 | il av DMSO i 190 | il analysmedium.
- Förbered fyra utspädningar för varje vattenextrakt.
- I det första röret, tillsätt 5 mikroliter vatten extrakt i 95 mikroliter av analysmedium och blanda väl. Tillsätt 50 pl av 5% DMSO i analysmedium i tre andra rören.
- Utföra en två-faldig spädning genom att överföra 50 | il av lösningen från ett rör till nästa.
3. Förbered cellsuspensionen att genomföra FRET bioanalys
- Förbered analys specifik mediet i enlighet med tillverkarens instruktioner. Analysmediet måste lagras vid 4 ° C och värmdes till 37 ° C i ett vattenbad före användning.
- Ta en flaska med ER eller GR division greps celler från kryogeniska frizer och tina cellerna snabbt genom att placera ampullen i ett 37 ° C vattenbad under 2 minuter under försiktig omrörning. Sanera flaskan med 70% etanol och placera den i en klass II biologiskt säkerhetsskåp.
- Öppna flaskan med användning av aseptiska tekniker och överföra cellerna till 10 ml analysmedium.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 min.
- Aspirera supernatanten med användning av en steril glas pipett och resuspendera cellpelleten i 6 ml analysmedium.
- Blanda 5 | il av cellsuspension med 5 pl av en vital fläck lösning och tillsätt en alikvot in i en räknekammare.
- Räkna antalet levande celler med användning av ett ljusmikroskop eller automatiserad cellräknare och uppskatta densiteten av levande celler i cellsuspensionen. Späd om nödvändigt för att erhålla en slutlig densitet av 550.000 levande celler per ml analysmedium.
4. Plate Celler i en 96-brunnars svart Vägg Clear-bottnad platta och Lägg Utspädd vattenextrakt
- Skapa en plattalayout som inkluderar en 9-punkts-analys specifik kalibreringskurva, QA / QC prover och multipla utspädningar för varje vattenextrakt. Ett exempel på en 96-brunnars platta layout visas i Figur 1.
- Lägg 90 pl analysmedium till likadana cellfria kontrollbrunnar.
- Häll cellsuspensionen i en steril pipett behållare och tillsätt 90 pl av cellsuspensionen till de andra brunnarna med en multikanalpipett.
- Tillsätt 10 pl av den utspädda prover som framställts under steg 2 till de lämpliga brunnarna. Den slutliga koncentrationen av DMSO per brunn måste vara 0,5% maximum.
- Täck plattan med ett lock och placera den i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C under 16 h.
Figur 1:. Exempel på en 96-brunnar Layout Den flerbrunnsplatta är utformad för att inkludera en analys specifik kalibreringskurva, 3 typerQA / QC kontroller (media endast celler i ren mediet och celler i DMSO spetsade medium) och 4 utspädningar per vattenextrakt. Varje kontroll och spädning av vattenextrakt analyseras i trippelbrunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Förbered Loading Solution och Lägg till varje brunn
- Efter inkubation tillåter plattan att komma i jämvikt till RT. För detta FRET bioanalys, steg 5,2 genom 5,6 bör genomföras i frånvaro av direkt ljus.
- Förbered en 6x laddningslösning enligt tillverkarens anvisningar.
- Tillsätt 20 ul av 6x laddningslösning till varje brunn.
- Tillsätt 10 | il av cellviabilitet reagens till varje brunn för att utvärdera cytotoxiciteten av den utspädda vattenextraktet.
- Förslut plattan med aluminium limfilm.
- Inkubera plattan i mörker vid RT i 2 h.
6. Mät Cytotoxicitet och endokrin aktivitet Response
- Ställa in mikroplattläsare med bottenläsning kapacitet följande tillverkarens instruktioner.
- För FRET trans bioanalys, mäta fluorescens i det blå (409/460 nm, excitation (Ex) / emission (Em) våglängd) och grön (409 Ex / 530 Em nm) kanaler.
- För cytotoxicitetsanalysen, mäta fluorescens vid 560 Ex / 590 Em nm.
7. Bedöm QA / QC kontroller för att avgöra kvaliteten på data
- Jämför den genomsnittliga råa fluorescens av cellfria (medier) och celler endast för (celler i ren analysmedium) kontroller. Medierna endast bakgrundsfluorescens bör vara minst 25% lägre än svaret från celler endast för kontroll.
- Bearbeta rå FRET data. För båda "blå" och "gröna" datamängder, subtrahera den genomsnittliga fluorescens av cellfria kontrollbrunnar från alla mobiltelefoner innehåller väl. beräknablå / grön-förhållande för varje experimentell brunn.
- Jämför blå / grön förhållandet mellan celler skyddade och celler med DMSO kontroller. Fluorescensvärdena för dessa kontroller bör vara inom 15% relativ standardavvikelse (RSD).
- Rita upp analys specifik kalibreringskurva såsom förhållande blått / grönt mot provkoncentration, uttryckt i log molekylmassa (log M). Beräkna lutningen, R2 och logga EC50 (50% effektkoncentration). Kalibreringsparametrar bör ligga inom det förväntade intervallet som anges i tabell 1.
- Beräkna RSD för alla trippelbrunnar. Variationsrikedomen bland replikat bör vara mindre än 20%.
- För data för cytotoxicitet (560 Ex / 590 Em nm), subtrahera den cellfria kontroll genomsnitt (dvs. media bakgrund) från alla cellinnehållande brunnarna.
- Beräkna genomsnittliga bakgrundskorrigerad fluorescens för varje prov. Rita den resulterande fluorescensdata som en procent av DMSO kontroll. Provspäd bör inteuppvisar mer än 20% celldöd jämfört med celler enbart och DMSO kontroller.
8. Dataanalys
- Beräkna analysdetektionsgräns (LOD) som minsta kalibreringssvaret plus två standardavvikelser från medelvärdet av detta svar.
- Om proverna inte uppvisar en dos-respons, härleda EC50 av vattenextraktet med hjälp av lutningen av en linjär regression av kalibreringskurvan mellan 10 och 50% effektkoncentrationer hos referens kemikalien.
- Beräkna Bioanalytical ekvivalent koncentration (BEQ) med formeln: BEQ = EC50 referens kemisk / EG 50 av vattenprov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den aktuella studien var 4x 24 tim sammansatta prover av renat kommunalt avloppsvatten avloppsvatten, 6 ta prover av ytvatten från sötvattensystem i södra Kalifornien och en fältet tomt bestående av ultrarent vatten väljs för att illustrera detta protokoll. 3 av de 4 utflödesproverna från konventionella aktiverade slam reningsverk ( "sekundärt utflöde"), och den fjärde från en avancerad avloppsreningsverk med sand / kolfilter sätts efter biologisk behandling ( "tertiär utflöde"). Ytvattenprover togs från avrinningsområden som representerar olika markanvändning (öppen, jordbruk och urban).
Spädningar av de vattenextrakt uppvisade ingen uppenbar cytotoxicitet med mindre än 20% cell mortalitet jämfört med DMSO kontroller (tabell 1). Cellfria (medier) bakgrund var låg, och cÄMFÖRELSE mellan celler skyddade och celler med DMSO svar indikerade att lösningsmedlet hade ingen mätbar effekt på fluorescensmätningar. Parametrar för analys specifika kalibreringskurvor, inklusive lutning och logga EG 50, var inom intervallet av godtagbara historiska värden (tabell 1) visar på en god reproducerbarhet av de kalibreringskurvor över tiden. Ett exempel på acceptabel kalibreringskurva för ER-analysen visas i Figur 2. Valet av 17β-östradiol och dexametason som referenskemikalier var baserad på styrkan av testsvaret, sannolikheten för förekomst i behandlat avloppsvatten och historisk användning av andra forskare 20- 22. Variationen i svaret bland trippelprover var mindre än 20% RSD. Således var all data bedöms vara av godtagbar kvalitet, och därefter används för att uppskatta ER och GR bioaktivitet (uttryckt som BEQ i ng / L) i avlopps- och dagvattenprover.
(Figur 3). Men ytvattenextrakt inte stark ER eller GR-aktivitet. Trots en REF av 10, de fluorescerande svaren var ofta nära eller under LOD. Frånvaron av bioassay svar för fältet tomt bekräftat att de upptäckter som nämnts ovan LOD var inte ett resultat av provtagning eller formella lab artefakter.
ER och GR aktiviteter upptäcktes i 7 och 4 av de 10 representativa vattenprover, respektive (tabell 2), med den högsta av BEQs av 17 ng E2 / L och 392 ng Dex / L finns i de sekundära utsläpp. GR-aktiviteten i provet tertiär utflödet var under bioanalys LOD. Likaså de flesta ytvattenprover uppvisade ingen GR aktivitet över LOD och mycket lägre nivåer av ER-aktivitet än de sekundära utsläpp.
Figur 2:. Exempel på Kalibreringskurva för ER-analys Den dos-responskurva, inprickade som medelfluorescensförhållandet (± SEM), är sigmoidal och används för att bestämma de EG 10 och EC 50-värden. Denna del av kurvan monteras med linjär regression och används för att härleda en bioanalys motsvarande koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
les / ftp_upload / 54.725 / 54725fig3.jpg "/>
Figur 3:. Mean Blå / grön fluorescens Ratio (± SEM) av vattenprover avsatt mot theRrelative anrikningsfaktor Bioassay ekvivalenta koncentrationer (BEQ) beräknas för prover vars utspädningsserie visar en koncentrationsberoende respons med ett minimum av två punkter över gränsen detektions~~POS=TRUNC (LOD). klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Östrogenreceptorn (ER) Analys | Glukokortikoidreceptorn (GR) Analys | |||
| studieresultat | Acceptanskriterier | studieresultat Acceptanskriterier | ||
| kalibreringsparametrar | ||||
| Logaritmiska medelvärdet EC50 (M) | -9,6 | -10,1 Till -9,1 | -8,5 | -9,0 Till -8,0 |
| genomsnittlig lutning | 1,1 | 0,9-1,5 | 2,0 | 1,8-2,4 |
| R2 | 0,99 | > 0,95 | 0,99 | > 0,95 |
| QA / QC-kontroller | ||||
| media bakgrund | ja | bara media <cell + media | ja | bara media <cell + media |
| Cytotoxicitet (% mortalitet) | 0% | <20% dödlighet | 0-5% | <20% dödlighet |
| Prov precision (% RSD) </ Td> | 2 till 18% | <20% | 4-13% | <20% |
Tabell 1: Sammanfattning av QA / QC resultat från Bioanalytiska Screening av renat avloppsvatten spillvatten och ytvattenproverna.
| Prov-ID och beskrivning | ER-BEQ (ng E2 / L) | GR-BEQ (ng Dex / L) |
| A - final avloppsvatten från fullständig sekundär reningsverk | 6,4 | 248 |
| B - final avloppsvatten från fullständig sekundär reningsverk | 13 | 392 |
| C - slutliga utsläppet från fullständig sekundär reningsverk | 17 | 236 |
| D - final avloppsvatten från tertiär rening plant | 2,3 | <22 |
| E - ytvatten från jordbruksmark | <0,5 | 30 |
| F - ytvatten från jordbruksmark | <0,5 | <22 |
| G - ytvatten från tätort | 4 | <22 |
| H - ytvatten från tätort | 0,9 | <22 |
| I - ytvatten från öppet fält | 0,8 | <22 |
| J - ytvatten från öppet fält | <0,5 | <22 |
| K - fältet tomt (ultrarent vatten) | <0,5 | <22 |
Tabell 2: Bioassay ekvivalenta koncentrationer för östrogenreceptorn (ER-BEQ) och glukokortikoidreceptorn (GR-BEQ) ac. vitet Tre typer av prover som samlats i Kalifornien (USA) analyseras: kommunalt avloppsvatten avloppsvatten (AD), ytvatten (EJ), och fältet tomt (K).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den väl dokumenterade styrka miljö östrogener, såsom 17β-estradiol (E2), teckningsoptioner screening för dessa kemikalier i ng / L koncentrationer 23,24. I denna studie, ER svaret för avloppsvatten utsläpp (BEQ intervall: 2,3-17 ng E2 / L) var något högre än vad som rapporterats för sekundärt utflöde från australiska reningsverk 20, medan BEQs för ytvatten (<0,5 till 4 ng E2 / L ) var inom intervallet rapporterats för yta och dagvatten på annat håll (<1 till 11 ng E2 / L) 16. Trots de låga nivåer av ER-aktivitet som uppmätts i ytvattenprover representerar denna analys en relevant screening slutpunkt för bedömning av vattenkvaliteten. Östrogener såsom bisfenol A och alkylfenol ytaktiva ofta upptäcks i vattenmiljön, men de kan vara svåra att kvantifiera med konventionell analytisk kemi. ER-cellanalyser kan även vara användbar för screening av närvarande och nyregistrerade bekämpningsmedel, vilket framgår av Kojima et al25.
GR aktivitet översteg ER-aktivitet genom en storleksordning i alla 4 utflödes prover som analyserats i denna studie (Tabell 2). Denna trend är i linje med tidigare studier på avloppsvatten som 14, och intervallet för GR-BEQs rapporteras här är något högre men jämförbar med den som rapporterats för andra sekundära utsläpp använder samma in vitro bioanalys 12. Med hjälp av en annan cell bioanalys, intervallet för GR-BEQs för avloppsvatten från reningsverk i Japan var lägre (<3-78 ng Dex / L) än de som rapporterats för sekundärt utflöde i denna studie 22. Med undantag av den inre ytan vattenprovet som registrerats högst GR svar av 30 ng Dex / L (Tabell 2, prov E), GR aktivitet i de återstående ytvattenproverna överensstämde med den låga aktiviteten rapporterats för nederländska ytvatten 21 . Men miljö impakt för GR aktiva kemikalier mindre väl karakteriserade än för ER aktiva kemikalier 26, vilket gör bedömning av risken för högre ordningens effekter en utmaning.
Som med konventionell kemisk analys, att ansluta sig till skriftliga protokoll och validering av mätningar med en prestationsbaserad QA / QC tillvägagångssätt maximerar datakvalitet och robusthet. Även validering av cell bioanalyser anpassade för bedömning av vattenkvaliteten kommer att fortsätta att utvecklas och förbättras, mätning av QA / QC parametrar som först beskrevs i et al. Mehinto 14 och tillämpas på denna studie visade att våra resultat var väl inom fördefinierade riktvärden (Tabell 1 ). Kalibreringskurvan parametrarna för dessa bioanalyser spegla de som används för att kalibrera andra analysprotokoll (t.ex. GC-MS), med tillägg av kriterier som bedömer cellernas viabilitet (t.ex. cytotoxicitet) representerar den största skillnaden. En annan operativskillnad som möjliggörs med användning av celler i en hög genomströmning format är införandet av multipla provspädningar som illustrerar beroende svar koncentrationen förväntas när bioaktivitet mäts (fig. 2). Vid granskningen provmätningar, den lägre ER och GR svar för den tertiära utflödet (prov D) jämfört med de tre sekundärt utflöde prov (AC) ger ytterligare bevis på den relativa noggrannheten hos våra bioanalys screeningresultat i tabell 2. Införande av kontroll eller referensprover som representerar matrisen av intresse, i detta fall vatten, skulle ytterligare öka förmågan att jämföra bioanalysresultaten inom och i synnerhet över mätning enheter.
Svaren från ER och GR transaktiverings cellinjer som används i denna studie uttrycktes i förhållande till aktiviteten hos de starka agonister E2 och dexametason, respektive. Detta möjliggör en kvantitativ bedömning av bioaktiviteten uttryckt ensa Bioanalys ekvivalent koncentration (BEQ). Detta möjliggör vidare för undersökning av kemikalier som bidrar till bioanalys svar, det vill säga en direkt jämförelse mellan BEQs med koncentrationer av enskilda agonister bestäms via konventionell analytisk kemi. Detta koncept stryker den extra nyttan av bioscreening att rikta diagnostisk undersökning av orsakande medel, även känd som effekter riktade analys.
Eftersom SPE används rutinmässigt för att isolera ett stort antal läkemedel och andra "emerging föroreningar" från vatten, använde vi en tidigare publicerat protokoll 9, 20 som innehöll en sorbent utformade för att fånga både hydrofila och hydrofoba kemikalier i vatten. Även om vi antar kvantitativ fånga alla bioaktiva organiska föreningar med hjälp av denna teknik, krävs ytterligare arbete för att till fullo standardisera och validera genomförandet av sådana utvinningsmetoder. Den typ av cellanalys som användes i denna studie kan presenteraen annan begränsning. Dessa analyser mäter samspelet mellan föroreningar och nukleära receptorer och inte tar hänsyn till andra möjliga interaktioner, såsom kemisk-membranreceptor. Således är det möjligt att screening svar uppmätta här underskattades. Liksom provet tas det inte finns några standardiserade metoder för att analysera cellanalysuppgifter och olika metoder kan ge olika resultat. Den linjära regressionen användes i denna studie för att modellera svaret för den nedre halvan av kalibreringskurvan får inte vara lämplig för alla cellanalyser, särskilt om modellerade svar förlängs utöver den relativt snävt intervall som anges i den aktuella studien. Ytterligare undersökning av ovanstående frågor behövs för att förstå i vilken utsträckning dessa verktyg kan användas som ett kraftfullt verktyg för övervakning.
Medan en stor del av grunden är lagd för ER och GR som skärmar för endokrina aktiva kemikalier, forskare bredda omfattningen avbioanalytiska verktyg för att inkludera andra relevanta verkningsmekanismer, t.ex. androgenicity, genotoxicitet, neuro och immunotoxicitet 9,27. En mer komplett verktygslåda kommer att öka förmågan att screena för bioaktiva kemikalier, inklusive omvandlingsprodukter kända och / eller okända kemikalier som kan uppstå 28, nu och i framtiden, i olika vattenmiljöer 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
