Abstract
Em bioensaios de transactivação in vitro mostraram promissores como ferramentas de monitoramento de qualidade da água, no entanto a sua adopção e aplicação generalizada tem sido dificultada em parte devido à falta de métodos padronizados e disponibilidade de tecnologia robusta, fácil de usar. Neste estudo, as linhas celulares, prendeu-divisão comercialmente disponíveis foram utilizados para rastrear quantitativamente para a actividade endócrina de produtos químicos presentes em amostras de água de interesse para os profissionais de qualidade ambiental. Um protocolo único, padronizado, que incluiu garantia de qualidade / controlo de qualidade (QC / QA) controlos foi desenvolvido para actividade de estrogénio e Receptor de Glucocorticóides (ER e GR, respectivamente), utilizando um ensaio baseado em células de Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (TERF). Amostras de efluente tratado municipal de águas residuais e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia (EUA), foram extraídos utilizando extração em fase sólida e analisados para a atividade endócrina usando o proto padronizadocol. Antecedentes e dose-resposta para as substâncias químicas de referência específicos do endpoint conheceu diretrizes QA / QC consideradas necessárias para a medição confiável. A resposta de rastreio de bioensaio para as amostras de água de superfície não foi detectável em grande parte. Em contraste, amostras de efluentes de estações de tratamento secundário teve a maior actividade mensurável, com concentrações equivalentes bioensaios estimado (BEQ) até 392 ng dexametasona / L para o GR e 17 ng 17β-estradiol / L para ER. O bioensaio de resposta para uma amostra de efluente terciário foi menor do que o medido para os efluentes secundários, indicando uma residual menor de produtos químicos activos endócrinos após o tratamento avançado. Este protocolo mostrou que em bioensaios de transactivação in vitro que utilizam comercialmente disponíveis, células preso por divisão "kits", pode ser adaptado para o rastreio de actividade endócrina em água.
Introduction
monitoramento da qualidade da água corrente baseia-se na capacidade de medir com precisão e precisamente a ocorrência de contaminantes químicos como um proxy para a exposição a animais selvagens e seres humanos. No entanto, esta monitorização química-by-químicas e paradigma de avaliação não pode manter o ritmo com o universo química em constante mudança que enfrentamos. À medida que aprendemos mais sobre o destino e os efeitos dos produtos químicos sintéticos e naturais, continuamos a procurar instrumentos de medição que tratem esperados impactos biológicos, e que ao mesmo tempo são imunes às mudanças na produção de químicos, uso e entrada ambiental. Tais ferramentas são especialmente relevantes para a compreensão se os produtos químicos desconhecidos ou novos, e produtos de transformação, merecem a nossa atenção. Além disso, misturas complexas de produtos químicos presentes na água são pouco abordado pela monitorização química individual. Assim, enfrentamos o desafio de modernizar a caixa de ferramentas de monitoramento existente para melhor enfrentar estas questões nas águas de superfície that receber a descarga de efluentes de esgoto tratado e do escoamento / águas pluviais urbanas.
Nos últimos anos, as técnicas bioanalíticos mostraram-se promissores como ferramentas de triagem para avaliação da qualidade da água. Em particular, os bioensaios, in'vitro que respondem a produtos químicos que actuam via conhecida, modos de acção específicos 1,2 são de grande interesse para a comunidade de monitoramento ambiental 3. Numerosas investigações têm empregado em bioensaios in vitro para quantificar a atividade endócrina de beber, de superfície e águas residuais 4 -6. Além disso, uma série de bioensaios alvo eventos iniciadores moleculares (por exemplo, a activação do receptor), que pode, potencialmente, ser associados a efeitos deletérios através de via adverso resultado analisa 7,8.
A evolução da bioscreening para a avaliação da qualidade da água foi relativamente rápida, com centenas de diferente em endpoints bioensaios in vitro tendo sido avaliados quanto à sua9,10 utilidade. Atualmente, apenas um punhado de bioensaios foram mostrados para alcançar uma boa precisão da medição (em laboratórios), demonstrando a capacidade de diferenciar entre qualidades de água 5,6. Para efluentes de esgoto tratado em particular, a ocorrência de estrogénios e esteróides glicocorticóides tem sido com sucesso contabilizado usando em ensaios de transactivação in vitro 11,12. bioensaios No entanto, a maioria dos estudos até à data têm empregados cujas linhas celulares são proprietários (e, portanto, não estão amplamente disponíveis), requerem cuidados continuados e manipulação, ou ambos. Como resultado, a capacidade de padronizar protocolos, realizar exercícios de calibração inter-laboratoriais, e, finalmente, para transferir essa tecnologia de triagem para os recursos hídricos da Comunidade permanece prejudicada.
Pelo menos um fornecedor de bioensaios in vitro controlados através do programa US ToxCast está disponível comercialmente 13 em fácil de usar "de congelação e descongelação4; formatos. Estes "kits" de células-preso divisão foram mostrados para ser robusto para medir a actividade de produtos químicos extraído da água que representam diferentes níveis de tratamento 14. Embora os protocolos do fornecedor estão disponíveis para pesquisar a bioactividade de produtos químicos individuais ou misturas, alguns deles necessitam de modificação antes de poderem ser aplicados a amostras de água. Efluente tratado de águas residuais 15, escoamento de águas pluviais 16, águas receptoras 17,18 e, mais recentemente reciclado 19,20 água são exemplos de meios aquosos que são de interesse para a comunidade de qualidade da água.
Este estudo apresenta um protocolo único, padronizado para medir a atividade endócrina em amostras de água usando comercialmente disponíveis, por divisão de presos em bioensaios de transactivação in vitro. Nós demonstramos robustez do protocolo através de uma avaliação abrangente de fundo, a dose de responsividade e repetibilidade da resposta para twO endpoints de particular estrogênio juros e glicocorticóides Receptor transativação (ER e GR, respectivamente). O protocolo foi aplicado em amostras de tela de efluentes de esgoto tratado e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Recolha e da Amostra de Água de Processo (Modificado de Escher et al. 9)
- Encha uma garrafa de vidro âmbar 1 L limpo contendo 1 g de azida de sódio e 50 mg de ácido ascórbico ao topo com amostra de água de interesse. amostra Armazenar a 4 ° C e processo dentro de 72 h.
NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico e devem ser manuseados com cuidado. Use equipamento de proteção (para os olhos / rosto, luvas, roupas) e pesar em um fume-hood que funcione correctamente. Não use uma espátula de metal para pesagem. - Fazer passar a amostra através de um filtro de fibra de vidro de 1,6 uM e, em seguida, através de um cartucho de pré-condicionados Fase de extracção sólido (SPE) com um caudal de 5-10 ml / min. Ajustar a pressão da bomba de vácuo, para controlar a taxa de fluxo.
- Vácuo secar o cartucho durante 15 min.
- Elui-se o cartucho com 10 ml de metanol, seguido por 10 mL de acetona: hexano (1: 1, v / v).
- Concentre-se eluído até ~ 1 ml sob uma corrente suave de azoto de elevada pureza. Solventetroca por adição de 500 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) e evaporar o extracto até à 500 ul.
- Transfira o extrato para um frasco de amostrador automático de vidro âmbar. Armazenar a -20 ° C.
2. Preparar diluições do ensaio específico Chemical Referência e Extrato de Água
- Preparar diluições 9 para a curva de calibração.
- Faça uma solução estoque do produto químico referência específica ensaio em DMSO a 100%. A concentração final deve ser de 2 uM 17β-estradiol ER para o ensaio, e 100 ^ M de dexametasona para o ensaio de GR. Armazenar as soluções de reserva a -20 ° C.
- Adicionar 15 ul de estoque a química de referência apropriado para 285 ul de meio de ensaio em um tubo estéril (tubo # 1). Misturar a amostra pipetando para cima e para baixo.
- Adicionar 200 ul de uma solução de 5% de DMSO em meio de ensaio em 8 tubos adicionais (tubos # 2-9).
- Transferir uma alíquota de 100 ul de tubo para tubo # 1 # 2 através de banheiraE # 9 para realizar uma série de diluições de 3 vezes. Cada amostra diluída deve ser misturado com uma pipeta antes de tomar uma alíquota e adicioná-lo para o próximo tubo.
- Prepara-se uma amostra de controlo de solvente por mistura de 10 ul de DMSO em 190 ul de meio de ensaio.
- Prepare quatro diluições para cada extracto de água.
- No primeiro tubo, adicionam-se 5 ul de extracto de água em 95 mL de meio de ensaio e misturar completamente. Adicionar 50 ul de 5% de DMSO em meio de ensaio em três outros tubos.
- Efectuar uma diluição de 2 vezes, transferindo 50 ul de solução a partir de um tubo para o outro.
3. Prepare a suspensão de células para conduzir a FRET Bioensaio
- Prepara-se o meio específico de ensaio de acordo com as instruções do fabricante. O meio de ensaio devem ser armazenados a 4 ° C e aquecida até 37 ° C num banho de água antes da utilização.
- Tome um frasco de células prendeu-divisão ER ou GR fora do livre criogênicozador e descongelar as células rapidamente, colocando o frasco num banho de água a 37 ° C durante 2 min com agitação suave. Descontaminar o frasco com 70% de etanol e colocá-lo em uma cabine de segurança biológica Classe II.
- Abrir o frasco utilizando técnicas assépticas e transferência das células para 10 ml de meio de ensaio.
- Centrifuga-se a 200 x g durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante utilizando uma pipeta de vidro estéril e ressuspender o sedimento de células em 6 ml de meio de ensaio.
- Misturar 5 ul de suspensão de células com 5 ul de uma solução de corante vital e adiciona-se uma alíquota para uma câmara de contagem.
- Contar o número de células vivas utilizando um microscópio de luz ou contador de células automatizado e estimar a densidade de células vivas na suspensão de células. Dilui-se necessário para se obter uma densidade final de 550.000 células vivas por ml de meio de ensaio.
4. Células placa numa placa com 96 poços Black Wall Clear-fundo e adicione o extrato de água diluído
- Criar uma placalayout que inclui uma curva de 9 pontos ensaio de calibração específica, as amostras de QA / QC e múltiplas diluições para cada extracto de água. Um exemplo de uma disposição da placa de 96 poços é mostrado na Figura 1.
- Adicionar 90 ul de meio de ensaio para os poços de controlo isentos de células em duplicado.
- Verter a suspensão de células em um reservatório de pipetagem estéril e adicionar 90 ul de suspensão de células para os outros poços utilizando uma pipeta multicanal.
- Adicionam-se 10 ul das amostras diluídas preparada durante o passo 2 aos poços apropriados. A concentração final de DMSO por poço deverá ser de 0,5%, no máximo.
- Cobrir a placa com uma tampa e coloca-se numa incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C durante 16 horas.
Figura 1:. Exemplo de uma disposição da placa de 96 poços A placa de multi-poços é concebido para incluir uma curva de calibração específica ensaio, 3 tiposde controles de QA / QC (mídia só, células em meio limpo e células em DMSO cravado média) e 4 diluições por extrato de água. Cada controle e diluição do extrato de água é analisada em poços em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Prepare o Loading Solution e adicione a cada poço
- Após a incubação, permitem que a placa equilibrar à temperatura ambiente. Para este ensaio biológico FRET, os passos 5.2 através de 5.6 deve ser realizada na ausência de luz direta.
- Prepara-se uma solução de 6x carregamento de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicionar 20 ul da solução de carregamento 6x a cada poço.
- Adicionar 10 ul de reagente de viabilidade celular para cada poço, para avaliar a citotoxicidade do extracto aquoso diluído.
- Selar a placa com película adesiva de alumínio.
- Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 2 h.
6. A citotoxicidade Medir e Endocrine Atividade Response
- Configurar o leitor de microplacas com capacidade de leitura de baixo para seguir as instruções do fabricante.
- Para a transativação bioensaio FRET, medir a fluorescência no azul (409/460 nm, excitação (Ex) / emissão (Em) comprimento de onda) e verde (409 Ex / 530 nm) o Em canais.
- Para o ensaio de citotoxicidade, medir a fluorescência a 560 Ex / 590 Em nm.
7. Avaliar QA / QC verificações para determinar a qualidade dos dados
- Compare a fluorescência em bruto médio da livre de células (media only) controles e as células-only (células em meio de ensaio limpo). O fundo de fluorescência só de meios de comunicação deve ser de pelo menos 25% menor do que a resposta de células de controlo apenas.
- Processar os dados FRET-primas. Para ambos os "azuis" e conjuntos de dados "verdes", subtrair a fluorescência média dos poços de controlo sem células de toda célula que contém também. Calcula-se arácio azul / verde para cada poço experimental.
- Compare rácio azul / verde de células-only e células com controles DMSO. valores de fluorescência destes controlos deve estar dentro de 15% desvio padrão relativo (RSD).
- Traçar a curva de calibração específica ensaio como azul rácio / verde contra a concentração da amostra expresso como uma massa molecular (log M). Calcular a inclinação, R 2 e EC 50 (50% Concentração de efeito) log. Os parâmetros de calibração deve estar dentro do intervalo esperado listados na Tabela 1.
- Calcular o RSD para todos os poços em triplicado. A variabilidade entre as repetições deve ser inferior a 20%.
- Para os dados de citotoxicidade (560 Ex / Em 590 nm), subtrair a média de controlo isenta de células (isto é, meios de fundo) a partir de todas as cavidades contendo células.
- Calcula-se a fluorescência média subtraído-fundo para cada amostra. Plotar os dados de fluorescência resultantes como uma percentagem do controlo DMSO. diluições de amostras não deveexibem mortalidade celular mais do que 20% em comparação com os controlos de células únicas e DMSO.
8. Análise de Dados
- Calcular o limite de detecção do ensaio (LOD) como o mínimo de resposta de calibração mais dois desvios padrão da média do que a resposta.
- Para amostras que apresentam uma resposta à dose, derivar o EC50 o extracto de água utilizando a inclinação de uma regressão linear da curva de calibração entre 10 e 50% concentrações efeito dos químicos de referência.
- Calcular a concentração bioanalíticos Equivalent (BEQ) utilizando a fórmula: BEQ = EC 50 de química de referência / CE de 50 de amostra de água.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
No presente estudo, foram selecionadas amostras de 4x 24 hr compostas de efluentes de águas residuais municipais tratadas, 6 amostras de caçamba de águas de superfície de sistemas de água doce no sul da Califórnia e um campo em branco que consiste em água ultrapura para ilustrar este protocolo. 3 das amostras 4 de efluentes eram de plantas convencionais de tratamento de lamas activadas de águas residuais ( "efluente secundário"), e o quarto a partir de uma estação de tratamento de águas residuais avançada com filtro de areia / carbono adicionado após o tratamento biológico ( "efluente terciário"). amostras de águas superficiais foram coletadas de bacias hidrográficas representativas de uso da terra diferente (aberta, agrícola e urbano).
As diluições de água os extractos mostraram citotoxicidade não aparente com a mortalidade de células menor do que 20% em comparação com a dos controlos de DMSO (Tabela 1). -Cell livre (media only) de fundo era baixa, ea cOMPARAÇÃO entre as células-only e células com respostas DMSO indicou que o solvente não teve qualquer impacto mensurável sobre as medições de fluorescência. Parâmetros das curvas de calibração de ensaio específicos, incluindo inclinação e log CE 50, estavam dentro da gama de valores históricos aceitáveis (Tabela 1) demonstram uma boa reprodutibilidade das curvas de calibração ao longo do tempo. Um exemplo de curva de calibração para o ensaio aceitável ER é mostrado na Figura 2. A selecção de 17β-estradiol e dexametasona como produtos químicos de referência foi baseada na força da resposta do ensaio, a probabilidade de ocorrência de águas residuais tratadas e uso histórico por outros investigadores 20- 22. A variabilidade na resposta entre amostras em triplicado foi inferior a 20% RSD. Assim, todos os dados foram considerados como sendo de qualidade aceitável, e, subsequentemente, foram utilizados para estimar o ER e GR bioactividade (expresso em BEQ em ng / L) em amostras de água de esgoto e de superfície.
(Figura 3). No entanto, extratos de água de superfície não mostraram forte ER ou actividade GR. Apesar de um REF de 10, as respostas fluorescentes eram muitas vezes perto ou abaixo do LOD. A ausência de respostas de bioensaios para o campo em branco confirmou que as detecções observados acima LOD não eram o resultado de amostragem ou de laboratório processual artefatos.
Actividades de ER e de GR foram detectados em 7 e 4 das 10 amostras de água representativos, respectivamente (Tabela 2), com a mais alta de BEQ de 17 ng E2 / G e 392 ng Dex / L encontrados nos efluentes secundários. A actividade de GR na amostra de efluente terciário foi abaixo do limite de determinação do bioensaio. Da mesma forma, a maioria das amostras de águas superficiais apresentaram nenhuma atividade GR acima LOD e níveis muito mais baixos de atividade ER do que os efluentes secundários.
Figura 2:. Exemplo de Curva de calibração para o ensaio de ER A curva de dose-resposta, representada graficamente como a relação de fluorescência média (± SEM), é sigmoidal e utilizado para determinar os valores CE 10 e CE 50. Esta parte da curva é montado por meio de regressão linear e utilizado para obter uma concentração equivalente bioensaio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
les / ftp_upload / 54725 / 54725fig3.jpg "/>
Figura 3:. Média azul / Proporção verde fluorescência (± SEM) de amostras de água representada graficamente contra theRrelative fator de enriquecimento bioensaio concentrações equivalentes (BEQ) são calculados para amostras cuja série de diluição mostram uma concentração dependente da resposta com um mínimo de dois pontos acima do limite de detecção (LOD). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Receptor de estrogênio (ER) Assay | Glucocorticóide Receptor (GR) Assay | |||
| Os resultados do estudo | critérios de aceitação | Os resultados do estudo critérios de aceitação | ||
| parâmetros de calibração | ||||
| A média de log EC50 (M) | -9.6 | -10,1 Para -9,1 | -8.5 | -9.0 A -8.0 |
| declive médio | 1.1 | 0,9-1,5 | 2.0 | 1,8-2,4 |
| R2 | 0.99 | > 0,95 | 0.99 | > 0,95 |
| Controles de QA / QC | ||||
| fundo de mídia | sim | mídia somente <celular + media | sim | mídia somente <celular + media |
| Citotoxicidade (% de mortalidade) | 0% | <20% de mortalidade | 0 a 5% | <20% de mortalidade |
| precisão da amostra (% RSD) </ Td> | 2 a 18% | <20% | 4 a 13% | <20% |
Tabela 1: Resumo dos resultados de QA / QC Desde bioanalíticos Triagem de águas residuais tratadas de efluentes e de superfície amostras de água.
| ID da amostra e Descrição | ER-BEQ (E2 ng / L) | GR-BEQ (Dex ng / L) |
| A - efluente final da estação de tratamento secundário completo | 6.4 | 248 |
| B - efluente final da estação de tratamento secundário completo | 13 | 392 |
| C - efluente final da estação de tratamento secundário completo | 17 | 236 |
| D - efluente final do tratamento terciário plant | 2.3 | <22 |
| E - águas superficiais da área agrícola | <0,5 | 30 |
| F - águas superficiais da área agrícola | <0,5 | <22 |
| G - águas superficiais da área urbana | 4 | <22 |
| H - águas superficiais da área urbana | 0,9 | <22 |
| I - águas superficiais de campo aberto | 0,8 | <22 |
| J - águas superficiais em campo aberto | <0,5 | <22 |
| K - campo em branco (água ultrapura) | <0,5 | <22 |
Tabela 2: bioensaios concentrações equivalentes de receptor de estrogênio (ER-BEQ) e glicocorticóides Receptor (GR-BEQ) ac. tivity Três tipos de amostras coletadas na Califórnia (EUA) são analisados: efluente municipal de águas residuais (AD), água de superfície (EJ) e campo em branco (K).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A potência bem documentado de estrogênios ambientais, tais como 17β-estradiol (E2), triagem mandados para esses produtos químicos em / L concentrações ng 23,24. Neste estudo, a resposta ER para os efluentes de águas residuais (gama BEQ: 2,3-17 ng E2 / G) era um pouco mais elevada do que a relatada para o efluente secundário de ETAR Australiana 20, ao passo que os BEQ para as águas superficiais (<0,5 a 4 ng E2 / G ) estavam dentro da faixa relatada para a superfície e águas pluviais em outros lugares (<1 a 11 ng E2 / L) 16. Apesar dos baixos níveis de atividade ER medidos nas amostras de água de superfície, este ensaio representa um ponto final rastreio relevante para a avaliação da qualidade da água. Estrogénios tais como tensioactivos bisfenol A e de alquilfenóis são frequentemente detectada no meio aquático, mas eles podem ser difíceis de quantificar utilizando química analítica convencional. ensaios de células ER também pode ser útil para a triagem de pesticidas actualmente e recém-registrados, como mostrado por Kojima et al25.
A actividade de GR excedia a actividade do ER por uma ordem de grandeza em todas as 4 amostras de efluentes analisadas neste estudo (Tabela 2). Esta tendência é consistente com estudos anteriores sobre efluentes de águas residuais 14, e o intervalo para GR-BEQ relatado aqui é um pouco maior, mas comparável ao relatado para outros efluentes secundários utilizando o mesmo ensaio biológico in vitro 12. Usando um bioensaio de células diferentes, o intervalo para GR-BEQ de efluentes de estações de tratamento de águas residuais no Japão foi menor (<3 e 78 ng de Dex / L) do que as relatadas para efluente secundário no presente estudo 22. Com a excepção da amostra de água única superfície que registada uma resposta máxima gr de 30 ng de Dex / L (Tabela 2, amostra E), a actividade de GR nas amostras de água restante superfície era consistente com a baixa actividade relatados para a superfície holandesa águas 21 . No entanto, a im ambientalpacto para produtos químicos ativos GR é menos bem caracterizado que para ER químicos ativos 26, tornando a avaliação do potencial para efeitos de ordem superior um desafio.
Tal como acontece com a análise química convencional, a adesão aos protocolos escritos e validação de medições usando um controle de qualidade com base no desempenho / abordagem QC maximiza a qualidade dos dados e robustez. Apesar de validação de bioensaios celulares adaptados para avaliação da qualidade da água vai continuar a evoluir e melhorar, a medição dos parâmetros de QA / QC descritas pela primeira vez em Mehinto et al. 14 e aplicados a este estudo mostrou que nossos resultados foram bem dentro dos valores-guia pré-especificados (Tabela 1 ). Os parâmetros curva de calibração para estes espelham os bioensaios utilizados para calibrar outros protocolos analíticos (por exemplo, GC-MS), com a adição de critérios para avaliar a viabilidade das células (por exemplo, citotoxicidade) que representa a diferença principal. outra operacionaldiferença tornou possível o uso de células em um formato de alto rendimento, é a inclusão de várias diluições de amostras que ilustram a resposta dependente da concentração esperada quando bioactividade é medida (Figura. 2). Ao rever as medidas de amostras, o ER inferior e respostas GR para o efluente terciário (amostra D) em comparação com os três amostras de efluentes secundários (AC) fornece uma evidência adicional da precisão relativa dos nossos resultados de rastreio bioensaio na Tabela 2. Incorporação de controlo ou amostras de referência que representam a matriz de interesse, neste caso a água, iria aumentar ainda mais a capacidade de comparar os resultados de bioensaios dentro e, especialmente, entre as entidades de medição.
As respostas das linhas celulares de ER e de transactivação GR utilizados neste estudo foram expressos relativamente à actividade dos agonistas fortes E2 e dexametasona, respectivamente. Isto permite uma estimativa quantitativa da bioactividade expressa umsa Bioensaio concentração equivalente (BEQ). Isto permite ainda para a investigação de substâncias que contribuem para a resposta do bioensaio, ou seja, uma comparação directa da BEQ com concentrações de agonistas individuais determinados através de química analítica convencional. Este conceito sublinha a utilidade adicional de bioscreening em dirigir investigação diagnóstica de agentes causadores, também conhecido como análise de efeitos-dirigida.
Desde SPE é rotineiramente usado para isolar uma ampla gama de produtos farmacêuticos e outros contaminantes emergentes "" a partir de água, é empregue um protocolo previamente publicado em 9, 20, que apresentava um adsorvente concebida para capturar substâncias químicas ambos hidrofílicos e hidrofóbicos na água. Apesar de assumir a captura quantitativa de todos os compostos orgânicos bioactivos utilizando esta técnica, o trabalho adicional é necessário para padronizar totalmente e validar o desempenho de tais métodos de extração. O tipo de ensaio de células empregues neste estudo pode apresentaroutra limitação. Estes ensaios medem as interações entre contaminantes e receptores nucleares e não levam em conta outros possíveis interacções, tais como receptor químico-membrana. Assim, é possível que as respostas de rastreio aqui medidos foram subestimada. Como a extração de amostra, não há métodos padronizados para analisar os dados do ensaio celular e abordagens diferentes podem produzir resultados diferentes. A regressão linear utilizado neste estudo para modelar a resposta para a metade inferior da curva de calibração pode não ser apropriado para todos os ensaios de células, particularmente se a resposta modelado é estendida para além da gama relativamente estreita especificado no presente estudo. investigação adicional para as questões acima são necessárias para entender a extensão em que essas ferramentas podem ser aplicados como uma ferramenta de monitoramento robusto.
Considerando que grande parte do trabalho de base está sendo colocada para o ER e GR como telas para produtos químicos ativos endócrinas, os investigadores estão a alargar o âmbito dasferramentas bioanalíticos para incluir outro modo relevante de ações, por exemplo, androgenicidade, genotoxicidade, neurotoxicidade e imunotoxicidade 9,27. Uma caixa de ferramentas mais completo irá reforçar a capacidade de rastreio de substâncias químicas bioativas, incluindo produtos de transformação de produtos químicos conhecidos ou desconhecidos e / que podem ocorrer 28, agora e no futuro, em vários ambientes aquáticos 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
