Abstract
في اختبارات بيولوجية transactivation المختبر أظهرت وعد كأدوات مراقبة نوعية المياه، لكن اعتمادها وتطبيقها على نطاق واسع وعرقل ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق موحدة وتوفر تكنولوجيا قوية وسهلة الاستخدام. في هذه الدراسة، كانوا يعملون المتاحة تجاريا، وخطوط الخلايا القبض تقسيم للكشف كمي للنشاط الغدد الصماء من المواد الكيميائية الموجودة في عينات المياه التي تهم المهنيين جودة البيئة. A، بروتوكول موحد واحد التي شملت ضمان الجودة الشاملة / مراقبة الجودة تم تطوير (QA / QC) الشيكات للنشاط الاستروجين وجلايكورتيكود مستقبلات (ER وGR، على التوالي) باستخدام فحص خلية القاعدة نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق). عينات من المياه المعالجة مياه الصرف الصحي البلدية والمياه السطحية من نظم المياه العذبة في ولاية كاليفورنيا (الولايات المتحدة الأمريكية) واستخراج، وذلك باستخدام الاستخلاص في الطور الصلب وتحليلها لنشاط الغدد الصماء باستخدام بروتو موحدالعقيد. اجتمع الخلفية والجرعة والاستجابة للمواد الكيميائية مرجعية نقطة النهاية المحددة المبادئ التوجيهية QA / QC تعتبر ضرورية لقياس موثوق بها. وكان الرد الأحيائي لفحص عينات المياه السطحية إلى حد كبير لا يمكن اكتشافها. في المقابل، كان عينات النفايات السائلة من محطات المعالجة الثانوية أعلى نشاط للقياس، مع تركيز يعادل الأحيائي التقديري (BEQs) ما يصل إلى 392 نانوغرام ديكساميثازون / L ل GR و 17 نانوغرام 17β استراديول / L لER. وكان الرد الأحيائي لعينة مياه الصرف التعليم العالي أقل من أن قياس لمياه الصرف الثانوية، مما يشير إلى المتبقية أقل من المواد الكيميائية الغدد الصماء نشطة بعد العلاج المتقدمة. وأظهر هذا البروتوكول أنه في اختبارات بيولوجية transactivation المختبر التي تستخدم المتاحة تجاريا، خلية القبض تقسيم "مجموعات"، يمكن تكييفها للكشف عن نشاط الغدد الصماء في الماء.
Introduction
ويستند مراقبة جودة المياه الحالية على القدرة على قياس بدقة وعلى وجه التحديد وقوع الملوثات الكيميائية، وكيل التعرض للحياة البرية والبشر. ومع ذلك، هذا الرصد الكيميائي من قبل والكيميائية ونموذج التقييم لا يمكن مواكبة الكون الكيميائية المتغيرة باستمرار التي نواجهها. ونحن نتعلم المزيد عن مصير وآثار المواد الكيميائية الاصطناعية والطبيعية، ونحن نواصل البحث عن أدوات القياس التي تعالج المتوقع التأثيرات البيولوجية، والتي في نفس الوقت ليست محصنة ضد التغيرات في إنتاج المواد الكيميائية واستخدام ومدخلات بيئية. هذه الأدوات هي ذات الصلة وخاصة لفهم ما إذا كانت المواد الكيميائية غير معروفة أو جديدة، ومنتجات التحول، تستحق اهتمامنا. وعلاوة على ذلك، يتم تناول خليط معقد من المواد الكيميائية الموجودة في المياه سيئة من قبل رصد الكيميائي الفردية. وبالتالي، فإننا نواجه التحدي المتمثل في تحديث الأدوات الرصد القائمة إلى عنوان أفضل هذه القضايا في المياه السطحية ثار الحصول تصريف المياه العادمة المعالجة والحضر جريان المياه / مياه الأمطار.
في السنوات الأخيرة، وقد أظهرت تقنيات bioanalytical وعد كأدوات فحص لتقييم نوعية المياه. وعلى وجه الخصوص، اختبارات بيولوجية in'vitro التي تستجيب للمواد الكيميائية التي تعمل عبر معروفة، وطرق عمل محددة 1،2 ذات أهمية كبيرة للمجتمع الرصد البيئي 3. وقد استخدمت العديد من التحقيقات في اختبارات بيولوجية في المختبر لقياس النشاط الغدد الصماء من الشرب، والمياه السطحية ومياه الصرف الصحي 4 -6. وعلاوة على ذلك، هناك عدد من اختبارات بيولوجية تستهدف أحداث الشروع الجزيئية (على سبيل المثال، تنشيط مستقبلات) التي يحتمل أن تكون مرتبطة الآثار الضارة عبر مسار نتائج سلبية يحلل 7،8.
وقد تطور bioscreening لتقييم نوعية المياه سريع نسبيا، مع مئات من مختلف في النهاية الأحيائي المختبر بعد أن تم تقييمها الخاصة بهمفائدة 9،10. حاليا، وقد ثبت سوى عدد قليل من اختبارات بيولوجية لتحقيق الدقة قياس جيدة (داخل المختبرات)، في حين يدل على القدرة على التفريق بين نوعية المياه 5،6. للالمياه العادمة المعالجة على وجه الخصوص، كان وقوع هرمون الاستروجين والمنشطات القشرية السكرية بنجاح شكلت للاستخدام في فحوصات المختبر transactivation 11،12. اختبارات بيولوجية ومع ذلك، فإن معظم الدراسات حتى الآن قد استخدمت الذين خلية خطوط هي ملكية (وبالتالي غير متوفرة على نطاق واسع)، وتتطلب عناية مستمرة والتلاعب، أو كليهما. ونتيجة لذلك، فإن القدرة على توحيد بروتوكولات، وأداء تمارين المعايرة بين المختبرات، وفي نهاية المطاف لنقل هذه التكنولوجيا للفحص لموارد المياه لا يزال المجتمع حال دون.
مورد واحد على الأقل في المختبر اختبارات بيولوجية فحصها من خلال برنامج ToxCast الولايات المتحدة متاح تجاريا 13 في سهلة الاستخدام "التجميد والذوبان4؛ الأشكال. وقد تبين أن هذه الخلايا "مجموعات" اعتقل تقسيم لتكون قوية في قياس نشاط المواد الكيميائية المستخرجة من المياه تمثل مستويات مختلفة من العلاج 14. وعلى الرغم من بروتوكولات بائع المتاحة لفحص النشاط الحيوي للمواد الكيميائية الفردية أو خليط، وبعضها يتطلب تعديل قبل أن يمكن تطبيقها على عينات من المياه. يعالج المياه العادمة 15، جريان مياه الأمطار 16، وتلقي مياه 17،18 وأكثر المعاد تدويرها مؤخرا 19،20 المياه من أفضل الأمثلة على الأوساط المائية التي تهم المجتمع نوعية المياه.
تقدم هذه الدراسة واحدة، بروتوكول موحد لقياس النشاط الغدد الصماء في عينات المياه باستخدام المتاحة تجاريا، تقسيم اعتقل في اختبارات بيولوجية transactivation المختبر. أثبتنا متانة البروتوكول من خلال إجراء تقييم شامل للخلفية، responsivity الجرعة وتكرار الاستجابة لطوماس فيبسالنهاية يا من معين الاستروجين الفائدة وجلايكورتيكود مستقبلات transactivation (ER وGR، على التوالي). تم تطبيق بروتوكول لعينات الشاشة من المياه العادمة المعالجة والمياه السطحية من نظم المياه العذبة في ولاية كاليفورنيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع ومعالجة المياه عينة (معدلة من ايشر وآخرون. 9)
- ملء زجاجة العنبر نظيفة 1 لتر تحتوي على 1 غرام أزيد الصوديوم، و 50 ملغ حامض الاسكوربيك إلى الأعلى مع عينة مياه من الفائدة. عينة تخزينها في 4 درجة مئوية، وعملية في غضون 72 ساعة.
ملاحظة: أزيد الصوديوم عالية السمية ويجب التعامل معها بحذر. استخدام واقية (العين / الوجه، والقفازات والملابس) وتزن في عملها بشكل صحيح الدخان غطاء محرك السيارة. لا تستخدم ملعقة معدنية لوزنها. - تمرير العينة من خلال 1.6 ميكرومتر مرشح الألياف الزجاجية ومن ثم من خلال خرطوشة شروطا مسبقة الصلبة المرحلة استخراج (SPE) بمعدل تدفق 5-10 مل / دقيقة. ضبط ضغط مضخة فراغ للسيطرة على معدل التدفق.
- فراغ تجفيف خرطوشة لمدة 15 دقيقة.
- أزل خرطوشة مع 10 مل من الميثانول، تليها 10 مل من الاسيتون: الهكسان (1: 1، ت / ت).
- التركيز شطافة إلى ~ 1 مل تحت تيار لطيف من ارتفاع النيتروجين نقاء. مذيبصرف بإضافة 500 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتبخير استخراج وصولا الى 500 ميكرولتر.
- نقل استخراج إلى الاوتوماتيكى قارورة العنبر الزجاج. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. إعداد التخفيفات من الفحص محددة الكيميائية المرجعية واستخراج المياه
- إعداد 9 التخفيفات لمنحنى المعايرة.
- جعل حل سهم الكيميائية إشارة محددة فحص في 100٪ DMSO. يجب أن يكون التركيز النهائي 2 ميكرومتر 17β استراديول للمقايسة ER، و 100 ميكرومتر ديكساميثازون للمقايسة GR. تخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية.
- إضافة 15 ميكرولتر من الأسهم الكيميائية إشارة مناسبة إلى 285 ميكرولتر المتوسطة فحص في أنبوب معقم (أنبوب رقم 1). خلط عينة من pipetting صعودا وهبوطا.
- إضافة 200 ميكرولتر من محلول 5٪ DMSO في المتوسط فحص في 8 أنابيب إضافية (أنابيب # 2-9).
- نقل قسامة 100 ميكرولتر من أنبوب رقم 1 إلى أنبوب رقم 2 من خلال الحوضالبريد رقم 9 لأداء سلسلة التخفيف 3 أضعاف. كل عينة المخففة يجب أن تكون مختلطة تماما مع ماصة قبل اتخاذ قسامة وإضافته إلى أنبوب المقبل.
- إعداد العينة الضابطة المذيبات عن طريق خلط 10 ميكرولتر من DMSO في 190 ميكرولتر من المتوسطة الفحص.
- إعداد أربعة التخفيفات لكل استخراج المياه.
- في الأنبوب الأول، إضافة 5 ميكرولتر من استخراج المياه في 95 ميكرولتر المتوسطة فحص وتخلط جيدا. إضافة 50 ميكرولتر من DMSO 5٪ في المتوسط فحص في ثلاثة أنابيب أخرى.
- إجراء تخفيف 2-أضعاف عن طريق نقل 50 ميكرولتر من محلول من أنبوب واحد إلى آخر.
3. إعداد تعليق خلية لتنفيذ الحنق الأحيائي
- إعداد المتوسطة محدد الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. يجب تخزين فحص المتوسطة في 4 درجات مئوية ودرجة حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام.
- خذ قارورة من الخلايا القبض على تقسيم ER أو GR من التجميد مجاناذر وذوبان الجليد الخلايا بسرعة عن طريق وضع القارورة في 37 ° C حمام مائي لمدة 2 دقيقة مع الإثارة لطيف. تطهير القارورة مع الايثانول 70٪ ووضعه في خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.
- فتح القارورة باستخدام تقنيات العقيم ونقل الخلايا إلى 10 مل من المتوسط الفحص.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف باستخدام الماصة زجاجية معقمة و resuspend بيليه الخلية في 6 مل من المتوسط الفحص.
- مزيج 5 ميكرولتر من تعليق خلية مع 5 ميكرولتر من حل وصمة عار حيوي وإضافة قسامة في غرفة الفرز.
- حساب عدد الخلايا الحية باستخدام المجهر الضوئي أو آلية مكافحة الخلايا وتقدير كثافة الخلايا الحية في تعليق خلية. تمييع إذا لزم الأمر للحصول على الكثافة النهائية من 550،000 الخلايا الحية في مل من المتوسط الفحص.
4. خلايا لوحة في 96-جيدا لوحة الأسود ستريت مسح القاع وإضافة المستخلص المائي المخفف
- إنشاء لوحةالتخطيط الذي يشتمل على 9 نقاط فحص منحنى معايرة محددة، وعينات QA / QC والتخفيفات متعددة لكل استخراج المياه. ويرد مثال على تخطيط لوحة 96-جيدا في الشكل 1.
- إضافة 90 ميكرولتر من المتوسطة فحص للآبار المراقبة خالية من الخلايا تكرار.
- صب تعليق خلية في خزان pipetting لالمعقم وإضافة 90 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الآبار الأخرى باستخدام ماصة الأقنية.
- إضافة 10 ميكرولتر من العينات المخففة التي أعدت خلال الخطوة 2 إلى آبار المناسبة. يجب أن يكون تركيز النهائي من DMSO لكل بئر 0.5٪ كحد أقصى.
- تغطية لوحة مع غطاء ووضعه في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
الشكل 1: مثال لتخطيط لوحة 96-جيدا تم تصميم لوحة متعددة أيضا لتشمل منحنى فحص معايرة محددة، 3 أنواعضوابط QA / QC (وسائل الإعلام فقط، والخلايا في وسط نظيف والخلايا في DMSO ارتفعت المتوسطة) و 4 التخفيفات في استخراج المياه. ويتم تحليل كل عنصر تحكم والتخفيف من استخراج المياه في الآبار ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. إعداد الحل التحميل وإضافة إلى كل حسنا
- بعد الحضانة، والسماح لوحة للتوازن إلى RT. لهذا الأحيائي الحنق، على بعد خطوات 5.2 خلال 5.6 ينبغي أن تتم في غياب الضوء المباشر.
- يعد حل 6X تحميل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إضافة 20 ميكرولتر من الحل 6X تحميل إلى كل بئر.
- إضافة 10 ميكرولتر من كاشف بقاء الخلية على كل بئر لتقييم السمية الخلوية لاستخراج المياه المخفف.
- ختم لوحة مع فيلم الألومنيوم لاصق.
- احتضان لوحة في الظلام في RT لمدة 2 ساعة.
6. السمسة قياس وآخر استجابة الغدد الصماء
- إعداد قارئ صفيحة مع قدرات القاعدة القراءة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- لtransactivation الأحيائي الحنق، وقياس مضان في الزرقاء (409/460 نانومتر، الإثارة (خر) / الانبعاثات (إم) الطول الموجي) والأخضر (409 تحويلة / 530 م نانومتر) القنوات.
- لفحص السمية الخلوية، وقياس مضان في 560 تحويلة / 590 م نانومتر.
7. تقييم QA / QC الشيكات لتحديد نوعية البيانات
- مقارنة متوسط مضان الخام من خالية من الخلايا (وسائل الاعلام فقط) والخلايا فقط (الخلايا في المتوسط فحص نظيف) الضوابط. يجب أن يكون مضان الخلفية وسائل الإعلام فقط بنسبة 25٪ على الأقل من الاستجابة للسيطرة الخلايا فقط.
- معالجة البيانات الحنق الخام. لكل من قواعد البيانات "الخضراء" "الزرقاء"، وطرح متوسط مضان من آبار المراقبة خالية من الخلايا من كل خلية تحتوي أيضا. حسابالزرقاء / الخضراء نسبة لكل بئر تجريبي.
- مقارنة زرقاء / خضراء نسبة من الخلايا فقط، وخلايا مع وجود ضوابط DMSO. يجب أن تكون القيم مضان من هذه الضوابط في حدود 15٪ الانحراف المعياري النسبي (RSD).
- رسم فحص منحنى معايرة محددة كما زرقاء / خضراء نسبة مقابل تركيز العينة كنسبة الكتلة الجزيئية سجل (تسجيل M). حساب المنحدر، R 2 وسجل EC 50 (50٪ تأثير تركيز). يجب أن تكون المعلمات معايرة ضمن النطاق المتوقع المدرجة في الجدول 1.
- حساب RSD لجميع الآبار ثلاث نسخ. وينبغي أن يكون التباين بين مكررات أقل من 20٪.
- للحصول على بيانات السمية الخلوية (560 تحويلة / 590 م نانومتر)، طرح سيطرة المتوسط خالية من الخلايا (أي وسائل الإعلام الخلفية) من جميع الآبار التي تحتوي على الخلية.
- حساب متوسط مضان طرح الخلفية لكل عينة. رسم البيانات مضان الناتجة كنسبة مئوية من سيطرة DMSO. ينبغي التخفيفات عينة لاتظهر وفيات خلية أكثر من 20٪ مقارنة مع الضوابط الخلايا فقط وDMSO.
8. تحليل البيانات
- حساب الحد فحص من الكشف (اللد)، والحد الأدنى للاستجابة معايرة زائد اثنين الانحرافات المعيارية من المتوسط هذا الرد.
- لعينات تظهر الاستجابة للجرعة، اشتقاق EC 50 لاستخراج المياه باستخدام منحدر الانحدار الخطي للمنحنى المعايرة بين 10 و 50٪ تركيزات تأثير المادة الكيميائية المرجعية.
- حساب تركيز Bioanalytical في حكمهم (بيك) باستخدام المعادلة التالية: بيك = EC 50 من المواد الكيميائية إشارة / EC 50 من عينة المياه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، تم اختيار 4X 24 ساعة عينات مركب من المياه المعالجة مياه الصرف البلدية، 6 عينات الاستيلاء على المياه السطحية من نظم المياه العذبة في جنوب كاليفورنيا والحقل فارغا تتكون من الماء عالى النقاء لتوضيح هذا البروتوكول. 3 من عينات مياه الصرف الصحي 4 كانوا من محطات توليد الكهرباء التقليدية تنشيط الحمأة مياه الصرف الصحي ( "النفايات السائلة الثانوي")، والرابع من محطة معالجة مياه الصرف الصحي متقدمة مع ترشيح الرمل / الكربون بعد العلاج البيولوجية المضافة ( "النفايات السائلة العالي"). تم جمع عينات المياه السطحية من مستجمعات المياه تمثل استعمالات المختلفة (فتح والزراعي والحضري).
وأظهرت التخفيفات من المستخلصات المائية لا السمية الخلوية واضحة مع وفيات الخلية أقل من 20٪ لاحظ بالمقارنة مع الضوابط DMSO (الجدول 1). خالية من خلية كانت (وسائل الإعلام فقط) خلفية منخفضة، وج وأشارت omparison بين الخلايا فقط والخلايا مع ردود DMSO أن المذيب لم يكن له تأثير ملموس على قياسات مضان. معلمات فحص منحنيات المعايرة محددة، بما في ذلك المنحدر وسجل EC 50، كانت ضمن مجموعة من القيم التاريخية مقبولة (الجدول 1) مما يدل على استنساخ جيدة من منحنيات المعايرة مع مرور الوقت. ويرد مثال على منحنى المعايرة مقبول للمقايسة ER في الشكل 2. اختيار 17β استراديول وديكساميثازون كما استند المواد الكيميائية إشارة على قوة استجابة الفحص، احتمال وقوع في مياه الصرف الصحي المعالجة والاستخدام التاريخي من قبل باحثين آخرين 20- 22. كان التغير في الاستجابة بين عينات من ثلاث نسخ أقل من 20٪ RSD. وهكذا، اعتبرت جميع البيانات لتكون ذات جودة مقبولة، وكانت تستخدم في وقت لاحق لتقدير ER وGR النشاط الحيوي (كنسبة بيك في نانوغرام / لتر) في مياه الصرف الصحي والمياه السطحية عينات المياه.
SS = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> والنسبي إثراء عامل (المرجع) من 5 إلى 10 و 4 التخفيفات في عينة ظهرت مناسبة لفحص عينات المياه التي تم تحليلها في هذه الدراسة. وأظهرت غالبية محطات معالجة مياه الصرف عينات النفايات السائلة على الاستجابة للجرعة فوق اللد لكلا ER وGR اختبارات بيولوجية. وكان أدنى تخفيف ردا في غضون منحنى المعايرة وكان أعلى تخفيف عادة أقل من اللد (الشكل 3). ومع ذلك، لم مقتطفات المياه السطحية لا تظهر ER قوي أو النشاط GR. وعلى الرغم من المرجع 10، كانت الردود الفلورسنت غالبا ما تكون قريبة أو أقل من اللد. غياب ردود الأحيائي للالحقل فارغا أكد أن المكتشفة ذكر أعلاه اللد لم تكن نتيجة لأخذ العينات أو مختبر الإجرائي التحف.
تم الكشف عن الأنشطة ER والموارد الوراثية في 7 و 4 من 10 عينة مياه تمثيلية، على التوالي (الجدول 2)، وفقا لأعلى من BEQs من 17 نانوغرام E2 / L و 392 نانوغرام التنفيذ المباشر / L وجدت في النفايات السائلة الثانوية. كان النشاط GR في عينة من مياه الصرف الصحي العالي تحت اللد الأحيائي. وبالمثل، أظهرت معظم عينات المياه السطحية أي نشاط GR فوق اللد ومستويات أقل بكثير من النشاط ER من النفايات السائلة الثانوية.
الشكل 2: مثال لمعايرة Curve لللائحة الفحص منحنى الاستجابة للجرعة، تآمر بوصفها نسبة مضان يعني (± SEM)، هو السيني وتستخدم لتحديد EC 10 و EC 50 القيم. هذا جزء من منحنى يتم تركيبها باستخدام الانحدار الخطي وتستخدم لاستخلاص تركيز يعادل الأحيائي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ليه / ftp_upload / 54725 / 54725fig3.jpg "/>
يتم حساب متوسط الأزرق / الأخضر الإسفار نسبة (± SEM) من عينات المياه تآمر ضد theRrelative إثراء عامل الأحيائي التركيزات المكافئة (بيك) للعينات التي تظهر تركيز تعتمد على استجابة مع ما لا يقل عن نقطتين فوق الحد سلسلة التخفيف: الرقم 3. من الكشف (اللد). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مستقبلات الاستروجين (ER) الفحص | الاستيرويد مستقبلات (GR) الفحص | |||
| نتائج الدراسة | معايير القبول | نتائج الدراسة معايير القبول | ||
| المعلمات معايرة | ||||
| يعني تسجيل EC50 (M) | -9.6 | -10.1 إلى -9.1 | -8.5 | -9.0 إلى -8.0 |
| يعني المنحدر | 1.1 | 0،9-1،5 | 2.0 | 1،8-2،4 |
| R2 | 0.99 | > 0.95 | 0.99 | > 0.95 |
| ضوابط QA / QC | ||||
| الخلفية وسائل الإعلام | نعم فعلا | وسائل الاعلام فقط <خلية + وسائل الإعلام | نعم فعلا | وسائل الاعلام فقط <خلية + وسائل الإعلام |
| سمية الخلايا (وفيات٪) | 0٪ | <وفيات 20٪ | 0-5٪ | <وفيات 20٪ |
| دقة العينة (٪ RSD) </ td> | 2-18٪ | <20٪ | 4-13٪ | <20٪ |
الجدول 1: ملخص النتائج QA / QC من Bioanalytical فحص مياه الصرف الصحي المعالجة السائلة وعينات المياه السطحية.
| معرف عينة والوصف | ER-بيك (نانوغرام E2 / L) | GR-بيك (نانوغرام التنفيذ المباشر / L) |
| أ - النفايات السائلة النهائي من محطة المعالجة الثانوية الكامل | 6.4 | 248 |
| ب - مياه الصرف النهائي من محطة المعالجة الثانوية الكامل | 13 | 392 |
| ج - مياه الصرف النهائي من محطة المعالجة الثانوية الكامل | 17 | 236 |
| د - النفايات السائلة النهائية من العلاج العالي صlant | 2.3 | <22 |
| E - المياه السطحية من الرقعة الزراعية | <0.5 | 30 |
| F - المياه السطحية من الرقعة الزراعية | <0.5 | <22 |
| G - المياه السطحية من المنطقة الحضرية | 4 | <22 |
| H - المياه السطحية من المنطقة الحضرية | 0.9 | <22 |
| I - المياه السطحية من حقل مفتوح | 0.8 | <22 |
| J - المياه السطحية من حقل مفتوح | <0.5 | <22 |
| K - حقل فارغ (الماء عالى النقاء) | <0.5 | <22 |
الجدول 2: الأحيائي التركيزات المكافئة لمستقبلات الاستروجين (ER-بيك) وجلايكورتيكود مستقبلات (GR-بيك) ميلان. الناقلية ثلاثة أنواع من العينات التي تم جمعها في ولاية كاليفورنيا (الولايات المتحدة الأمريكية) ويتم تحليل: البلدية المياه العادمة (AD)، والمياه السطحية (EJ)، وحقل فارغ (K).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقوة موثقة جيدا من هرمون الاستروجين البيئية، مثل 17β استراديول (E2)، مذكرات الكشف عن هذه المواد الكيميائية في نانوغرام تركيزات / L 23،24. في هذه الدراسة، واستجابة ER عن المياه المستعملة (المدى بيك: 2،3 حتي 17 نانوغرام E2 / L) كان أعلى إلى حد ما مما ذكر عن النفايات السائلة الثانوي من وتبس الاسترالية 20، في حين أن BEQs للمياه السطحية (<0،5-4 نانوغرام E2 / L ) كانت ضمن المدى المبلغ عنه السطحية ومياه الأمطار في مكان آخر (<1-11 نانوغرام E2 / L) 16. وعلى الرغم من انخفاض مستويات النشاط ER قياسها في عينات المياه السطحية، ويمثل هذا الاختبار نقطة نهاية الفحص ذات الصلة لتقييم نوعية المياه. وغالبا ما يتم الكشف عن هرمون الاستروجين مثل ثنائي الفينول أ وalkylphenol السطحي في البيئة المائية، ولكنها يمكن أن يكون من الصعب تحديد باستخدام الكيمياء التحليلية التقليدية. قد تكون المقايسات ER-خلية المفيد أيضا للكشف عن المبيدات المسجلة حاليا وحديثا، كما يتضح من كوجيما وآخرون25.
تجاوز النشاط GR النشاط ER بأمر من الحجم في جميع العينات السائلة 4 تحليلها في هذه الدراسة (الجدول 2). وهذا الاتجاه يتفق مع الدراسات السابقة بشأن المياه العادمة 14، ومجموعة لGR-BEQs ذكرت هنا هي أعلى قليلا ولكن قابلة للمقارنة لتلك التي ذكرت عن النفايات السائلة الثانوية الأخرى التي تستخدم نفس في المختبر الأحيائي 12. باستخدام الأحيائي مختلفة من الخلايا، ومجموعة لGR-BEQs عن النفايات السائلة من محطات معالجة مياه الصرف الصحي في اليابان أقل (<3-78 نانوغرام التنفيذ المباشر / لتر) من تلك التي ذكرت لمياه الصرف الصحي الثانوي في هذه الدراسة 22. مع استثناء من عينة المياه السطحية واحد التي سجلت استجابة أقصى GR من 30 نانوغرام التنفيذ المباشر / لتر (الجدول 2، عينة E)، وكان النشاط GR في عينات المياه السطحية تبقى متسقة مع ذكر انخفاض النشاط لسطح الهولندي يسقي 21 . ومع ذلك، فإن ايم البيئياتفاق للمواد الكيميائية GR النشطة تتميز بشكل أقل من لائحة المواد الكيميائية النشطة 26، مما يجعل تقييم احتمالات ارتفاع آثار أجل التحدي.
كما هو الحال مع التحليل الكيميائي التقليدي، والانضمام إلى بروتوكولات مكتوبة والتحقق من القياسات باستخدام QA القائمة على الأداء / النهج QC يزيد جودة البيانات ومتانة. على الرغم من أن التحقق من اختبارات بيولوجية الخلية تكييفها لتقييم نوعية المياه ستستمر في التطور والتحسن، وأظهر قياس المعلمات QA / QC المذكورة أولا في Mehinto وآخرون (14). وتطبق على هذه الدراسة أن نتائجنا كانت أيضا ضمن القيم التوجيهي المحددة مسبقا (الجدول 1 ). المعلمات منحنى المعايرة لهذه اختبارات بيولوجية تعكس تلك المستخدمة لمعايرة بروتوكولات التحليلية الأخرى (على سبيل المثال، GC-MS)، مع إضافة معايير تقييم الجدوى من الخلايا (على سبيل المثال، سمية الخلايا) التي تمثل الفرق الرئيسي. تشغيل أخرىالفرق جعل من الممكن استخدام الخلايا في شكل عالية الإنتاجية هو إدراج التخفيفات عينة متعددة توضح تركيز استجابة تعتمد المتوقع عندما يتم قياس النشاط الحيوي (الشكل 2). في مراجعة القياسات عينة، وانخفاض ER وردود GR لمياه الصرف الصحي العالي (عينة D) بالمقارنة مع عينات مياه الصرف الثانوية الثلاثة (AC) يقدم دليلا إضافيا على دقة النسبية للنتائج الأحيائي دينا فرز في الجدول 2. التأسيس للسيطرة أو العينات المرجعية التي تمثل مصفوفة من الفائدة، في هذه المياه الحالة، سيزيد من تعزيز القدرة على مقارنة النتائج الأحيائي داخل وخصوصا عبر كيانات قياس.
وأعرب عن ردود ER وGR transactivation خطوط الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة النسبي للنشاط منبهات قوية E2 وديكساميثازون، على التوالي. وهذا ما يسمح لتقدير كمي للالنشاط الحيوي أعربسا الأحيائي التركيز في حكمهم (بيك). هذا يسمح كذلك للتحقيق في المواد الكيميائية التي تساهم في الاستجابة الأحيائي، أي مقارنة مباشرة من BEQs مع تركيز مستقبلات الفردية تحديدها عن طريق الكيمياء التحليلية التقليدية. هذا المفهوم يؤكد على فائدة إضافية تتمثل في bioscreening في توجيه التحقيق التشخيص من العوامل المسببة، المعروف أيضا باسم التحليل الموجه الآثار.
منذ يستخدم SPE بشكل روتيني إلى عزل مجموعة واسعة من الأدوية وغيرها من "الملوثات الناشئة" من المياه، قمنا بتوظيف بروتوكول نشرت سابقا 9 و 20 التي تضمن المواد الماصة مصممة لالتقاط المواد الكيميائية على حد سواء ماء والكارهة للماء في الماء. على الرغم من أننا نفترض القبض الكمي للجميع المركبات العضوية النشطة بيولوجيا باستخدام هذه التقنية، هناك حاجة إلى عمل إضافي لتوحيد تماما والتحقق من أداء أساليب الاستخراج من هذا القبيل. نوع من فحص الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة قد تقدمالحد آخر. هذه المقايسات قياس التفاعلات بين الملوثات ومستقبل نووي ولا تأخذ في الاعتبار التفاعلات المحتملة الأخرى، مثل مستقبلات كيميائية غشاء. وبالتالي، فمن الممكن أن ردود فحص قياس هنا والاستهانة بها. مثل استخراج عينة، لا توجد أساليب موحدة لتحليل بيانات الخلية الفحص ومناهج مختلفة قد يعطي نتائج مختلفة. الانحدار الخطي المستخدمة في هذه الدراسة لنموذج الاستجابة للنصف السفلي من منحنى المعايرة قد لا يكون مناسبا لجميع المقايسات خلية، خاصة إذا تم تمديده استجابة غرار ما وراء نطاق ضيق نسبيا المحددة في هذه الدراسة. هناك حاجة إلى تحقيق إضافي في القضايا المذكورة أعلاه لفهم مدى هذه الأدوات يمكن تطبيقها كأداة مراقبة قوية.
في حين يتم وضع الكثير من الأسس لER وGR كما الشاشات للمواد الكيميائية الغدد الصماء النشطة والباحثين وتوسيع نطاقأدوات bioanalytical لتشمل وضع آخر ذي صلة من الإجراءات، على سبيل المثال، التذكيرية، السمية الوراثية، العصبية والمناعية 9،27. وهناك الأدوات أكثر اكتمالا تعزيز قدرة للكشف عن المواد الكيميائية الحيوية النشطة، بما في ذلك المنتجات تحويل و / أو المواد الكيميائية معروفة وغير معروفة التي يمكن أن تحدث 28، الآن وفي المستقبل، في مختلف البيئات المائية 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
