Abstract
Dans les essais biologiques de transactivation in vitro ont montré des résultats prometteurs comme outils de surveillance de la qualité de l' eau, mais leur adoption et l' application généralisée a été entravée en partie à cause d'un manque de méthodes normalisées et la disponibilité de la technologie robuste, facile à utiliser. Dans cette étude, disponibles dans le commerce, les lignes de division cellulaire arrêtés ont été utilisés pour dépister quantitativement l'activité endocrinienne des substances chimiques présentes dans les échantillons d'eau d'intérêt pour les professionnels de la qualité de l'environnement. Un seul protocole standardisé qui comprenait assurance qualité / contrôle de la qualité (AQ / CQ) des contrôles a été développé pour l'activité œstrogène et récepteur des glucocorticoïdes (ER et GR, respectivement) en utilisant un essai Fluorescence Resonance Energy Transfer à base de cellules (FRET). Des échantillons de l'effluent traité des eaux usées municipales et de l'eau de surface des systèmes d'eau douce en Californie (USA), ont été extraits par extraction en phase solide et analysés pour l'activité endocrinienne utilisant le proto standardisécol. Contexte et dose-réponse pour les produits chimiques de référence spécifiques finaux remplies d'AQ / CQ directives jugées nécessaires pour une mesure fiable. La réponse de dépistage du bioessai pour les échantillons d'eau de surface est en grande partie non détectable. En revanche, les échantillons d'effluents des usines de traitement secondaire ont eu l'activité mesurable la plus élevée, avec des concentrations équivalentes de biodosage estimée (BEQ) jusqu'à 392 ng dexaméthasone / L pour GR et 17 ng 17β-estradiol / L pour ER. La réponse de l'essai biologique d'un échantillon d'effluent tertiaire est inférieure à celle mesurée pour les effluents secondaires, ce qui indique une faible résiduelle de perturbateurs endocriniens après le traitement avancé. Ce protocole a montré que dans les essais biologiques de transactivation in vitro qui utilisent disponibles dans le commerce, la cellule de division arrêté "kits", peut être adapté à l' écran pour l' activité endocrinienne dans l' eau.
Introduction
Current surveillance de la qualité de l'eau repose sur la capacité à mesurer avec précision et précisément la présence de contaminants chimiques comme un proxy pour l'exposition à la faune et les humains. Cependant, cette surveillance chimique par produit chimique et de l'évaluation de paradigme ne peuvent pas suivre le rythme de l'univers chimique en constante évolution que nous sommes confrontés. Comme nous en apprendre davantage sur le sort et les effets des produits chimiques synthétiques et naturels, nous continuons à chercher des outils de mesure qui répondent attendus impacts biologiques, et que dans le même temps sont insensibles aux variations de la production chimique, l'utilisation et l'entrée de l'environnement. Ces outils sont particulièrement pertinentes pour comprendre si des produits chimiques inconnus ou nouveaux, et les produits de transformation, méritent notre attention. En outre, des mélanges complexes de produits chimiques présents dans l'eau sont mal traités par une surveillance individuelle chimique. Ainsi, nous sommes confrontés au défi de la modernisation de la boîte à outils de surveillance existants pour mieux répondre à ces questions dans les eaux de surface that reçoivent décharge des effluents traités des eaux usées et urbain / ruissellement des eaux pluviales.
Au cours des dernières années, les techniques bioanalytiques ont montré des résultats prometteurs comme outils de dépistage pour l'évaluation de la qualité de l'eau. En particulier, les bioessais in'vitro qui répondent à des produits chimiques agissant par l' intermédiaire connu, les modes d'action spécifiques 1,2 sont d' un grand intérêt pour la communauté de surveillance de l' environnement 3. De nombreuses enquêtes ont utilisé dans des essais biologiques in vitro pour quantifier l'activité endocrinienne de l' eau potable, de surface et les eaux usées 4 -6. En outre, un certain nombre d'essais biologiques cibles événements initiateurs moléculaires (par exemple, l' activation du récepteur) qui peut potentiellement être liée à des effets délétères par voie de résultat défavorable des analyses 7,8.
L'évolution de la bioscreening pour l' évaluation de la qualité de l' eau a été relativement rapide, avec des centaines de différents paramètres dans les essais biologiques in vitro ayant été évalués pour leurutilitaire 9,10. Actuellement, seule une poignée d'essais biologiques a été démontré que pour obtenir une bonne précision de mesure (dans les laboratoires) tout en démontrant la capacité de différencier les qualités d'eau 5,6. Pour traiter les effluents d'eaux usées , en particulier, l'apparition d'oestrogènes et de glucocorticostéroïdes a bien été pris en compte pour l' utilisation dans des tests de transactivation in vitro 11,12. bioessais Cependant, la plupart des études à ce jour ont employées dont lignées cellulaires sont propriétaires (et donc pas largement disponibles), nécessitent des soins continus et de manipulation, ou les deux. En conséquence, la capacité de normaliser les protocoles, effectuer inter-laboratoires d'étalonnage des exercices, et, finalement, de transférer cette technologie de criblage pour les ressources en eau communautaire reste entravée.
Au moins un fournisseur de tests biologiques in vitro sélectionnés à travers le programme US ToxCast est disponible dans le commerce 13 facile à utiliser "gel et de dégel4; formats. Ces divisions arrêté de cellules "kits" ont été montré pour être robuste dans la mesure de l'activité des produits chimiques extraites de l' eau représentant différents niveaux de traitement 14. Bien que les protocoles du fournisseur sont disponibles pour cribler la bioactivité des composés chimiques ou des mélanges de certains d'entre eux doivent être modifiés avant qu'ils puissent être appliqués à des échantillons d'eau. Effluent traité des eaux usées 15, les eaux de ruissellement 16, les eaux réceptrices 17,18 et plus récemment recyclé 19,20 d'eau sont d' excellents exemples de milieux aqueux qui sont d'intérêt pour la communauté de la qualité de l' eau.
Cette étude présente un seul protocole standardisé pour mesurer l'activité du système endocrinien dans des échantillons d'eau à l' aide disponible dans le commerce, division arrêté en bioessais de transactivation in vitro. Nous avons démontré la robustesse du protocole par le biais d'une évaluation complète de fond, la réceptivité de la dose et la répétabilité de réponse pour two les effets particulièrement Estrogen d'intérêt et récepteur des glucocorticoïdes transactivation (ER et GR, respectivement). Le protocole a été appliqué à des échantillons d'écran de traitement des effluents des eaux usées et des eaux de surface des systèmes d'eau douce en Californie.
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Protocol
1. Recueillir et échantillon Processus d'eau (Modifié à partir de Escher et al. 9)
- Remplir une bouteille de 1 L en verre ambré propre contenant 1 g d'azoture de sodium et 50 mg d'acide ascorbique au sommet avec l'échantillon d'eau d'intérêt. conserver les échantillons à 4 ° C et le processus dans les 72 h.
NOTE: L'azoture de sodium est très toxique et doit être manipulé avec précaution. Utiliser un équipement de protection (yeux / du visage, gants, vêtements) et peser dans un hottes fonctionnant correctement. Ne pas utiliser une spatule en métal pour le pesage. - Faire passer l'échantillon à travers un filtre en fibre de verre de 1,6 pm et puis à travers une cartouche d'extraction en phase solide préconditionnés (SPE) à un débit de 5-10 ml / min. Régler la pression de la pompe à vide pour contrôler le débit.
- Vacuum sécher la cartouche pendant 15 min.
- Éluer la cartouche avec 10 ml de methanol, suivi par 10 mL d'acétone: hexane (1: 1, v / v).
- Concentré éluat à ~ 1 ml sous un léger courant d'azote de haute pureté. Solvantéchange par addition de 500 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) et évaporer l'extrait jusqu'à 500 ul.
- Transférer l'extrait à un échantillonneur automatique flacon de verre ambré. Conserver à -20 ° C.
2. Préparer la dilution du dosage spécifique des produits chimiques de référence et de l'extrait de l'eau
- Préparer des dilutions 9 pour la courbe d'étalonnage.
- Faire une solution stock de spécifique chimique de référence d'essai dans 100% de DMSO. La concentration finale doit être de 2 uM 17β-oestradiol pour le dosage du RE, et 100 uM de dexaméthasone pour l'essai GR. Stocker les solutions mères à -20 ° C.
- Ajouter 15 ul du stock de produits chimiques de référence appropriée à 285 pi de milieu d'essai dans un tube stérile (tube n ° 1). Mélanger l'échantillon par pipetage de haut en bas.
- Ajouter 200 ul d'une solution de 5% de DMSO dans le milieu d'essai dans 8 tubes supplémentaires (tubes # 9/2).
- Transférer une partie aliquote de 100 pi du tube n ° 1 pour le tube n ° 2 à baine # 9 pour effectuer une série de dilutions de 3 fois. Chaque échantillon dilué doit être mélangé soigneusement avec une pipette avant la prise d'une aliquote et l'ajouter au tube suivant.
- Préparer un échantillon témoin de solvant en mélangeant 10 ul de DMSO dans 190 ul de milieu d'essai.
- Préparer quatre dilutions pour chaque extrait de l'eau.
- Dans le premier tube, ajouter 5 ul d'extrait de l'eau dans 95 pi de milieu d'essai et bien mélanger. Ajouter 50 ul de 5% de DMSO dans le milieu d'essai dans trois autres tubes.
- Effectuer une dilution d'un facteur 2 en transférant 50 ul de solution à partir d'un tube à l'autre.
3. Préparer la suspension cellulaire pour effectuer les FRET bioessai
- Préparer le milieu d'essai spécifique selon les instructions du fabricant. un milieu d'essai doit être conservé à 4 ° C et réchauffé à 37 ° C dans un bain d'eau avant utilisation.
- Prenez un flacon de cellules de division-ER arrêté ou GR de la cryogénique librezer et décongeler les cellules rapidement en plaçant le flacon dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 minutes sous agitation douce. Décontaminer le flacon avec 70% d'éthanol et le placer dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.
- Ouvrir le flacon en utilisant des techniques aseptiques et transférer les cellules dans 10 ml de milieu de dosage.
- Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant à l'aide d'une pipette en verre stérile et remettre en suspension le culot cellulaire dans 6 ml de milieu de dosage.
- Mélanger 5 ul de suspension cellulaire avec 5 ul d'une solution de colorant vital, et ajouter une fraction aliquote dans une chambre de comptage.
- Compter le nombre de cellules vivantes à l'aide d'un microscope optique ou d'un compteur de cellules automatisé et l'estimation de la densité de cellules vivantes dans la suspension cellulaire. Diluer si nécessaire pour obtenir une densité finale de 550.000 cellules vivantes par ml de milieu de dosage.
4. Les cellules en plaques dans un 96 puits plaque noire mur Clear-fond et Ajouter l'extrait de l'eau diluée
- Créer une plaquemise en page qui inclut un test courbe 9 points d'étalonnage spécifique, AQ / CQ des échantillons et des dilutions multiples pour chaque extrait de l'eau. Un exemple d'agencement d' une plaque de 96 puits est représenté sur la figure 1.
- Ajouter 90 ul de milieu d'essai pour les réplicats des puits témoins sans cellules.
- Verser la suspension de cellules dans un réservoir de pipetage stérile et ajouter 90 ul de suspension cellulaire dans les autres puits en utilisant une pipette à canaux multiples.
- Ajouter 10 pi des échantillons dilués préparés lors de l'étape 2 dans les puits appropriés. La concentration finale de DMSO dans chaque puits doit être de 0,5% au maximum.
- Couvrir la plaque avec un couvercle et le placer dans un incubateur à CO 2 de 5% à 37 ° C pendant 16 heures.
Figure 1:. Exemple de mise en page de la plaque de 96 puits La plaque multi-puits est conçu pour inclure une courbe d'étalonnage spécifique de dosage, 3 typesde QA / QC contrôles (médias seulement, les cellules dans un milieu propre et les cellules dans du DMSO dopé moyenne) et 4 dilutions par extrait de l'eau. Chaque contrôle et la dilution de l' extrait de l' eau est analysée dans des puits en triple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
5. Préparer la solution de chargement et Ajouter à chaque puits
- Après incubation, laisser la plaque à équilibrer à la température ambiante. Pour cet essai biologique FRET, les étapes 5.2 à 5.6 devraient être menées en l'absence de lumière directe.
- Préparer une solution 6x de chargement selon les instructions du fabricant.
- Ajouter 20 ul de la solution de chargement 6x à chaque puits.
- Ajouter 10 pi de réactif de viabilité cellulaire à chaque puits afin d'évaluer la cytotoxicité de l'extrait aqueux dilué.
- Sceller la plaque avec un film adhésif en aluminium.
- Incuber la plaque dans l'obscurité à température ambiante pendant 2 h.
6. Mesurer la cytotoxicité et la réponse endocrinienne Activité
- Mettre en place le lecteur de microplaques avec des capacités de lecture en bas en suivant les instructions du fabricant.
- Pour la transactivation bioessai FRET, mesurer la fluorescence dans le bleu (409/460 nm, excitation (Ex) / émission (Em) longueur d'onde) et vert (409 Ex / 530 nm Em) canaux.
- Pour le test de cytotoxicité, mesurer la fluorescence à 560 Ex / 590 Em nm.
7. Évaluer vérifications AQ / CQ pour déterminer la qualité des données de
- Comparez la fluorescence brute moyenne de la acellulaire (médias seulement) et les cellules seulement (cellules dans un milieu d'essai propre) des contrôles. La fluorescence de fond médiatique ne devrait être au moins 25% inférieure à la réponse du contrôle des cellules seulement.
- Traiter les données de FRET premières. Pour les deux ensembles de données «bleu» et «verts», soustraire la fluorescence moyenne des puits témoins sans cellules de toute cellule contenant bien. Calculer lableu rapport / vert pour chaque puits expérimental.
- Comparer bleu rapport / vert de cellules seulement et les cellules avec des commandes de DMSO. Les valeurs de fluorescence de ces contrôles devraient être dans les 15% Déviation standard relative (RSD).
- Tracer la courbe d'étalonnage spécifique d'essai en bleu rapport / vert contre la concentration de l'échantillon exprimée en masse moléculaire de log (log M). Calculer la pente, R 2 et log CE 50 (50% Effect Concentration). Les paramètres d'étalonnage doivent se situer dans la fourchette prévue énumérés dans le tableau 1.
- Calculer le RSD pour tous les puits en triple. La variabilité des répétitions doit être inférieure à 20%.
- Pour les données de cytotoxicité (560 Ex / 590 Em nm), soustraire la moyenne de commande sans cellule (ie fond des médias) de tous les puits contenant des cellules.
- Calculer la fluorescence de fond soustrait la moyenne pour chaque échantillon. Tracer les données de fluorescence résultant en pour cent du témoin de DMSO. dilutions échantillon ne doit pasexposer la mortalité cellulaire de plus de 20% par rapport aux cellules uniquement et DMSO témoins.
8. Analyse des données
- Calculer la limite de dosage de détection (LOD) comme la réponse d'étalonnage minimum plus de deux écarts types de la moyenne de cette réponse.
- Pour les échantillons montrant une réponse à la dose, tirer la CE 50 de l'extrait de l'eau en utilisant la pente de la régression linéaire de la courbe d'étalonnage entre 10 et 50 concentrations en% d'effet du produit de référence.
- Calculer la concentration bioanalytiques Equivalent (BEQ) en utilisant la formule: BEQ = EC 50 de produit chimique de référence / CE 50 de l' échantillon d'eau.
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Representative Results
Dans la présente étude, 4x 24 h échantillons composites de traitement des eaux usées des effluents municipaux, 6 échantillons ponctuels d'eau de surface provenant des systèmes d'eau douce dans le sud de la Californie et un champ vide constitué d'eau ultrapure ont été sélectionnés pour illustrer ce protocole. 3 des échantillons 4 effluents provenaient de centrales classiques activées de traitement des boues des eaux usées ( «effluent secondaire»), et le quatrième à partir d'une station d'épuration avancé avec traitement post biologique de filtration sable / carbone ajouté ( «effluent tertiaire»). des échantillons d'eau de surface ont été prélevés dans les bassins hydrographiques représentant différentes utilisations du sol (ouverte, agricole et urbain).
Les dilutions des extraits aqueux ont montré aucune cytotoxicité apparente avec la mortalité cellulaire à moins de 20% observée par rapport aux témoins de DMSO (tableau 1). acellulaire (médias seulement) fond était faible, et le comparaison entre les cellules et les cellules uniquement avec des réponses de DMSO a indiqué que le solvant n'a pas d'impact mesurable sur les mesures de fluorescence. Paramètres des courbes d'étalonnage spécifiques essai, y compris la pente et connecter CE 50, étaient dans la fourchette des valeurs historiques acceptables (tableau 1) démontrant une bonne reproductibilité des courbes d'étalonnage au fil du temps. Un exemple de courbe d'étalonnage acceptable pour le dosage de ER est représenté sur la figure 2. La sélection de 17β-estradiol et la dexaméthasone que les produits chimiques de référence a été basée sur la force de réaction de dosage, de la probabilité d'occurrence dans les eaux usées traitées et l' utilisation historique par d' autres chercheurs 20- 22. La variabilité dans la réponse parmi les échantillons en triple était inférieur à 20% ETR. Ainsi, toutes les données ont été jugées de qualité acceptable, et ont ensuite été utilisées pour estimer l'ER et GR bioactivité (exprimée en BEQ en ng / L) dans des échantillons d'eau des eaux usées et de surface.
(figure 3). Cependant, les extraits d'eau de surface ne montrent pas une forte ER ou activité GR. En dépit d'un REF de 10, les réponses fluorescentes étaient souvent proches ou en dessous du LOD. L'absence de réponses de biodosage pour le champ vide a confirmé que les détections notées ci-dessus LOD ne sont pas le résultat de l'échantillonnage ou au laboratoire procédural artefacts.
Les activités d'ER et GR ont été détectées dans sept et quatre des 10 échantillons d'eau représentatifs, respectivement (tableau 2), la plus élevée des BEQ de 17 ng E2 / L et 392 ng Dex / L trouvés dans les effluents secondaires. L'activité de GR dans l'échantillon d'effluent tertiaire était inférieur à la LOD de bioessai. De même, la plupart des échantillons d'eau de surface ne présentaient aucune activité de GR-dessus LOD et des niveaux beaucoup plus faibles de l'activité ER que les effluents secondaires.
Figure 2:. Exemple de courbe d' étalonnage pour le dosage ER La courbe dose-réponse, tracée comme étant le rapport de fluorescence moyenne (± SEM), est sigmoïde et utilisé pour déterminer les valeurs de CE10 et CE50. Cette partie de la courbe est monté en utilisant une régression linéaire et utilisé pour obtenir une concentration équivalente de bioessai. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3:. Bleu moyen / Ratio vert Fluorescence (± SEM) des échantillons d' eau complotèrent contre theRrelative Enrichissement Factor Bioassay concentrations équivalentes (BEQ) sont calculés pour les échantillons dont la dilution série montrer une personne à charge-réponse de concentration avec un minimum de deux points au- dessus de la limite de détection (LOD). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Estrogen Receptor (ER) Dosage | Récepteur des glucocorticoïdes (GR) Assay | |||
| Résultats de l' étude | Les critères d'acceptation | Résultats de l' étude Les critères d'acceptation | ||
| Les paramètres d'étalonnage | ||||
| Logarithmique moyen CE50 (M) | -9.6 | -10,1 À -9,1 | -8.5 | -9,0 À -8,0 |
| pente moyenne | 1.1 | 0,9 à 1,5 | 2.0 | 01/08 à 02/04 |
| R2 | 0,99 | > 0,95 | 0,99 | > 0,95 |
| QA / QC contrôles | ||||
| fond médias | Oui | médias seulement <cellule + médias | Oui | médias seulement <cellule + médias |
| Cytotoxicité (% mortalité) | 0% | <20% de mortalité | 0 à 5% | <20% de mortalité |
| précision de l'échantillon (% RSD) </ Td> | 2 à 18% | <20% | 4-13% | <20% |
Tableau 1: Sommaire de l' AQ / CQ Résultats De bioanalytiques Projection du Traité effluents d' eaux usées et de surface des échantillons d'eau.
| ID échantillon et description | ER-BEQ (ng E2 / L) | GR-BEQ (ng Dex / L) |
| A - effluent final de la pleine installation de traitement secondaire | 6.4 | 248 |
| B - effluent final de la pleine installation de traitement secondaire | 13 | 392 |
| C - effluent final de la pleine installation de traitement secondaire | 17 | 236 |
| D - effluent final du traitement tertiaire plant | 2.3 | <22 |
| E - eau de surface de la zone agricole | <0,5 | 30 |
| F - eau de surface de la zone agricole | <0,5 | <22 |
| G - eau de surface de la zone urbaine | 4 | <22 |
| H - l'eau de surface de la zone urbaine | 0,9 | <22 |
| I - eau de surface du champ ouvert | 0,8 | <22 |
| J - eau de surface du champ ouvert | <0,5 | <22 |
| K - champ vide (eau ultrapure) | <0,5 | <22 |
Tableau 2: Concentrations Bioassay équivalentes pour Estrogen Receptor (ER-BEQ) et récepteur des glucocorticoïdes (GR-BEQ) ac. tivité Trois types d'échantillons prélevés en Californie (USA) sont analysés: les effluents des eaux usées municipales (AD), l' eau de surface (EJ) et champ vide (K).
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Discussion
La puissance bien documenté des oestrogènes environnementaux, tels que 17β-estradiol (E2), garantit le dépistage de ces produits chimiques à ng / L concentrations 23,24. Dans cette étude, la réponse de l' urgence pour les effluents d'eaux usées (gamme BEQ: 2,3 à 17 ng E2 / L) était légèrement supérieur à celui rapporté pour l' effluent secondaire de WWTPs australiennes 20, alors que les BEQ pour l' eau de surface (<0,5 à 4 ng E2 / L ) étaient dans la plage rapportée pour la surface et les eaux pluviales ailleurs (<1 à 11 ng E2 / l) 16. Malgré les faibles niveaux d'activité d'ER mesurées dans les échantillons d'eau de surface, ce test représente un critère de sélection pertinent pour l'évaluation de la qualité de l'eau. Les estrogènes tels que le bisphénol A et alkylphénols tensioactifs sont souvent détectés dans le milieu aquatique, mais ils peuvent être difficiles à quantifier en utilisant la chimie analytique classique. dosages ER-cellulaires peuvent également se révéler utile pour le dépistage des pesticides actuellement et nouvellement immatriculés, comme indiqué par Kojima et al25.
L'activité de GR a dépassé le activité ER par un ordre de grandeur dans les 4 échantillons d' effluents analysés dans cette étude (tableau 2). Cette tendance est conforme aux études précédentes sur effluents d' eaux usées 14, et la gamme pour GR-BEQ rapportée ici est légèrement plus élevé mais comparable à celui rapporté pour d' autres effluents secondaires en utilisant le même dosage biologique in vitro 12. L' utilisation d' un essai biologique de cellules différentes, la gamme pour GR-BEQ pour les effluents des usines de traitement des eaux usées au Japon était plus faible (<78 ng à 3 Dex / L) que ceux rapportés pour l' effluent secondaire dans la présente étude 22. A l'exception de l'échantillon d'eau de surface unique qui a enregistré une réponse GR maximale de 30 ng Dex / L (tableau 2, l' échantillon E), l'activité de GR dans les échantillons d'eau de surface restantes était compatible avec la faible activité signalée pour la surface néerlandaise eaux 21 . Cependant, l'environnement impacte pour les produits chimiques actifs GR est moins bien caractérisée que pour ER produits chimiques actifs 26, ce qui rend l' évaluation du potentiel pour les effets d'ordre supérieur un défi.
Comme avec l'analyse chimique classique, l'adhésion aux protocoles écrits et la validation des mesures à l'aide d'une QA basée sur la performance / QC approche maximise la qualité des données et la robustesse. Bien que la validation des essais biologiques cellulaires adaptées à l' évaluation de la qualité de l' eau continuera d'évoluer et d' améliorer, la mesure des paramètres d' AQ / CQ premier décrites dans Mehinto et al. 14 et appliqués à cette étude a montré que nos résultats étaient bien en deçà des valeurs guides préétablies (tableau 1 ). Les paramètres de la courbe d'étalonnage pour ces essais biologiques sont identiques à celles utilisées pour l' étalonnage d' autres protocoles d' analyse (par exemple, GC-MS), avec l'ajout de critères permettant d' évaluer la viabilité des cellules (par exemple, la cytotoxicité) qui représente la différence principale. une autre opérationnelledifférence rendue possible en utilisant des cellules dans un format à haut débit est l'inclusion de multiples dilutions d'échantillons qui illustrent la réponse dépendant de la concentration attendue lors de la bioactivité est mesurée (Figure. 2). En examinant les mesures d'échantillons, l'ER inférieure et réponses GR pour l'effluent tertiaire (échantillon D) par rapport aux trois échantillons d' effluents secondaires (AC) fournit une preuve supplémentaire de la précision relative de nos résultats du dépistage de biodosage dans le tableau 2. Incorporation de contrôle ou échantillons de référence qui représentent la matrice d'intérêt, dans ce cas, l'eau, serait en outre d'améliorer la capacité de comparer les résultats bioessais au sein et en particulier à travers les entités de mesure.
Les réponses des lignées cellulaires ER et GR transactivation utilisés dans cette étude ont été exprimées par rapport à l'activité des agonistes puissants et E2 dexaméthasone, respectivement. Ceci permet une estimation quantitative de la bioactivité a exprimé unesa bioessai Concentration équivalente (BEQ). Cela permet en outre d'enquête sur les produits chimiques qui contribuent à la réponse du bioessai, à savoir une comparaison directe des BEQ avec des concentrations d'agonistes individuels déterminés par la chimie analytique classique. Ce concept souligne la valeur ajoutée de bioscreening à diriger l'enquête de diagnostic d'agents pathogènes, aussi connu comme l'analyse des effets-dirigés.
Depuis SPE est couramment utilisée pour isoler une large gamme de produits pharmaceutiques et d' autres «contaminants émergents» de l' eau, nous avons utilisé un protocole précédemment publié 9, 20 qui a comporté un sorbant conçu pour capturer des produits chimiques à la fois hydrophiles et hydrophobes dans l' eau. Bien que nous supposons capture quantitative de tous les composés organiques bioactifs en utilisant cette technique, un travail supplémentaire est nécessaire pour normaliser pleinement et valider les performances de ces méthodes d'extraction. Le type d'essai de cellules utilisé dans cette étude peut présenterUne autre limitation. Ces tests mesurent les interactions entre les contaminants et les récepteurs nucléaires et ne prennent pas en compte d'autres interactions possibles, tels que le récepteur chimique-membrane. Ainsi, il est possible que les réponses de criblage mesurées ici ont été sous-estimées. Comme l'extraction de l'échantillon, il n'y a pas de méthodes normalisées pour analyser les données d'analyse des cellules et des approches différentes peuvent produire des résultats différents. La régression linéaire utilisée dans cette étude pour modéliser la réponse pour la moitié inférieure de la courbe d'étalonnage peut ne pas être approprié pour tous les dosages cellulaires, en particulier si la réponse modélisée est prolongée au-delà la gamme relativement étroite spécifiée dans la présente étude. Des recherches supplémentaires sur les questions ci-dessus est nécessaire pour comprendre la mesure dans laquelle ces outils peuvent être utilisés comme un outil de surveillance robuste.
Alors que la majeure partie du travail préparatoire est en cours de mise pour ER et GR comme écrans pour endocriniens actifs, les chercheurs élargissent le champ d'applicationoutils bioanalytiques pour inclure un autre mode pertinent des actions, par exemple, androgenicity, génotoxicité, de neurotoxicité et l' immunotoxicité 9,27. Une boîte à outils plus complet permettra d' améliorer la capacité de dépister les produits chimiques bioactifs, y compris les produits de transformation du / ou des produits chimiques connus et inconnus qui peuvent se produire 28, maintenant et dans l'avenir, dans divers milieux aquatiques 19.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
