Summary
מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.
Introduction
ישנם מעל 70 מיליון כלבים בארה"ב בלבד 1. כמו בני משפחה מוערך, החיות האלה זוכים לעיתים קרובות חיתוך טיפול רפואי קצה. פחות בגלל שהם חולקים הסביבה שלנו, כלבים יכולים לספק תובנות בפתוגנזה וטיפול של מחלות אנושיות 1. עם זאת, אם תרגום תגליות ברפואה אנושית לתוך טיפולים וטרינריים או להיפך, חשוב לאפיין ביסודיות מיני וריאציות אפילו במערכות שמורות ביותר כמו התגובה החיסונית המולדת. דוגמאות של הבדלים בין הכלבים לבין מערכת חיסון מולדת אנושית כוללות ביטוי גבוה CD4 על נויטרופילים כלב 2; בהעדר homolog תפקודית של IPAF חיישן flagellin ציטופלסמית בכלבים 3 ואת הביטוי של הכלאה caspase 1/4 ב טורפים 4.
מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם מרכיבים גילה יחסית לאחרונה של חסינות מולדת 5. הנטס הוא רשתהים של דנ"א, חלבונים גרעיניים ופרטניים פרסמו בתגובת מגוון רחב של גירויים דלקתיים או זיהומיות 6. NET מבנים דמויי הודגמו פני מינים רבים, כולל תרנגולות 7, דגים 8, רכיכות 9 ו acoelomates 10, אבל יש וריאציות מינים. לדוגמה, נויטרופילים murine להגיב לאט יותר לגירויים NETosis מ נויטרופילים אדם, ויוצרים פחות מפוזר 11 נטס. ישנו גוף גדול של עדויות מינים רבים כי רשתות ללכוד חיידקים, ועוד שנויות במחלוקת עשויה להיות מעורבות ישירות להרוג פתוגנים 12,13. עם זאת, רכיבים NET גם לשפר נזק לרקמות, לקדם פקקת ולפעול עצמיים 14,15. האיזון בין ההשפעות החיוביות המזיקות של רשתות עשוי להשתנות בין מחלות שונות ומינים שונים, דבר המצביע חשוב לחקור רשתות הן המין ומצבו של עניין.
הנה אנחנומתאר פרוטוקול פשוט גרימה ומדידת שחרור נטס על ידי נויטרופילים כלבים. שיטה זו דומה לאלה המשמשים לבודד נויטרופילים 16 ולגרום NETosis במינים אחרים, אך התנאים כגון ריכוז אגוניסט וזמן הדגירה ממוטבים עבור נויטרופילים כלבים. Assay לשחרור DNA כימות NET דומה אף תואר במינים אחרים אבל השיטה המוצגת כאן גם מותאמת במיוחד עבור כלבים 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו עם רשות הרמה האתית טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת איווה סטייט ועדת שימוש.
איסוף דם 1.
- צייר 9 מ"ל של דם מתוך saphenous, וריד כאפאליך או הצוואר ישירות לתוך קרישה (למשל, חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 1.8 מ"ג K 2 EDTA / מ"ל דם) vacutainers, או לתוך מזרק עם העברה מיידית צינורות דם המכיל EDTA. בעדינות לגלגל או להפוך את צינורות הדם כדי להבטיח ערבוב הנאות של דם קרישה אנטי.
2. בידוד נויטרופילים
- בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, לערבב דם עם נפח שווה של dextran-500 טמפרטורה 3% בחדר סטרילי (מורכב מלוחים סטרילי 0.9%) על ידי היפוך עדין. השאירו עומד זקוף עבור 18-20 דקות בטמפרטורת החדר. מעביר את השכבה העליונה בצבע הקש לצינור טרי עד שהוא כבר לא יכול להיות שנאסף ללא זיהום על ידי שכבת האדום התחתונה. אריתרוציטים ב היכול להיות מושלך דואר צינור מקורי.
- צנטריפוגה supernatant XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 °. צייר ותשאיר supernatant. באופן ידני מחדש להשעות את התא גלולה ב בופר פוספט סטרילי בטמפרטורה 10 מ"ל חדר (PBS). שים לב vortexing לא אמור לשמש מחדש להשעות נויטרופילים בכל שלב של פרוטוקול זה. ידני ציור off, ולא ניגר supernatants מומלץ גם ברחבי הפרוטוקול כדי למקסם תשואת תא.
- הוסף 10 מ"ל של פתרון ההפרדה תא בטמפרטורת החדר polysucrose ונתרן diatrizoate (למשל, Histopaque 1077) כדי צינור חרוטי 50 מ"ל. בזהירות שכבת פתרון התא המכיל מעל פתרון הפרדת תא. שים לב פתרון הפרדת תא באמצעות אשר לא equilibrated לטמפרטורת חדר עשוי להפחית תשואת תא.
- צנטריפוגה XG ב 300 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם משם.
- כפי נויטרופילים הם בשכבה הנמוכה ביותר של שיפוע, לצייר את וזורקים upper 3 שכבות, מורכב שכבה עליונה של פלזמה וטסיות, סרט לבן דק של תאי mononuclear ושכבה ברורה של מדיום שיפוע צפיפות.
- כדי lyse כל אריתרוציטים הנותרים, מחדש להשעות את הגלולה נויטרופילים 10 מ"ל מים בטמפרטורת החדר.
- לאחר 30 שניות, לשחזר טוניות על ידי הוספת 10 מ"ל של נתרן כלורי 1.8% טמפרטורה סטרילי בחדר ומערבבים על ידי היפוך עדין.
- צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. צייר את supernatant וזורקים.
- אם הגלולה היא עדיין אדומה, לחזור על שלב תמוגה. אם הגלולה היא לבנה (או אם תמוגה היום כבר פעמים), בעדינות מחדש להשעות תאים 10 מיליליטר של PBS סטרילית.
- ספירת תאים באמצעות מונה אוטומטי או hemocytometer. תשואות אופייניות הן לפחות 10 6 תאים לכל מיליליטר של דם.
- צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. צייר את supernatant וזורקים.
- מחדש להשעות תאים לריכוז הרצוי ב PBS בטמפרטורת חדר סטרילי. For את assay לשחרור DNA כמתואר בסעיף 2, resuspend ב 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- אם תרצה, להעביר נפח קטן של תאים ישירות או באמצעות cytocentrifuge לשקופית זכוכית. אפשר תאים להתייבש כתם באמצעות ערכת קיבעון והכתים מהירה פי מייצר 'הוראות. אם בידוד נויטרופילים הצליח, כאשר בחן במיקרוסקופ לפחות 95% של תאי בעלי גרעין צריכים להיות גרנולוציטים (נויטרופילים, בזופילים, אאוזינופילים) עם זיהום כדורי מינימאלי.
3. DNA שחרור Assay
- הגדרת assay לשחרור DNA מיד לאחר בידוד נויטרופילים.
- אם clumping התא נמצא בבדיקה של פתרון המניות על ידי מיקרוסקופ אור, להעביר את ההשעיה תא דרך פילטר סטרילי 70 מיקרומטר סטרילי מיד לפני הגדרת assay.
- זה טוב במבחן צלחת גם 96 סטרילי, להוסיף 5 x 10 4 תאים / טוב; אגוניסט ו תזכיר פארק רוזוולריאל מכון-1640 (RPMI) בינוני ללא פנול אדום בתוספת 0.5% חום מומת העובר עגל בסרום לנפח סופי של 100-200 μl. לכלול לפחות שתי בארות ריקות לכל אגוניסט כשהפתרון המניות נויטרופילים מוחלף נפח שווה של PBS. שים לב להגדרת בארות ריקות עבור כל אגוניסט חשוב פוסלי זיהום הדנ"א של אגוניסט או הפרעה באמצעות אגוניסט עם assay הקרינה.
- לדגור על 39 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך פחמן דו חמצני חממה (4%).
- הוספת אגוניסטים בריכוזים רצויים לבין צבע חומצות גרעין תא חדיר. הערת הריכוז האופטימלי של צבע התא חדיר ינוע בין צבעי חומצות גרעין שונים. שולטת ללא מגורה שבו אגוניסטים מוחלפים נפח שווה של התקשורת צריכה להיכלל בכל ניסוי.
הערה: רצוי לדלל אגוניסטים בנפחים דומים של מדיום התרבות כדי לשמור על תנאים עקביים בין בארות. כרכים היטב סופי של 200 &# 181; l שמש בהצלחה ואם זה משתנה, גם הכרכים צריכים להישאר זהים לכל התנאים. Phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) (הריכוז הסופי ≥0.1 מיקרומטר) או גורם הפעלת טסיות (PAF) (הריכוז הסופי ≥31 מיקרומטר) יכול לשמש שולטת חיובית. אגוניסטים יש למדוד לפחות בשני עותקים. - לדגור על C ° 39. מדוד הקרינה באמצעות קורא microplate לאחר 2 שעות או במרווחים הרצויים. שים לב מרווחי זמן אופטימלי ישתנו בהתאם אגוניסטים בשימוש.
הערה: אורך הגל יהיה תלוי לצבוע מועסקים. - פחת קרינה ריקה לפני חישוב קרינה ממוצעת.
- כדי לאפשר השוואה בין פרט לפרט ובין צלחות, לחשב שינוי לקפל קרינה על ידי חלוקת הקרינה הממוצעת של בארות מגורות על ידי הקרינה הממוצעת של בארות שאינן מגורה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בפרוטוקול זה, לא אמור להיות שינוי לקפל חזק קרינה לאחר הגירוי נויטרופילים עם הבקרות החיוביות, PMA ו PAF. כמו באיור 1B, גירוי של נויטרופילים כלבים עם 31 מיקרומטר PAF עבור 1 תוצאות hr לעלייה 4.0 פי ממוצע הקרינה לעומת תאים שאינם מגורה (טווח 2.0-5.8, n = 5 כלבים) 18. PMA ברמה של 0.1 מיקרומטר (איור 1 א) היא אגוניסט איטי שאינו לגרום לעליית הקרינה עד שעה 2 אבל בסופו של דבר מייצרת גידול של פי דומה קרינה (ממוצע: 3.3, טווח 1.36-5.4, n = 5 כלבים) 18. למרות קינטיקה האיטי שלה, יש יתרונות PMA כביקורת חיובית: הוא זול יחסית לעומת ריכוזים גבוהים של PAF וזה כבר בשימוש נרחב בעכברים ומחקרי אדם.
קרינה של צבעי חומצות גרעין אינה specific להיווצרות NET כפי שהוא גם יתרחש אם יש מוות של תאים על ידי מנגנונים אחרים או אם ריאגנטים הם מזוהמים DNA. כפי שניתן לראות בתרשים 2, הכנת LPS מסחרית מיוצר קרינה גבוהה מאוד בהעדר נויטרופילים, ככל הנראה בשל זיהום עם ה- DNA חיידקים. אישור היווצרות NET באמצעות שיטות אחרות כגון immunofluorescence מומלץ.
איור 1: PMA קרינת עליית PAF של צבע חומצת אטומת תא גרעין עם קינטיקה שונה נויטרופילים היו מגורה עם 0.1 מיקרומטר PMA (א) או 31 מיקרומטר PAF (B) בנוכחות של צבע חומצות גרעין אטום התא.. הקרינה נמדדה במרווחים לשעה והשינוי של פי קרינה של תאים מגורים לעומת תאים שאינם מגורים מחושבים. גידול קרינהד משמעותי בין 1 ל 2 שעות עבור PMA (מדידות חוזרות ANOVA חד כיווני ואחריו חולצת בדיקות מרובות עם תיקון של Bonferroni, p המתואם ריבוי = 0.04; הסורגים שגיאה ממוצע ± סטיית התקן עבור 5 אנשים) אבל כבר plateaued עבור PAF ידי 1 hr. נתון זה יש הבדל בין ג'פרי U, et al נטס יצוק גם כלבים:. מלכודות תאי נויטרופילים לכלבים בבריאות ואנמיה המוליטית בתיווך החיסונית. וטרינרית אימונולוגיה Immunopathology, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: בארות בלנק חשובות כדי לשלול זיהום הדנ"א או הפרעה באמצעות אגוניסט מקור מסחרי של LPS.התווסף בארות acellular המכיל RPMI. שינוי לקפל גדול קרינה לעומת בארות המכילות נויטרופילים הלא מגורה מרמז זיהום של אגוניסט עם DNA חיידקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
את assay לשחרור DNA שהוצג הוא assay לכימות בקלות עבור DNA התאי. השיטה הותאמה מן בטכניקות דומות המשמשות להערכת היווצרות NET במינים אחרים, אך במהירויות צנטריפוגה, ריכוזי אגוניסט ושעות דגירה שונו כדי לייעל את השיטה לשימוש עם נויטרופילים כלבי 8,17,18. התאמות דומות יכולות להיעשות כדי להתאים את השיטה עבור מינים אחרים. Assay הוא פשוט ולא יקר בהשוואה לשיטות אחרות למדידת NETosis כגון cytometry זרימה או ניתוח תמונה. השיטה גם אינה דורשת נוגדנים כנגד מרכיבי NET, כך הוא אידיאלי לשימוש בכלבים שעבורם מיוצרים באופן מסחרי, תוקף מינים-reactive נוגדנים הם לעתים קרובות זמינים.
המגבלה העיקרית של השיטה היא חוסר הספציפיות של צבעי חומצות גרעין-חדיר תא להיווצרות NET. צבעים אלה גם להזין תאים מתים וגוססים, DNA לאגד לזרוח. לכן, fluorescence אינו ספציפי עבור היווצרות NET. שימוש בטכניקות אחרות (למשל, immunofluorescence) במקביל assay כמוני חזותי לאשר אגוניסטים הם גרימת היווצרות NET ולא צורות אחרות של מוות של תאים מומלץ בחום. Assay יכול גם פוטנציאל לשמש assay הקרנה כללי על מוות של תאים, למשל כאמצעי לכימות cytotoxicity vivo לשעבר.
הפרוטוקול הוא פשוט, אך ישנם צעדים קריטיים דרושים כדי להבטיח הצלחה. ראשית, כאמור בפרוטוקול, כדי למנוע אובדן תא מופרז במהלך הבידוד נויטרופילים חשוב supernatants נמשך מעל עם טפטף ולא מושלך על ידי היפוך צינורות. שנית, הצלחה של assay מסתמכת על תאי שליטה הלא מגורה שנותרו למדינה בת קיימא ולנוח במשך הדגירה. נויטרופילים יכול להיות מופעל בכל שלב במהלך הפרוטוקול כך תשומת לב קפדנית צריך להיות משולם על t איסוף דם atraumaticechnique והימנעות הטיפול הטראומטי (למשל, vortexing) במהלך הבידוד נויטרופילים. כמו כן, חשוב לזכור כי יש נויטרופילים אורך חיים מוגבל ולכן העיכוב לבודד תאים או בהקמת assay יש להימנע 19. אם דגירה ממושכת עם אגוניסטים הוא ניסה, כדאיות של תאים שאינם מגורה במהלך תקופת זמן זו חייבת להיות מאושרת.
כפי שניתן לראות בתרשים 1, יש הבדלים ניכרים בין כלבים בתגובתם אגוניסטים NET. עם זאת, assay צריך להיות עקבי למדי בין משכפל מאותו החיה, עם וריאצית תוך assay של 9% על בסיס 10 כפילויות 18. אם יש וריאציות גדולות בין המשכפל, clumping התא אחראי סביר. אמצעים להקלת clumping התא כוללים שמירת תאי PBS ולא סידן המכיל חיץ לפני הקמת assay DNA, בטיפול תאי בעדינות לאורך בידוד, וסינון מניות התאהשעיה לפני תאי ציפוי.
אם השלבים הללו הם אחריו, פרוטוקול זה מאפשר כימות של היווצרות NET בתגובה למגוון רחב של תנאים אגוניסטים הניסיונות. מחקרים כאלה יכולים להעמיק את ההבנה שלנו של התפקיד של רשתות בבריאות ובחולי כלבים. לדוגמה, טכניקה זו מאפשרת השוואה של שחרור NET בין כלבים בריאים ואלה עם מחלות אימונוסופרסיבי או אוטואימונית בה NETosis עלולה להיפגע או משופרת. לחלופין, בשילוב עם טכניקות אחרות כגון immunofluorescence, assay יכול לשמש כדי לזהות אגוניסטים רומן מסוגל גרימת NETosis ומעכבי הרומן של NETosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
